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방법 논문

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

18.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52589

⸱

2016년 4월 20일

 ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Boston Children's Hospital, Division of Gastroenterology, Harvard Medical School, 3Humanitas Clinical and Research Center

이 논문에서

요약

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

초록

피부는 외부 환경과 상호 작용하는 장벽 기관입니다. 잠재적인 미생물 침입에 지속적으로 노출되는 진피와 표피는 항상성 및 염증성 상태 모두에서 다양한 면역 세포의 보금자리입니다. 따라서 세포형광 분석을 위한 피부 세포 방출을 얻는 도구는 피부에 존재하는 면역 세포의 복잡한 네트워크와 미생물 자극에 대한 면역 세포의 반응을 연구하는 데 매우 유용합니다. 여기에서는 단일 세포 현탁액을 빠르고 효율적으로 얻기 위해 마우스 피부를 소화하는 효율적인 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 표면 항원 발현을 손상시키지 않으면서 최대 세포 생존율을 유지할 수 있습니다. 또한 귀, 몸통, 꼬리, 발바닥과 같은 다양한 해부학적 위치에서 피부 샘플을 채취하고 소화하는 방법에 대해서도 설명합니다. 그런 다음 얻어진 현탁액을 염색하고 유세포 분석법으로 분석하여 서로 다른 백혈구 집단을 구별합니다.

서론

피부는 신체에서 가장 큰 기관 중 하나이며 넓은 표면은 외부 환경에 지속적으로 노출됩니다. 따라서 피부는 물리적 수단과 잠재적인 병원체 침입에 대한 적극적인 보호를 제공함으로써 항상성을 유지하기 위해 잠재적인 위협으로부터 유기체를 보호해야 합니다. 장 및 폐 점막과 유사한 방식으로, 피부에는 면역 감시를 유지하기 위해 상피와 지속적으로 상호 작용하는 다양한 면역 세포가 있습니다. 피부의 면역 세포와 비면역 세포를 모두 포함하는 이 복잡한 시스템은 1978년 이러한 복잡성을 설명하기 위해 "피부 관련 림프 조직"(SALT) 1이라는 용어가 처음 만들어지면서 면역학의 초창기부터 인정되어 왔습니다.

피부에 존재하는 많은 수의 면역 세포는 유기체가 잠재적인 침입에 맞서 싸울 뿐만 아니라 상처 치유를 조정하고 자가 항원과 피부 미생물군에 대한 내성을 유지하는 데 도움이 됩니다 2,3.

피부 상주 면역 세포 중 수지상 세포(DC)는 면역 반응을 형성하고 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 4. 진피 DC와 랑게르한스 세포는 병원체의 침입에 쉽게 반응하며, 림프절로 이동할 때 T 세포를 활성화하고 새로 생성된 효과기 T 세포에서 피부 유도 수용체의 발현을 유도합니다 5. DC는 또한 피부 항상성을 조절하는 데 근본적인 역할을 합니다. 항상성 상태에서 진피에서 림프절로 이동하는 DC는 주로 피부 항원에 특이적인 조절 T 세포(Tregs)의 분화를 통해 T 세포 내성을 유도할 목적으로 피부 격리 항원을 운반합니다 6-8.

T 세포는 피부에서 가장 풍부한 면역 세포 집단을 나타냅니다. 감염 중에 피부에 침투할 뿐만 아니라 피부 상주 림프구 중에서 안정적인 개체군을 나타냅니다 9,10. CD8+ 및 CD4+ 상주 기억(rm)T 세포는 모두 피부에 상주하며, 감염 후 혈액에서 effector T 세포가 모집되기 훨씬 전에 반응할 수 있습니다. 피부에는 피부 항원 및 조직 항상성에 대한 내성을 유지할 수 있는 조직 상주 Tregs의 개체군도 존재합니다. 이 세포는 동족 항원에 노출 된 후 빠르고 강력하게 활성화되므로 메모리 Tregs 11,12로 정의되었습니다.

