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방법 논문

동소 이식 췌장 암 마우스 모델의 동적 대비 강화 된 자기 공명 영상

15K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52641

⸱

2015년 4월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, 3Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 마우스의 정소성 췌장 종양 이종 이식편에 동적 대비 강화 자기 공명 영상(DCE-MRI)을 적용하는 것입니다. DCE-MRI는 표적 조직의 미세혈관 구조를 분석하는 비침습적 방법이며, 새로운 요법 후 종양의 혈관 반응을 평가하는 데 유용합니다.

초록

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI)은 복부 부위의 심각한 호흡 운동 아티팩트로 인해 정소성 췌장 종양 이종 이식편에 제한적으로 사용되었습니다. 정형소 종양 모델은 혈액 공급, 신생혈관형성 및 종양 세포 침습에 영향을 미치는 원발성 종양 미세환경을 반영할 수 있기 때문에 피하 종양 모델에 비해 이점을 제공합니다. 최근에는 이미징 중 흉부 부위의 움직임 전달을 방지하기 위해 직각으로 구부러진 플라스틱 보드로 종양을 고정하여 마우스 모델에서 orthotopic 췌장 종양 이종이식편의 DCE-MRI 프로토콜을 수립했습니다. 이 위원회에 의한 압력은 복부에 국한되어 있었고 동물의 호흡 곤란을 초래하지 않았습니다. 이 논문은 소동물을 사용한 정형소 췌장 종양 모델링과 종양 이종이식편의 DCE-MRI에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. DCE-MRI에서 약동학 매개변수의 정량화 방법도 소개합니다. 이 기사에 설명된 절차는 연구자가 정소성 위장관 암 마우스 모델에 DCE-MRI를 적용하는 데 도움이 됩니다.

서론

이 방법의 전반적인 목표는 생쥐에서 소성 췌장 종양 이종 이식에 대한 동적 대비 강화 된 자기 공명 영상 (DCE-MRI)을 적용하는 것입니다. DCE-MRI는 주사 후 일정 기간에 걸쳐 MR 콘트라스트의 변화를 모니터링함으로써 표적 조직에서 미세 혈관을 평가하는 비 침습적 방법이다. DCE-MRI는 악성 종양을 진단하고 치료 1-4 다양한 종양 반응을 평가하기 위해 이용되고있다. 양적 DCE-MRI는 높은 재현성 5를 발표했다. 표적 조직 MR 조영제의 약물 동태 학적 파라미터를 정량하기 위해, 콘트라스트 주입 전의 다양한 시점 및 T1 맵 취득한 모든 DCE-MR 이미지는 6 coregistered되어야한다. 그러나, 복부의 호흡과 연동 운동에 양적 DCE-MRI는 위장관 종양 제한된 응용 프로그램을했다.

동소 췌장 종양 모델을 평가하기 위해 사용되어왔다생물학적 치료와 화학 요법 7,8 다음 췌장 종양 반응. 원래 종양 부위에서의 미세 환경이 반사 및 치료함으로써 인간의 종양 반응을보다 정확하게 예측할 수 있기 때문에 종양 동소 이식 모델은, 종래의 피하 모델 우수 여겨진다. 그러나, 마우스의 췌장은 복부의 왼쪽 윗부분에 위치하고 있으며, 생쥐에서 소성 췌장 종양 이종 이식의 이렇게 양적 DCE-MRI는 쉽게 구현되지 않았습니다.

