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방법 논문

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

10.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52614

⸱

2015년 7월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

초록

인트라 흉선 T 세포의 발달은 각종 간질 세포, 즉, 비 - T 세포로 구성된 복잡한 삼차원 메쉬 작업을 필요로한다. 순차적으로 즉, T 세포 수용체 레퍼토리 생성 및 선택에 따라 T 세포 계보 헌신 전에 주변에 자신의 수출에 필수 체크 포인트를 통과하면서 흉선 세포는 매우 조정 공간적 위해이 발판을 통과. 이 골격을 형성하는 두 가지 주요 상주 세포 유형은 (cTECs) 피질과 수질 흉선 상피 세포 (mTECs에게)입니다. mTECs의 주요 기능은 수많은 조직 제한 항원의 소위 무차별 표현이다. 이 조직 제한 항원은 각각 자기 허용 오차의 결과로, mTECs 또는 흉선 수지상 세포에 의해 직접 또는 간접적으로 흉선 세포를 미숙하기 위해 제공됩니다.

cTECs과 mTECs의 발달 경로와 기능을 모방 시험관에 적합한 모델은 현재 락입니다왕. 적절한 실험 모델의 부족은 예를 들면 아직 저조한 세포 및 분자 수준의 이해 난잡한 유전자 발현의 분석을 방해했다. 우리는 생체 고립 mTECs 문화 차원의 Organotypic 공동 문화 모델을 적용. 이 모델은 원래 생체 외 피부 동등 물을 생성하는 방식으로 케 라티노 사이트를 배양하기 위해 고안되었다. , CD80 안녕, 에르 양성 mTECs, RANKL에 (II) 응답 및 FoxN1의 (III) 지속 식으로 (I)의 증식과 CD80 보라, 에르 음성 단자 차별화 : 3D 모델은 mTEC 생물학의 주요 기능 기능을 보존 에르와 CD80 안녕 mTECs에서 조직 제한 유전자.

서론

나머지 2 %는 공동으로 흉선 기질을 구성하는 다양한 세포로 구성되어있는 동안 개발 흉선 세포는 흉선의 약 98 %를 차지 (즉, 상피 세포, 수지상 세포, 대 식세포, B 세포, 섬유 아세포, 내피 세포). 외부 대뇌 피질 상피 세포 (cTECs)는 다 능성 사전 T 세포 및 자기 MHC의 긍정적 인 선택의 골수, T 세포 계보 유도에서 프로 T 세포의 이민을 조달 미성숙 흉선 세포를 제한했다. 내부 수질 흉선 상피 세포 (mTECs)을 유도 부정적인 선택 또는 T 조절 세포 계보에 자신의 편차 중 하나에 의해 자기 펩타이드 / MHC 복합체에 대한 높은 선호도 TCR과 그 흉선 세포의 내성 유도에 참여하고 있습니다. 중앙 관용 유도의 맥락에서, mTECs은 따라서 주변 자체 미러링 조직 제한자가 항원 (TRAS)의 다양한 스펙트럼을 표현하는 점에서 독특합니다. 이 현상은 무차별 유전자 발현이라고 (PGE)1,2.

다양한 단기 2D 문화 시스템은 변함없이 처음 이일 3-6 내에서 MHC 클래스 II, FoxN1과 에르 같은 PGE의 손실과 키 조절 분자의 결과로이 매혹적인 세포 유형에 현재 대부분의 연구는 생체 분리 된 세포에 의존 . 그것은 특정 구성 요소와 흉선의 그대로 3 차원 그물 세공의 기능은 2D 모델에서 누락 된, 그러나 불분명 남아 있었다. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 그대로 흉선 미세 7에서 원경 한편 만 3D 한편, T 세포 발달의 연구를 허용 시스템, 및 간질 세포 생물학,이었다. 그러나 RTOCs들은 이미 태아 간질 세포의 입력을 필요로 5-10 일 최대 배양 기간을 견딜 세포 복합체를 포함하는, 즉, 특정 제한을 갖는다.

체외 배양 시스템의 환원의 부족의 연구를 방해하고있다T 세포 개발 및 흉선 기관 형성의 여러 측면하지 적어도 분자 PGE의 규제와 mTECs의 발달 생물학의 관계.