DC 및 T 세포와 함께 NK 세포, 감마 델타 T 세포, 그룹 2 ILC 13, 비만 세포 및 대식세포와 같은 많은 선천성 면역 세포가 피부에 서식하여 숙주 보호에 기여합니다. 이러한 복잡한 환경을 분석하기 위해서는 피부 표본에서 높은 효율로 단일 세포 현탁액을 얻는 동시에 유세포 형광 분석 또는 분류를 위한 표면 마커의 발현을 보존해야 합니다.

쥐 피부는 주로 각질세포, 랑게르한스 세포 및 수지상 표피 T 세포로 구성된 외부 표피층을 나타내며, 그 아래의 진피층도 있습니다. 진피는 대부분의 면역 세포가 서식하며 콜라겐 섬유, 특히 콜라겐-I과 콜라겐-IV가 가장 풍부한 세포 외 기질에 의해 만들어집니다. 인간의 피부와 달리 쥐의 피부는 털로 덮여 있어 모낭이 더 많습니다. 또한 인간의 피부보다 훨씬 얇고 상처 치유에 도움이 되는 근육층인 panniculus carnosus를 함유하고 있습니다 14. 이러한 특성으로 인해 면역 세포를 빼내기 위해 진피의 콜라겐 그물을 효율적으로 파괴하는 것이 더 어려워집니다.

이 논문에서는 고순도 콜라겐분해효소 1 및 2와 열분해효소의 칵테일에 의존하는 세포외 기질을 소화하기 위한 적절한 방법을 제공합니다. 또한 다른 영역의 피부를 분석하려면 다른 실험 절차가 필요하기 때문에 발바닥, 꼬리, 귀 및 몸통에서 피부 샘플을 효율적으로 얻을 수 있는 다양한 방법을 보여줄 것입니다. 그런 다음 DC(MHCII+CD11c+CD45+), 대식세포(CD11b+F4/80+CD45+), CD8+ 및 CD4+ T 세포의 존재를 평가하기 위해 샘플에 레이블을 지정합니다.

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프로토콜

연구 승인 : 실험 프로토콜은 Decreto에​​ 따라 건강의 이탈리아 교육부 (로마, 이탈리아)의 승인을 하였다는 N, 27 gennaio 1992 legislativo. (116) "Attuazione 델라 Direttiva N. 609분의 86 / CEE의 본초 디 protezione 글리 animali utilizzati 피니 sperimentali 오 광고 altri 피니 scientifici."

1. 피부 샘플을 얻기

  1. 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사.
  2. 귀:
    1. 마우스의 귀 털이없는 부분을 잘라.
    2. 집게로 떨어져 당겨 분리 지느러미와 복부 측면. 부드럽게 집게로 귀 안쪽 부분을 긁어로 남아있는 연골을 제거합니다.
  3. 트렁크 피부 :
    1. 전기 면도기와 섬세한 제모 로션 두 동물의 전체 피부를 면도.
    2. (2cm 2의 전체 동물의 피부까지) 원하는 피부 샘플을 잘라.
      1. 전체 지느러미를 절단하는 경우와 VENTRAL 마우스 피부는 다시 다음 마우스 본체 주변의 면도 영역의 국경을 따라 절단 한 마우스의 중앙에 수직 절단을합니다.
      2. 조심스럽게 수술 가위 나 메스의 폐쇄 라운드 예리하게 팁을 피부 샘플을 분리하면서 집게로 여전히 피부 샘플을 유지, 복막 다시 근육으로부터 피부를 분리합니다.
    3. 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하는 100mm 세포 배양 플레이트를 준비한다.
    4. 단계 1.3.3에서 제조 한 접시에 PBS의 피부 샘플을 침수와 집게로 피부 샘플을 긁어하여 피하 지방을 제거합니다.
  4. 꼬리:
    1. 마우스의 꼬리를 잘라.
    2. 수술 용 가위 외과 메스, 꼬리베이스에서 시작하여 꼬리의 끝 부분에 도달와 꼬리에 수직 절단합니다.
    3. 꼬리으로부터 피부를 분리 집게를 사용합니다. 꼬리의 기지에서 절단의 가장자리를 잡고하고 채 끝을 향해 조심스럽게 잡아 당겨집게와 꼬리의 몸.
    4. 부드럽게 피부 샘플을 긁어에 의해 어떤 여분의 지방을 제거합니다.
  5. 노상 강도
    1. 수술 가위로 전체 마우스 발을 잘라. 모든 털이 피부를 절단 방지.
    2. 숫자의 시작 발목에서 길이 방향 다리의 피부를 잘라.
    3. 집게로 피부를 잡는 동안 집게 또는 손으로 발목 뼈를 잡고 장갑을 벗고 것처럼 자리를 향해 피부를 잡아 당깁니다.

2. 소화

  1. 효소 믹스 (사양 재료 목록 참조) 300 μg의 / ㎖, DNAse1 50 U / ㎖ 다음 레시피 (재료 목록에서와 같이 제조) 원액에서 소화 칵테일을 준비합니다. RPMI 5 % FBS에 희석.
  2. (트렁크 피부 : 피부의이 소화 칵테일 ml의 모든 2cm 2, 최대 3 ㎖ 총) 소화 칵테일 2 ㎖와 35mm 페트리 접시에 작은 조각으로 가위로 피부 샘플을 잘라.
  3. 90 분 동안 37 ° C에서 품어. 조심스럽게 배양시 배양 접시를 1-2 번 흔들어.
  4. RPMI1640 5 % FBS 1 ㎖를 함유하는 66mm 페트리 접시에서 70 μm의 셀 스트레이너에 소화 된 피부 샘플을 붓는다.
  5. RPMI 1640 5 % FBS의 5 ㎖로 스트레이너 씻으십시오.
  6. 주사기 플런저 셀 스트레이너를 통해 샘플을 짠다.
  7. 세척 플런저, 페트리 접시와 RPMI1640 5 % FBS 20 ㎖와 스트레이너, 50 ㎖ 튜브에 전송할 수 있습니다.

3. 항체 및 라벨링

  1. PBS 1 % FBS (또는 BSA)을 5 ml로 두 번 얻어진 현탁액을 씻으십시오.
  2. 원하는 항체 얻어진 세포 현탁액 레이블.
    1. 100 μL에 재현 탁 샘플 / PBS 1 % FBS에 희석 aCD16 / CD32 (클론 2.4G2) 2 ㎍ / ml를 함유하는 혼합물의 샘플.
    2. Fc 수용체를 통해 원하는 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 4 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션.
    3. 표에 표시된 항체를 추가1.
      1. 4 μg / ml의 농도 PBS, 1 % FBS 100 ㎕ / 샘플의 원하는 항체를 희석 혼합하여 준비한다.
      2. 튜브에서 2 μg / ML의 최종 농도로 항체 혼합물의 200 μL의 부피가되도록 각 시료에 3.2.3.1 단계에서 제조 된 혼합물 100 ㎕를 추가한다.
    4. 4 ° C에서 30 분 동안 품어 빛에서 다룹니다.
  3. 400 XG에서 5 분 동안 PBS 1 % FBS 1 ㎖, 원심 분리로 세척 PBS 1 % FBS 300 μL의 상층 액과에 resuspend 폐기합니다.
  4. 2 μg / ML의 최종 농도에서 DAPI를 추가하고 10 분 동안 빛으로부터 보호, 4 ° C에서 배양한다.
  5. FACS에 의해 얻어진 샘플을 분석 할 수 있습니다.
    1. 백혈구를 분리하기 위해, 다음 게이팅 전략을 사용
      1. 먼저 DAPI- 인구에 게이팅에 의해 죽은 세포를 제거한다.
      2. 그림 1에 나타낸 바와 같이, FSC의 W 플롯 대 FSC-A에서 선택 단봉 .
      3. 게이트 주목 백혈구의 전형적인 크기와 입도에 기초하여 상기 셀.
      4. 그림 1에 나타낸 바와 같이 FSC-A CD45 플롯에서 CD45 + 세포를 선택합니다.
    2. 다음과 같이 표면 마커의 발현에 의해 백혈구의 다양한 인구를 구별 :
      1. 중 CD11c + MHC II + 세포로 수지상 세포를 식별합니다. 이들은 나중에 CD207- 피부 수지상에서 랑게르한스 세포 및 피부 CD207 + 수지상 세포를 구별하는 CD207의 발현에 대해 분석 할 수있다.
      2. CD64 + F4 / 80 + 세포로서 대 식세포를 식별합니다.
      3. CD19 + MHCII + 세포와 같은 B 세포를 식별합니다.
      4. CD8 + 또는 CD4 + 세포와 같은 T 세포를 식별합니다.