우리는 가슴 영역 (9)로부터 전송 동작을 방지하기 위해 직각 굽힘 플라스틱 기판을 사용하여 종양을 고정하여 마우스에서 복부 종양 DCE-MRI의 프로토콜을 확립했다. 이 보드에 적용되는 압력은 복부에 지역화하고, 호흡 곤란 결과 않았습니다. 자동 화상 coregistration 기술은 자유 호흡 모드 복부 장기의 DCE-MRI 대해 검증되었습니다 있지만 effectivel 수행Y는 단지 목표 영역은 규칙적으로 천천히 이동할 때 10. 동물의 호흡 속도는 이미징 동안 변수, 복부 너무 물리적 구속 정위 췌장 종양 마우스 모델에서 신뢰할 수있는 약물 동태 학적 매개 변수를 검색 할 필요가있다. 우리는 성공적 DCE-MRI 11-13 직각 굽힘 플라스틱 기판을 사용하여 소성 췌장 종양 이종 이식에서 MR 조영제의 약동학 파라미터를 정량 하였다. 여기에 우리가 동소 췌장 종양 모델링의 세부 절차를 제시, 종양 마우스에 이종 이식 및 약물 동태 학적 파라미터의 정량 DCE-MRI.

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프로토콜

모든 절차는 버밍엄 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 동소 이식 췌장 종양 마우스 모델링

  1. 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 표준 인간 췌장 암 세포주는 10 % 소 태아 혈청. 5 % CO 2 가습 분위기에서 37 ° C에서 모든 문화를 유지한다.
  2. 8~10주 세 여자 심한 결합 면역 결핍 마우스를 사용합니다. 12 시간 빛과 12 시간의 어둠 사이클 RT에서 (21 ± 2 ° C의) 60 %의 습도에서 동물 케이지를 놓습니다.
  3. 수술 내내 산소 (2 리터 / 분)과 혼합 된 이소 플루 란 2 %와 환기 장치를 사용하여 모든 동물을 마취. 발가락 핀치 반사에 의한 마취의 깊이를 확인합니다. 가열 패드 (37 ° C)에 도시 동물 체온을 유지한다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 안과 연고를 적용합니다. &# 160;
  4. 각 마우스의 복부의 왼쪽 윗부분에 머리를 제거하고 진통제를주는 영역으로 (5 ㎎ / 체중 피하의 kg carpofen). 노출 된 피부에 베타 딘 솔루션을 적용합니다. 멸균 수술 도구를 준비합니다.
  5. 피부에 1cm의 절개를하고 홍채 바로 가위를 사용하여 복막. 조심스럽게 수술 핀셋을 사용하여 복부에서 췌장을 제거합니다.
  6. 췌장의 꼬리에 0.5 ml의 인슐린 주사기의 28 G 바늘을 삽입하고 천천히 DMEM 30 μL에 250 만 인간 췌장암 세포의 용액을 주입. 작은 물집이 솔루션에 의해 췌장의 머리에서 생성되어 있는지 확인합니다.
  7. 조심스럽게 다시 수술 핀셋을 사용하여 복부에 췌장을 배치합니다. (2) 5-0 prolene의 봉합을 중단과 1 층에 복막과 피부를 닫고 마취을 종료합니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.60 7 ~ 10 일 후 수술에서 봉합사를 제거합니다.
  8. 수술 후 24 시간에서 (carpofen, 5 ㎎ / 체중 피하의 kg) 진통제 약물의 또 다른 복용량을 제공합니다.
  9. 두 손가락을 사용하여 수술 영역을 palpating하여 종양의 크기를 확인합니다. 종양은 일반적으로 주변 조직과 장기에 비해 밀도가 높고 울퉁불퉁 느낌. 종양을 느끼고 시작 2 주 - 보통 1 ~합니다.
  10. 질병의 흔적을 매일 동물을 모니터링합니다. 동물 병 (부족 정상 정리 및 회피 행동)을 표시 할 때, 우리는 마취 상태에서 자궁 전위를 사용하여 종료되었습니다.

2. 자기 공명 영상

  1. 세포 주입 후 보통 2 ~ 사주에 직경 7mm - 종양의 크기가 약 5을 때 MRI를 적용합니다. 작은 동물 이미징 또는 작은 동물 이미징을위한 전문 코일이 장착 된 임상 MR 스캐너 전용 MR 스캐너를 사용합니다.
    참고 : H는 1 부피 공진기의 조합으로 9.4T 작은 동물 MR 스캐너를 사용/ 송신기 및 표면 코일 수신기 (직경 30mm) (브루 커 (Bruker) 사 BIOSPIN, 빌레 리카, MA). 표면 코일 나은 신호 대 잡음비 (SNR)를 제공한다 (14).
  2. 0.2ml의 PBS (인산 완충 생리 식염수) - ~ 0.1 각각의 동물에게 0.2 밀리몰 / kg - ~ 0.1를 주입 가돌리늄 계 MRI 조영제를 준비한다.
    참고 : 우리는 gadoteridol를 사용하고, 15 초 동안 (0.1 ㎖ / 초)를 통해 0.15 ml의 PBS 0.2 밀리몰 / kg을 주입.
  3. 마이크로 polyethelene 튜브 (: 7.62 mm, 내경 : 0.28 mm, 외경 : 0.64 mm 길이)를 준비한다. 하나의 관의 단부와 다른 단부에 무딘 팁 30 G 바늘 (9.5 mm 길이)로 30 G 바늘 (12.7 mm 길이)를 삽입한다. 뭉툭한 팁 바늘에 MR 조영제를 포함하는 1 ML의 주사기를 연결하고 천천히 MR 조영제와 전체 튜브를 채우기 위해 주사기를 밀어 넣습니다.
  4. 제제 전체에 산소 및 이미징 (2 L / 분)와 혼합 된 이소 플루 란 2 % - 1 ~ 환기를 사용 동물 마취. ANEST의 깊이를 확인발가락 핀치 반사에 의해 hesia. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 안과 연고를 적용합니다. 니들 삽입 전에 가열 램프를 이용하여 지정 맥 꼬리를 팽창. 켈리 집게를 사용하여 30 G 바늘의 중간을 잡고, 꼬리 정맥에 삽입합니다. 플라스틱 또는 판지 종이 (10mm 폭 X 길이 100 mm)의 조각 위에 테이프를 모두 꼬리와 튜브 꼬리를 똑바로 유지합니다.
  5. 촬영하는 동안 체온을 조절하기 위해 따뜻한 물 (또는 따뜻한 공기)를 순환 장착 동물 침대에 누운 위치에있는 동물을 놓습니다. 37 ° C에 침대에 온도를 설정합니다. 촬상 동안 체온을 모니터링하는 직장​​ 온도 프로브를 삽입한다.
  6. 복부에 직각으로 구부러진 플라스틱 기판을 적용합니다. 종양이 보드의 상단 뒤에 위치되어 있는지 확인하고 약간 보드를 풀다운 (~ 2mm) 종양을 보장하기는 이사회가 발견된다. 단단히 동물 침대에 보드를 테이프입니다.
  7. 호흡 패드 형질 도입을 테이프로가슴 부분에 R (SA 악기, 주식, 스토니 브룩, 뉴욕) 이미징 동안 동물의 호흡을 모니터링 할 수 있습니다. 종양 영역의 상단에 표면 코일을 놓고 단단히 동물 침대에 테이프. (: 내경 72mm) 볼륨 코일의 중심에 종양 영역을 배치 MR 스캐너로 동물 베드 누른다.
