다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

요약

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

초록

피부는 외부 환경과 상호 작용하는 장벽 기관입니다. 잠재적인 미생물 침입에 지속적으로 노출되는 진피와 표피는 항상성 및 염증성 상태 모두에서 다양한 면역 세포의 보금자리입니다. 따라서 세포형광 분석을 위한 피부 세포 방출을 얻는 도구는 피부에 존재하는 면역 세포의 복잡한 네트워크와 미생물 자극에 대한 면역 세포의 반응을 연구하는 데 매우 유용합니다. 여기에서는 단일 세포 현탁액을 빠르고 효율적으로 얻기 위해 마우스 피부를 소화하는 효율적인 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 표면 항원 발현을 손상시키지 않으면서 최대 세포 생존율을 유지할 수 있습니다. 또한 귀, 몸통, 꼬리, 발바닥과 같은 다양한 해부학적 위치에서 피부 샘플을 채취하고 소화하는 방법에 대해서도 설명합니다. 그런 다음 얻어진 현탁액을 염색하고 유세포 분석법으로 분석하여 서로 다른 백혈구 집단을 구별합니다.

서론

피부는 신체에서 가장 큰 기관 중 하나이며 넓은 표면은 외부 환경에 지속적으로 노출됩니다. 따라서 피부는 물리적 수단과 잠재적인 병원체 침입에 대한 적극적인 보호를 제공함으로써 항상성을 유지하기 위해 잠재적인 위협으로부터 유기체를 보호해야 합니다. 장 및 폐 점막과 유사한 방식으로, 피부에는 면역 감시를 유지하기 위해 상피와 지속적으로 상호 작용하는 다양한 면역 세포가 있습니다. 피부의 면역 세포와 비면역 세포를 모두 포함하는 이 복잡한 시스템은 1978년 이러한 복잡성을 설명하기 위해 "피부 관련 림프 조직"(SALT) ¹이라는 용어가 처음 만들어지면서 면역학의 초창기부터 인정되어 왔습니다.

피부에 존재하는 많은 수의 면역 세포는 유기체가 잠재적인 침입에 맞서 싸울 뿐만 아니라 상처 치유를 조정하고 자가 항원과 피부 미생물군에 대한 내성을 유지하는 데 도움이 됩니다 ^2,3.

피부 상주 면역 세포 중 수지상 세포(DC)는 면역 반응을 형성하고 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 ⁴. 진피 DC와 랑게르한스 세포는 병원체의 침입에 쉽게 반응하며, 림프절로 이동할 때 T 세포를 활성화하고 새로 생성된 효과기 T 세포에서 피부 ....

프로토콜

연구 승인 : 실험 프로토콜은 Decreto에​​ 따라 건강의 이탈리아 교육부 (로마, 이탈리아)의 승인을 하였다는 N, 27 gennaio 1992 legislativo. (116) "Attuazione 델라 Direttiva N. 609분의 86 / CEE의 본초 디 protezione 글리 animali utilizzati 피니 sperimentali 오 광고 altri 피니 scientifici."

1. 피부 샘플을 얻기

1. 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사.
2. 귀:
   1. 마우스의 귀 털이없는 부분을 잘라.
   2. 집게로 떨어져 당겨 분리 지느러미와 복부 측면. 부드럽게 집게로 귀 안쪽 부분을 긁어로 남아있는 연골을 제거합니다.
3. 트렁크 피부 :
   1. 전기 면도기와 섬세한 제모 로션 두 동물의 전체 피부를 면도.
   2. (2cm ^2의 전체 동물의 피부까지) 원하는 피부 샘플을 잘라.
      1. 전체 지느러미를 절단하는 경우와 VENTRAL 마우스 피부는 다시 다음 마우스 본체 주변의 면도 영역의 국경을 따라 절단 한 마우스의 중앙에 수직 절단을합니다.
      2. 조심스럽게 수술 가위 나 메스의....

결과

신체의 다른 부위에서 피부 표시된 항체와 설명 및 스테인드 프로토콜에 따라 소화했다. 게이팅 전략은 먼저 단봉 (FSC-W 대 FSC-A)와 림프구의 형태 (SSC-A 대 FSC-A)와 세포에서 방송 한 다음 세포 (DAPI- 세포), 게이트를 선택 그림 1에 도시되어있다. 표시 할 때, 조혈 원점에서 CD45 ^{+ 세포가} 선택됩니다.

DC가이 항 중 CD11c, -MHCII 및 -CD45 항체로 표시되어, 대 식세포가로 식별됩니다 F4 / 80 ⁺ CD64 ⁺ CD45 ⁺ 세포, CD19 ⁺ CD45 ⁺ MHCII ⁺ 세포와 같은 B 세포, CD4 ⁺ CD45와 같은 CD4 .......

토론

우리는 다른 마우스 피부 영역에서 단일 세포 현탁액을 제조하는 방법을 설명 하였다. 우리가 채택 소화 방법은 높은 수율을 제공하지만, 또한 다음 FACS 분석을 위해 근본적인 표면 마커의 발현을 유지 아닙니다.

콜라게나 제 I 및 II와 써모의 칵테일의 사용은,이 방법은 재현성이 높은 만드는 효소 활성의 배치의 차이에 최소 배치를 보장합니다. 다른 공개 방법은 다른 효소 칵테일에 의존하지만, 우리 손에 그들은, 더 중요한 것은, 적은 재현 낮은 금리를 제공합니다. 우리의 방법은, 그러나, 표피를 채우는 세포 진피를 채우는 세포를 구별하지 않는다. 많은 경우에이 두 개의 서로 다른 구획을 구분하는 것이 유용 할 수 있기 때문에, 우리는 방법을 사용하여 이러한 이전 작품에 독자를 지시. ⁽¹⁵⁾

우리의 경험 피부 샘플에서귀와 꼬리들 피하 기름 층이 완전히 효소 칵테일로 진피에 액세스 할 수 있도록하기 위해 스.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
보충 RPMI 1640 medium			RPMI1640 L-glu, 펜-스트렙 w/o 베타 메르캅토 에탄올
PBS FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	resuspend [2.5  mg/ml](dH2O); -20 에 부분 표본 저장; &데그; C
Dnase I	시그마	D4263-1VL	RPMI 1640 w/o serum [1,000  U/ml]
Materials
Surgical Scissors
수술용 집게
수술용 메스
35mm 페트리 접시
66mm 페트리 접시
100mm 페트리 접시
70 &마이크로; m 세포 스트레이너	BD	352350
Digestion cocktail			RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 µ에 희석; g/ml
DNAse1			50 U/ml
항체
Name	Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC