방법 논문

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

DOI:

10.3791/52607

⸱

2015년 3월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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간의 면역 세포를 안정적으로 생체 내 고해상도 이미징하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서는 집중 치료 모니터링과 함께 생체 내 다광자 레이저 스캐닝 현미경을 통해 장기간(약 6시간)에 걸쳐 마우스 간에 있는 면역 세포의 이동 및 세포-세포-상호 작용을 연구할 수 있는 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

초록

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부상에 대한 응답으로서 간염은 단핵구, 호중구, T 세포의 서브 세트, B 세포, 자연 살해 (NK) 및 NKT 세포의 구별을 포함한 백혈구 아형의 침입을 수반하는 매우 동적 인 과정이다. 면역 세포의 이동을 모니터링하기위한 생체 내에 간 현미경 인해 시료 전처리 및 고정, 광학 해상도 및 장기 생존 동물에 대한 높은 요구에 특히 도전적이다. 그러나, 염증 과정뿐만 아니라, 셀룰러 상호 작용 연구 역학 잘 염증성 간 질환의 개시, 진행 및 회귀 이해에 중요한 정보를 제공 할 수있다. 따라서, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 방법은 집중 치료와 함께 마이그레이션 및 생체 내에 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)에 의해 오랜 기간 (약 6 시간)을 마우스 간에서 다른 면역 세포의 세포 - 세포 상호 작용을 연구하기 위해 설립되었습니다 모니터링. 이비인후과 "> 제공 방법은 부드러운 준비 및 기관의 최소 섭동과 간의 안정적인 고정을 포함하며, 장기간 생체 내에 촬상 추적을 허용하는, 최대 6 시간의 기간 동안 사실상 광표백 또는 광독성 효과 다색 다 광자 현미경을 사용하여 마우스 중요한 매개 변수와 순환, 온도, 가스 교환의 안정화의 광범위한 모니터링에 의한 안정적인 영상 조건, 특정 백혈구 하위 집합.

CXCR6.gfp 간염시 림프구 마이그레이션을 조사하기 위해 넉 - 생쥐 기준선 조건 하에서 사염화탄소 복강 내 주사 발 CCL (4)에 의해 유도되는 급성 및 만성 간 손상 후 생체 내에 간 촬상을 실시한다.

천연 킬러 (NK) - - 또한 그러한 CD4 T 세포로서 T 림프구 서브 세트했지만 점막 associ CXCR6 주로 자연 살해 T (NKT)에 림프구상에서 발현 케모카인 수용체이며ated의 불변 (MAIT) T 세포 하나. 간 손상에 따라 자신의 변화된 행동에 대한 상세한 통찰력과 질병의 진행에 따라서 잠재적 인 참여를 허용 CXCR6.gfp + 면역 세포의 이주 패턴과 위치에 따라.

서론

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세포 및 전체 기관의 세포 기능 또는 전체 유기체의 시각화는 본체 (2)의 거의 모든 부분을 포함, 50 년 이상 큰 관심이었다. 따라서 일부 초기 연구는 이미 간 3,4의 생체 내에 이미지를 고용했다. 그러나, 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 간 조직의 장기 안정적인 고해상도 영상에 관한 최신 상태로 존재한다.

다이어프램 인해 위장관 5 밀착 간 해부학 위치로, 미세한 생체 내에 이미징을위한 가장 일반적인 문제는 장관 (6)의 낮은 정도, 연동 운동 호흡 때문이며. 고형 장기에 비해, 간 수술 특히 도전적이다. 때문에 조밀 한 미세 혈관 구조에, 수술 조작, 대규모 출혈성 병변 거주자의 장애 미세 7도 활성화를 이끌 수 있습니까이러한 쿠퍼 세포 (8)과 같은 mmune 세포. 따라서, 조직의 기계적인 고정화 -6,9-가 생체 내에 현미경 이미징에 간섭 가능성이 다른 공표.

건강한 간에서, 총 혈액량 10~15 %가 간 혈관 내에 존재하고, 기관은 순환의 변화 (예를 들면, 혈압 변동에 매우 민감 장기 렌더링 전체 심 박출량 ....

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프로토콜

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참고 : 실험 (NIH 간행물, 8 판, 2011) '관리 및 사용 실험 동물의를위한 안내서'다음 동물 연구에 적용되는 독일 법규에 따라 수행하고, 동물의 보호에 관한 지침 63분의 2,010 / EU 과학적인 목적 (유럽 연합의 공식 저널, 2010)에 사용됩니다. 공식 권한은 정부의 동물 관리 및 사용 사무실 (LANUV 노르 트라 인베스트 팔렌, 레 클링 하우젠, 독일)에서 수여되었다.

주 : 단기 촬상 생략 할 수있는 단계는 제조 시간을 단축하고 수술 프로토콜을 간단하게 별표 (*)로 표시된다 (예를 들면도 촬영, 3-D 스택 또는 짧은 기간 경과 현미경 스냅). 그러나 필요한 생존 시간이 현저히 감소 될 경우 이미징 또한 광범위한 모니터링 및 제어를 순환시키지 않고 수행 될 수있다.

1. 현미경의 설치 및 사전 수술 준비 (5 ~ 10 마일N)

  1. (현미경, 전력 연구소, 레이저, 전기 패드, 기후 챔버, 웹 캠, 주사기 펌프 장치, 인공 호흡기)에 스위치 시스템.
  2. 1.5 부피 %에 O 2 아이소 플루 란 증기를 공급하고 설정 아이소 플루 란 수준을 연결합니다 (V는 / V), 작은 동물 인공 호....