  8. 수신기와 송신기 모두에 대해 매칭과 튜닝을 수행 shimming 하였다.
  9. 종양을 찾을 수 해부학 MR 순서로 시작합니다. 다음 인수 매개 변수를 축 이미지를 얻기 위해 T2 강조 (T2W) 터보 스핀 에코 시퀀스를 사용합니다. 반복 시간 (TR) / 에코 시간 (TE) = 3000 / 34 밀리 초, 128 X 128 매트릭스,보기 30 X 30mm 필드, 평균 수 = 1, 에코 기차 길이 = 4, 20 연속 1mm 두께의 조각에 인터레이스 모드는 전체 종양 영역 (1.6 분 전체 주사 시간)을 커버한다.
    주 : 소성 췌장 종양이 피하 것보다 위치되도록 더 어렵게하기 때문에, 종래 locali낮은 해상도의 ZER 이미지는 유용하지 않을 수 있습니다.
  10. T1지도를 검색하기 위해 다양한 플립 각도 T1 강조 (T1W) 이미지를 획득. 평균 반복 시간 (TR) / 에코 시간 (TE) = 3분의 115 밀리 초, 128 X 128 매트릭스,보기의 30 X 30mm 필드 번호 :이를 위해, 다음 매개 변수를 multiflip 각도 접근 에코 그라데이션을 사용 = 4 ~ 5 - 종양 영역을 커버하는 인터레이스 모드에서 7 연속 1mm 두께의 슬라이스와 열 일곱 플립 각도, 20, 30, 40, 50, 60, 및 플립 각도 당 70 (총 스캔 시간 : 1 분).
    주 : 그러나, multiflip 각도 접근법 B1 필드 균질성이 높은 경우에만 효과적이다. 그렇지 않으면, T1지도 여러 접근법 대신 TR (15)를 얻을 수있다.
  11. 전과 MR 가돌리늄 계 조영제 주입 후에 T1W 이미지를 획득. ESP, K 공간의 중심이 획득되는 경우, 정상 상태를 보장하기 위해 T1 맵핑 (30)를 사용하지만, 선형 부호화의 고정 플립 각을 갖는 동일한 획득 파라미터 및 기하학을 사용하여짧은 TR과 낮은 수준의 플립 각도가 사용됩니다 ecially 때. 반면 주입 전에 5 기본 이미지를 획득. (45 분 전체 주사 시간)이어서 콘트라스트 주입 후 40의 이미지를 획득. 일정 속도 (0.01 ㎖ / 초)에 조영제를 주입 주사기 펌프를 사용한다.
  12. 지속적으로 동물의 호흡을 모니터하고, 50 호흡을 유지하기 위해 이소 플루 란 농도를 조정 - 분당 100 호흡. 영상 전반에 걸쳐 동물의 체온을 모니터링합니다.
  13. DCE-MRI를 완료 한 후, 바늘 및 기타 프로브를 벗고, 종이 수건과 침대 빈 새장에 동물을 배치합니다. 부드럽게 낮은 복부 마사지. 케이지는 복구로 동물 열 구배 내외부로 이동할 수 있도록 가열 램프 아래 절반에 배치되어야한다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.