피부와 흉선의 상피 세포의 구조 조직의 확대 연관성으로 인해, 우리는 체외에서 각질 세포의 분화를 에뮬레이트함으로써 피부 동등한를 만들 원래 개발되었던 3D의 Organotypic 문화 (OTC) 시스템을 선택했다. OTC 시스템은 각질 세포가 8,9를 접종하는에 섬유소 젤에 갇혀있다 진피 섬유 아세포와 겹쳐 불활성 지지체 매트릭스로 구성되어 있습니다. 여기, 우리는 정제 mTECs와 각질 세포를 대체했다. 이 모델의 기본 기능을 유지하면서, 우리는 특정 매개 변수를 최적화.

mTECs가 증식 채택 장외 모델에 따라서 밀접하게 생체 mTECs 개발 모방, 단말 차별화를 시행하고 mTEC ID 및 PGE을 유지 10. 이 기술 노트는 흉선 OTCs의 단계적 설정을 허용하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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프로토콜

본 연구는 Regierungspräsidium 카를 스루에의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 독일 암 연구 센터 (DKFZ)에서 무균 조건 하에서 보관 하였다. 생후 1~7일 이르는 모든 배양 실험 마우스 새끼 사용 하였다.

흉선에서 mTECs 1. 분리

참고 : 다음과 같은 몇 가지 수정을 무균 상태에서 이전에 한 바와 같이 다음과 같은 소화 단계를 수행 하였다.

  1. 마우스 새끼 목을 벨과 흉선을 제거합니다. RPMI 1640 배지를 (5 % FCS를 포함)를 포함하는 페트리 접시에 얼음에 thymi를 놓습니다.
  2. ~ 5-30 ml의 RPMI 매체와 둥근 바닥 튜브에 좋은, 작은 조각과 장소에 thymi을 절감하고 실온에서 10 분 동안 자석을 사용하여 저어 부드럽게.
  3. 그 후, 주로 흉선 세포를 포함 뜨는을 가만히 따르다 및 collagena의 한 라운드에 남아있는 조직을 순차적으로 소화37 ℃에서 25 분마다 콜라게나 제 / 디스 파제 (0.2 ㎎ / ㎖ 및 1.2 U / mL의 최종 농도)이어서 37 ° C에서 각각 (0.2 ㎎ / ㎖ 최종 concentartion 57 U / ㎖) 15 분 동안 SE 타입 IV, thymi까지 자기 교반 수욕 C 완전히 분해된다. 세 thymi 두 당 1 ml의 효소를 사용합니다.
  4. 조직에게 파스퇴르 피펫마다 7-10 분 선동. 콜라게나 / 디스 파제의 분수를 수영장과 70 μm의 거즈를 통해 필터링합니다.
  5. 자기 세포 분류 (MACS)에 의해 mTECs을 풍부. 앞서 설명한도 11,도 1에 도시 된 바와 같이 자기 정렬 셀 mTECs의 정제를 수행한다.
    참고 : 안티 CD80-PE (16-10A1, 1에서 사용 : 100 희석)와 (1에서 G8.8, 사용 : 100 희석) 안티는 EpCAM 바이오 12 mTECs의 자기 정렬을 위해 우리는 다음과 같은 항체를 사용 하였다. 맥을 사용 미숙과 성숙 mTECs은 다음과 같이 정의했다 : CD45 -는 EpCAM + CD80 - 그리고 CD45을 - CD80 + respectiv을엘리.
  6. 아래 (2.3 절) 한 바와 같이 맥 정화 (미성숙 mTECs의 순도 = 83.1 ± 6.3 %와 성숙한 mTECs = 79.23 ± 3.42 %) 이후의 Organotypic 문화에 mTECs 씨앗.
  7. 또한, CD45 맥 고갈 후 (100 μm의 노즐을 사용하여) FACS 정렬 mTECs 다음 항체를 사용하여 : 안티 CD45-를 PerCP을 (30-F11, 1에서 사용 : 100 희석), 안티 Ly51-FITC (6C3 1에 사용 : 100 희석), 안티는 EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1에서 사용 : 500 희석) 1에서 항 CD80-PE (16-10A1, 사용 : 100 희석). (4 일) : 요오드화 프로피 듐 (5,000 일)를 사용하여 죽은 세포를 제외합니다. 각각는 EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 -는 EpCAM + CD80 - 및 PI - CD45 - Ly51 PI : FACS를 이용하여 미성숙과 성숙 mTECs과 같이 정의 하였다.