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결과

신체의 다른 부위에서 피부 표시된 항체와 설명 및 스테인드 프로토콜에 따라 소화했다. 게이팅 전략은 먼저 단봉 (FSC-W 대 FSC-A)와 림프구의 형태 (SSC-A 대 FSC-A)와 세포에서 방송 한 다음 세포 (DAPI- 세포), 게이트를 선택 그림 1에 도시되어있다. 표시 할 때, 조혈 원점에서 CD45 + 세포가 선택됩니다.

DC가이 항 중 CD11c, -MHCII 및 -CD45 항체로 표시되어, 대 식세포가로 식별됩니다 F4 / 80 + CD64 + CD45 + 세포, CD19 + CD45 + MHCII + 세포와 같은 B 세포, CD4 + CD45와 같은 CD4 ...

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토론

우리는 다른 마우스 피부 영역에서 단일 세포 현탁액을 제조하는 방법을 설명 하였다. 우리가 채택 소화 방법은 높은 수율을 제공하지만, 또한 다음 FACS 분석을 위해 근본적인 표면 마커의 발현을 유지 아닙니다.

콜라게나 제 I 및 II와 써모의 칵테일의 사용은,이 방법은 재현성이 높은 만드는 효소 활성의 배치의 차이에 최소 배치를 보장합니다. 다른 공개 방법은 다른 효소 칵테일에 의존하지만, 우리 손에 그들은, 더 중요한 것은, 적은 재현 낮은 금리를 제공합니다. 우리의 방법은, 그러나, 표피를 채우는 세포 진피를 채우는 세포를 구별하지 않는다. 많은 경우에이 두 개의 서로 다른 구획을 구분하는 것이 유용 할 수 있기 때문에, 우리는 방법을 사용하여 이러한 이전 작품에 독자를 지시. (15)

우리의 경험 피부 샘플에서귀와 꼬리들 피하 기름 층이 완전히 효소 칵테일로 진피에 액세스 할 수 있도록하기 위해 스...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), Fondazione Cariplo (보조금 2010-0678 및 NANOVAC) 및 Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
보충 RPMI 1640 medium RPMI1640 L-glu, 펜-스트렙 w/o 베타 메르캅토 에탄올
PBS FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)Roche5401119001resuspend [2.5  mg/ml](dH2O); -20 에 부분 표본 저장; &데그; C
Dnase I시그마 D4263-1VLRPMI 1640 w/o serum [1,000  U/ml]
Materials
Surgical Scissors
수술용 집게
수술용 메스
35mm 페트리 접시
66mm 페트리 접시
100mm 페트리 접시
70 &마이크로; m 세포 스트레이너BD352350
Digestion cocktailRPMI 5% FBS
LIberase TM300 µ에 희석; g/ml
DNAse150 U/ml
항체
NameCompanyCloneLabel
aCD45.2104PE-Cy5.5
aCD11cN418PE-Cy7
CD11bM1/70FITC
F4/80A 3-1APC-Cy7
aCD4Gk1.5APC-Cy7
aCD853-6.7PE
aCD64X54-5/7.1PE-Cy7
aCD2074C7APC

참고문헌

  1. Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
  2. Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).
  3. Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
  4. Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
  5. Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
  6. Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
  7. Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
  8. Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
  9. Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
  10. Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
  11. Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
  12. Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
  13. Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
  14. Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
  15. Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
  16. Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).

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