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결과

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우리의 생체 내에 TPLSM 접근 방식의 유효성을 확인하기 위해, 우리는 생체 내에 TPLSM 이미징에 CXCR6의 GFP / + 마우스를 실시. 마우스를 어느 기준선 대조군으로 방치 또는 급성 간 손상 유도 20 사염화탄소 단일 복강 내 주사 (사염화탄소)을 실시 하였다.

녹색 형광 인해 비디오 시퀀스는 2-5 시간의 기간 동안 수행 한 후, 세포는 시간이 지남에 따라 추적 하였다. 일반적으로 세포의 운동성을 표시하려면 절차를 수행하는 동안 감지 된 모든 트랙이 중첩 이미지 (그림 6A)으로 그려졌다. 기준선 조건 하에서 세포 중심 정맥 향해 간 정현파 따라 장거리 이동을 보였지만, 18 시간 처리 후 사염화탄소 CXCR6 + / GFP 세포는 이미 부분적으로 손상된 움직임 패턴을 나타내었다. 일부 빠르게 움직이는 세포가 여전히 간 정현파에 존재했.......

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토론

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본 연구의 목적은 간 생체 내에 TPLSM 이미징 높은 표준화 안정적이고 재현성있는 방법을 개발하는 것이었다. 일반적으로 생체 내에 이미징은 원점 복귀 및 개발, 항상성과 질병에 다른 백혈구 인구의 상호 작용 다음과 같은 실제 생활 조건에서 세포의 행동에 대한 가치있는 통찰력을 부여하고있다. 그러나, 직접적으로 고형 장기에 비해 간뿐만 아니라 높은 취약성으로 인해 전송되는 호흡기 및 장내 연동 운동에 간 까다로울 해부학 위치가 안정된 장기간 생체 내에 이미징을위한 여러 과제를 부과. 최근 몇 년 동안 쥐에서 많은 실험 연구는 거주자 또는 단핵구 / 대 식세포 30-32, 호중구 (33) 또는 다양한 림프구 아형 (34, 35)을 침투로부터 큰 기여와 함께, 부상 간 28 면역 세포의 침윤의 높은 동적 특성을 계시했다. 그러나, m이러한 데이터의 OST는 엔드 포인트 분석 (예를 들어, 여러 가지 빛깔의이 동물을 희생 한 후 유동 세포.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

감사의 글

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저자는 아헨 대학병원의 중앙 동물 시설에 기술 지원을 제공한 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 독일연구재단(DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57)과 아헨 임상연구학제간센터(IZKF)의 지원을 받았다. 이 작업은 RWTH 아헨 대학교 의과대학 내 아헨 학제간 임상연구센터(IZKF)의 핵심 시설인 "이광자 이미징"의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취제
부프레노르핀Essex Pharma997.00.00진통제, 0.1mg/kg
펜타닐로텍스 메디카충전: 30819
플루오박 마취 시스템하버드 기구34-1030
포도당 5%브라운
ISOFLO (이소플루란 증기) 기화기Eickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9%) NaCl solutionDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%ceva요금: 36217/09
Xylazin 2%medistar요금: 04-03-9338/23
소모품
20 ml 주사기BD Plastipak
250 ml 삼각 플라스크Schott Duran21 226 36
25 ml 비커 2xSchott Duran50-1150
2 ml 주사기BD Plastipak
4-0 Vicryl 봉합사EthiconV7980
Agarose시판
식 Bepanthen Eye 및 코 연고바이엘 바이탈 GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip 디럭스 고온 소작 키트파인 사이언스 도구 Inc.18010-00
면 거즈 면봉Fuhrmann GmbH32014
커버 슬립 24x50 mmROTH1871
Durapore 실크 테이프3M1538-1
깃털 일회용 메스깃털02.001.30.011
파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 0.58 mm IDSmiths medical800/100/200
히스토아크릴10500525x 0.5 ml
류코플라스트BSN 메디컬 Inc.
현미경 슬라이드ROTH1879
폴리 알코올 Haut… farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Sterican 바늘 18 G x 1B. Braun304622
Sterican 바늘 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
티슈 페이퍼시판되는
수술 기구
Amalgam burnisher 3PLGatz0110?
블레어 견인기(4갈래(무딘)) x2Storz& KleinS-01134
Dumont No. 7 겸자파인 사이언스 툴 Inc.91197-00
Graefe 집게 곡선 x1Fine Science Tools Inc.11151-10
그레이프 집게 스트레이트 x2파인 사이언스 툴 Inc.11050-10
Heidemann 주걱 HD2Stoma2030.00
바늘 홀더 MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
가위파인 사이언스 도구 Inc.14074-11
Semken 집게Fine Science Tools Inc.11008-13
소형 수술 용 가위 곡선Fine Science Tools Inc.14029-10
소형 수술 용 가위 스트레이트파인 사이언스 도구 Inc.14028-10
표준 패턴 겸자파인 사이언스 툴 주식회사11000-12
Vannas 스프링 가위Fine Science Tools Inc.15000-08
장비
ECG 트리거 유닛신속한 생체 의학3000003686
MICROCAPSTAR 호단 이산화탄소 분석기AD 기기
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
다광자 현미경 Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 채널 레코더AD InstrumentsPL3508
온도 제어 가열 패드Sygonix26857617
온도 센서comercially 사용 가능
현미경 용 온도 제어 시스템 -Cube & BoxLife 이미징 서비스
브라운

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluores....

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