2. 3D의 Organotypic 공동 문화 (OTCs)

참고 : keratinocyt의의 Organotypic 재배 3D-피부 구조앞서 설명한 바와 같이 ES 9, 13을 제조 하였다. 모든 단계에서, 세포는 CO 2, 37 ° C에서 배양 5 %였다. 다음 mTECs를 사용 OTCs은 약간의 수정을 제조 하였다.

  1. 인간 섬유 아세포의 준비
    참고 : 이전에 9 바와 같이 인간의 피부 섬유 아세포 드 epidermised 진피 이식편 문화에서 얻었다.
    1. 간단히 말해서, 인간의 피부 (~ 5cm 길이)의 스트립을 잘라 써모 4 ° C에서 O / N (10 mM의 헤 페스의 pH 7.4와 생리 식염수 0.5 ㎎ / ㎖)로 처리.
    2. 그 후, 핀셋을 이용하여 진피로부터 상피를 분리한다.
    3. 미세 10cm 페트리 접시에 작은 조각, 장소에 진피를 잘라 살균 공기 흐름에 따라 1 ~ 2 시간 동안 건조 할 수 있습니다. DMEM 20 % FBS를 포함하는 정기적으로 외식을 보충합니다.
    4. 밖으로 성장하는 섬유 아세포를 분할 할 때 합류 외식 더 콘의 판에 부착 계속 확인하고 0.1 % 트립신을 사용 (일반적으로 약 3 주)가지의 secutive 라운드.
    5. 최대 DMEM의 3 배에 10 % FBS에 대해 동일한 외식에서 섬유 아세포를 확장하고 그들에게 14 냉동은-유지. 각각의 실험 시리즈 섬유 아 세포의 동일한 배치를 사용합니다.
      참고 : 섬유 아세포는 피부 등가물의 셋업에 대한 조사되지 않았다.
  2. 비계의 준비
    1. 정확히 12 잘 필터 삽입에 맞게 날카로운 11mm 직경의 금속 주먹을 사용하여 잘 경계가 원에 0.4-0.6 mm 두께의 비스코스, 부직포 섬유 재료 (엑셀 시트를 지원하는 제품 내용을) 잘라. 그런 다음 발판으로 12도 필터 인서트 (폴리 에스테르 모세관 기공 막, 3 μm의 기공 크기)에 배치합니다. 멸균 12 웰 플레이트에 전체 필터 설정을 놓습니다.
    2. 피브리노겐과 트롬빈의 조합으로 구성된 수술 피브린 글루 키트를 사용하여 피브린 겔을 준비한다. fibrinogen-뿐만 아니라 8 ㎎ / ㎖ 및 10 키트의 트롬빈 성분 사전 희석각각 단위 / ㎖,. 다음과 같이 12 웰 플레이트의 단일 잘 들어갑니다.
      1. 칼슘 및 마그네슘 2 + 2 +, pH가 7.0없이 100 μL 피브리노겐 100 μL, 인산 완충 식염수 (PBS)와 (8 ㎎ / ㎖)을 희석. 27 섬유 아 세포를 포함하는 100 μL의 FCS 100 μL 트롬빈 (10 단위 / ml)에 희석.
      2. 2 ㎎ / ㎖ 및 2.5 단위 / ㎖의 트롬빈의 피브리노겐의 최종 농도를 초래한다 : (1 혼합물 1) 200 μL 피브리노겐을 추가 아세포는 지지체 상에 세포 믹스 함유 트롬빈 200 μL에 디스펜스. 잘 혼합 부드러운 피펫 팅 (1 일)에 의해 발판의 전체 영역에 걸쳐 균등하게 배포 할 수 있습니다.
        참고 : 37 ° C에서 30 분 후, 섬유 아세포를 둘러싸는 완전히 응고 지지체의 내부 공간을 채우고 매끄러운 상면을 형성 형성한다.
  3. mTECs와 공동 문화
    1. 사전 문화에서 기관 배양을 덮어서 가리다매체 변화에 10 % FBS, 50 μg의 / ml의 L- 아스코르브 산 1 NG / ml의 TGF-β1과 DMEM 4-5일 대한 매일.
    2. mTEC 시딩 당일 rFAD 배지로 배지를 대체 (1 : 1 DMEM + DMEM / F12), 10 % FBS와 10 -10 M 콜레라 독소, 0.4 ㎎ / ㎖의 하이드로 코르티손,를 50㎍ / ㎖ L - 아스코르브 산, RANK 리간드 따라서 섬유 아세포에서 분비되는 세린 프로테아제에 의해 조숙 섬유소 용해를 방지 (는 0.1㎍ / ml) 및 500 단위 / ml의 아프로 티닌.
    3. 7 ~ 8 시간 후, 25 mTECs 시드에 의해 공동 문화를-설정 (전체 mTECs를, 또는 CD80 LO와 CD80 안녕 부분 집합), 섬유 아세포의 발판 위에 잘 당 100 μL의 볼륨. 노이 바 우어 실 (주 4)를 사용하여 세포를 카운트.
      참고 : 흉선 3D의 Organotypic 문화가 공기 해제되어 피부 OTCs 달리 미디어에 잠겨 모든 시간에.
    4. 24 시간 배양 한 후, 지금 containi (단계 2.3.2) 위에서 언급 한 바와 같이 매체와 문화 (총 매체 교환) 공급NG는 아프로 티닌의 양, 250 단위 / ㎖ (5 일)을 감소시켰다.
    5. mTECs의 증식 활동을 평가하기 위해, 문화의 종료 전에 4 시간 동안 OTCs에 (즉, 6.7 μM / ㎖, / 웰 10 μm의) EDU를 추가합니다. 각 문화 시편의 또는 흐름에 의해 두 개의 섹션에 하나 카운트 K14 + EDU + 세포에 의해, mTECs의 증식 지수를 결정 각질 (14)의 공동 염색과 결합 된 에듀 이미징 키트에 설명 된대로 장외 냉동 섹션의 염색을 수행 세포 계측법 (EDU 유동 세포 계측법, 제 1.7 대신 Ly51-FITC의는 1 CDR1-PB 15을 사용 : 100 희석 및 2.3.6.4).
    6. 공동 문화의 4-7일 다음, RNA 분리, 극저온 절편 또는 FACS 분석 (8 ~ 11 일)에 대한 OTCs 및 프로세스를 종료합니다.
      1. , 집게를 사용 웰 인서트의 필터에서, 골격 / 진피 동등한 분리 배양을 종료한다.
      2. 극저온 절편의 경우, 10월 화합물에 전체 OTC를 포함하고 리에서 동결극저온 절편 전에 파운드 질소 증기. 사용할 때까지 -20 ℃에서 저온 유지 및 저장소를 사용하여 5-7 μm의 두께 장외 섹션을 준비합니다. 항체 : (100 희석 1 GP53, 사용), 및 안티 멘틴 : 극저온 구분 OTCs의 면역 조직 화학 안티 - 케라틴 14 (1,000 희석 AF64, 사용 1에서)를 사용합니다. 각각의 이차 항체를 사용하여 간접 면역 조직 화학 염색을 수행합니다.
      3. RNA 분리를 들어, 용액 2 ㎖의의 RNase 무료 튜브의 나사 캡 (페놀 및 구 아니 디늄 티오 시아 네이트를 포함하는)를 열 변성 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 메스와 조각으로 전체 장외을 잘라 변성 솔루션을 포함하는 튜브에 추가 할 수 있습니다. 기계적으로 6.0의 속도로 30 초 동안 두 번 FastPrep 악기와 OTCs 분쇄기, 2 분 (샘플이이 시점 이후 -80 ° C에서 저장 될 수 있습니다) 얼음에 사이에 배치합니다. -80 ° C에서 냉동하면 얼음 위에서 해동. 4 ℃에서 10 분 동안 11,500-13,000 rpm으로 튜브를 원심 분리기. 신선한 튜브에 뜨는을 전송 RT와 F에서 5 분 동안 품어제조자에 의해 설명 된 바와 같이 산성 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 이용 ollow RNA 분리 프로토콜.
      4. FACS 분석의 경우, 지지체를 제거하고, 피브린 / 섬유 아세포 / mTEC 겔로부터 막 분리. 미세 메스 겔을 잘라 ~ 대한 FACS 튜브에 20 분을 소화 또는 완전히 자기 교반 수조에서 37 ° C에서 콜라게나 제 / 디스 파제 2 ㎖로 분해 할 때까지. 일단 파스퇴르 피펫 5 분마다와 효소 용액을 교반한다. 완전 분해 후, 70 ㎛의 필터를 통해 세포 현탁액을 필터; 1.7에 설명하고 유동 세포 계측법으로 분석하여 항체를 사용하여 단일 세포 현탁액을 염색.

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결과

우리는 원래 각화 세포 9 시험관 장기 배양을 위해 개발되었던 3D의 Organotypic 공동 배양 모델 (3D OTC)를 채택 하였다. 맥 풍부한 mTECs은 (맥 농축 방식의 그림 1 참조) 섬유소 젤 포획 된 섬유 아세포의 포함 발판에 접종 하였다. 섬유 아세포는 시험 관내에서 mTECs지지 필수적인 세포 외 기질 (ECM)을 제공한다. MTECs 공기에 노출 된 자신의 생체 내 환경 (장외 셋업 방식 그림 2 참조) 흉내 있습니다 각질 세포와는 달리 침수 문화에서 RANKL의 존재 4-14일에 대한 OTCs에서 재배되었다.

여기에 분석 두 mTEC 부분 집합 (즉, CD80 및 CD80 보라 하이 mTECs)은 최대 14 일 전체 문화 기간 동안 살아 남았다. MTECs은 각질 (14) 식에 의해 식별과 ...

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토론

RTOCs 외에도, 3D OTCs는 TEC 차별화와 PGE 유지 보수 / 유도 다른 (I)에 비해 (표 1) '단순화 된 3D 문화'는 사용의 측면에서 훨씬 우수하여왔다 - 섬유 아세포를 혼자 발판없이; (II) 2D 시스템을 사용하여 -, (ⅲ) 3T3-J2 세포 TEC 클론 개발에있어서, 열팽창 계수의 차이 (10)와 공동 배양 된 섬유 아세포 / 피더 세포,하지만 PGE가 손실 (IV) 마트 리겔 또는 (V) ECM 구성 요소 (게시되지 않은 데이터). PGE는 3D OTCs 최대 7 일간 유지하고, 그 후 최적의 시간이 포인트 인 사일은, PGE는 감소하기 시작합니다. 다른 형태 TEC 기능은 최대 14 일 동안 유지되었다. 흥미롭게 OTCs는 때때로 형성 Hassall 같은 구조 (10)에 의해 볼 mTEC 분화 말기 지원.

그들이 성인 thymi에 비해 문화에서 살아 남기 위해 더 ...

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공개 사항

저자는 관심의 재정적 또는 상업적 갈등을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 연구는 독일 암 연구 센터(DKFZ), EU 컨소시엄 "Tolerage", Deutsche Forschungsgemeinschaft(SFB 938) 및 Landesstiftung Baden-Württemberg의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
임산부 C57BL/6 마우스 찰스 리버 WIGA
LS 칼럼Miltenyi Biotec130-042-401
MS 칼럼Miltenyi Biotec130-042-201
CD45 Microbeads, 마우스Miltenyi Biotec130-052-301
Anti-PE MicrobeadsMiltenyi Biotec130-048-801
Streptavidin MicrobeadsMiltenyi Biotec130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)Ref. 12
CD80-PE 항체BD Pharmingen553769
CD45-PerCP 항체BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC 항체BD Pharmingen553160
CDR1-Pacific BlueRef. 15
Keratin 14 항체CovancePRB-155P
Vimentin 항체ProgenGP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 106-546-003
염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugateMolecular Probes (Invitrogen GmbH)A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 이미징 키트InvitrogenC10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 유세포 분석 분석 키트InvitrogenC10425
12-well filter inserts (thincerts)Greiner bio-one
12웰 플레이트Greiner665180-01
Jettex 2005/45ORSA, Giorla Minore, 이탈리아
Fibrinogen TISSUECOL-Kit 면역Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit 면역Baxter
PBSServa47302.03
DMEMLonzaBE12-604F
DMEM/F12LonzaBE12-719F
HEPESGibco15630-049 
FBS GoldGE HealthcareA11-151
아프로티닌 (트라실롤)바이엘4032037
콜레라 독소BiomolG117
하이드로 코르티손세롬 (Biochrom)K3520
L- 아스코르브 산시그마A4034
TGF-ß 1InvitrogenPHG9214
RANKLR & D 시스템462-TR-010
ThermolysinSigma Aldrich  T-7902
OCT 컴파운드TissueTek4583
트리졸 (일명. 변성 용액 - 산성 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)Invitrogen10296028
FastPrep FP120Thermo Scientific
Collagenase Type IV CellSystems0.2 mg/ml 및 57U/ml 최종 농도를 LS004189
중성 프로테아제(Dispase)CellSystemsLS0021040.2 mg/ml 및 1.2U/ml 최종 농도입니다.
DNase 나는 Roche11 284 932 00125 &마이크로; g/ml 최종 conc.
657631는 .

참고문헌

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