3. 이미지 처리 및 분석

  1. 세그먼트 종양 정합 T2W 이미지에에. T2W 이미지에서, 종양 영역에서의 신호 강도는 주위 조직에 비해 더 밝은, 그래서 종양 경계를 수동으로 묘사 될 수있다.
    주 : 이러한 글로벌 임계 또는 능동 윤곽 등 반자동 분할 기술 (16, 17)를 사용할 수 있지만, 배경 휘도 불균일은 코일면이 사용될 때 특히 보정 될 것이다.
  2. T1과 양성자 밀도지도를 만듭니다. 그 에코 시간 (TE)를 가정 구배 에코 시퀀스 T1W 취득한 화상에서 T2 * 값은, 화소 값에 의해 결정되는 것보다 훨씬 적다
    figure-protocol-1
    S 0 프로톤 밀도이고, T는 1 TR은 반복 시간이고, T 한 완화 시간 상수이며, θ는 플립 각도이다. 식 (1)에 다시 작성할 수 있습니다
    641eq2.jpg "/>
    S (θ) / sinθ가 Y로 대체하고, S (θ) 때 / tanθ는 X로 대체됩니다. 수학 식 (2)는 선형 방정식이고, 그 기울기와 절편은 각각 T1 및 S 0 값을 검색하는 데 이용 될 수있다.
  3. DCE-MR 영상에서 MR 대비 농도를 계산한다. MR 가돌리늄 계 조영제가 주입되면, T (1) 완화 시간 상수는 시간이 지남에 따라 변화된다. 따라서, 식 (1)에 다시 작성할 수 있습니다
    figure-protocol-2
    다음과 같이 T 1 (t)는, MR 대비 농도, C (t)와 관련이있다
    figure-protocol-3
    여기서 R1은 MR 조영제의 길이 이완성이다. 그래서, 결합하여 식 (3) 및 (4), MR 조영제 농도에 의해 결정된다
    figure-protocol-4
  4. 콘트라스트 분사를 개시 한 후 시간 t에서 MR 콘트라스트 에이전트. C의 P (t)의 혈장 MR 조영제 농도를 나타낸다의 약동학 파라미터를 정량. C의 P (t하면) 동맥 입력 기능 (AIF)라고한다. AIF를 사용할 수있는 경우, MR 조영제의 약동학 적 파라미터에 의해 계산 될 수있다
    figure-protocol-5
    C를 t (t)는 MR 조영제 농도가 표적 조직이고, V p를, V 전자 단편 혈관 외 세포 부피 분수 혈장 부피이고, K 트랜스 볼륨 전송 상수이다. 플럭스 속도 상수, k 개의 EP는 K 트란과 동일V 전자로 나눈 s의. AIF가없는 경우, 참조 영역 모델 대신에 사용될 수있다 (18,19). 기준 영역 모델은 흐름 제한 Kety 모델 (20)에 기초하여 다음과 같이된다 AIF 대한 필요성을 제거하는 기준 영역에 대비 농도를 사용하여,
    figure-protocol-6
    여기서 C의 t, ROI (t), K 트랜스는, 투자 수익 (ROI) 및 V 전자는 ROI가, 관심 (ROI)의 영역에서 각각 대비 농도, 볼륨 전송 일정 및 분수 혈관 외 - 세포 외 볼륨입니다 C의 t 동안, RR (t), K 트랜스, RR, 및 V 즉, RR은 기준 영역의 것들이다. 척추 주위 근육은 종종 쥐 포장 된 V 전자, RR 참조 영역으로 선택하고,ravertebral 근육은 0.08 (21)에 일정하다고 가정한다. 우리는 기준 영역 모델을 사용 하였다.

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결과

인간 췌장 종양 세포는 마우스 췌장 고형 종양 생성에 성공적으로 성장한다. (1) (A) 종양 세포 용액이 주입되어 정상적인 췌장, 및 (B)의 사진을 보여준다 동소 췌장 종양 이종 이식 베어링 대표적인 마우스 (MIA PACA -2- ). 종양은 다음 비장, 복부의 왼쪽 윗부분에 위치하고 있습니다. 세포 주입 후 직경 7 mm의 - 종양이 5 성장하는 사주 - 보통이 소요됩니다.

동 잡음이 특정 크기에 자기 공명 영상에 존재하지만, 동소 췌장 종양 이종 이식의 움직임은 실질적으로 억제되었다. T2W MR 이미지에서, 종양 영역 위의 공기의 MR 신호의 표준 편차는 피하 종양 모델을 사용했을 때 췌장 종양 세포는 동소보다도 주입했을 때 약 2.5 배 더 컸다.도 2a는 DCE위한 셋업의 개략도를 도시 소성 pancreati의 -MRIC 종양 이종 이식. 주황색 원은 직각으로 구부러진 플...

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토론

우리는 면역 결핍 마우스, 마우스 복부 종양의 DCE-MRI, 그 운동 매개 변수의 정량화를 사용하여 소성 췌장 종양 모델링의 상세한 방법을 소개했다. 췌장의 꼬리에 바늘을 삽입 할 때 소성 췌장 종양 모델에서주의를 기울여야합니다. 성공적인 경우, 세포는 작은 소포를 만드는 췌장의 머리로 전달 될 것이다. 직각 굽힘 플라스틱 기판을 적용 할 때의 종양은 기판의 상부 단부 아래에 위치되는 것을 확인하는 것이 중요하다. 췌장 종양 다이어프램 근처이기 때문에, 기판은 종양의 크기는 직경 5mm 이하이며, 특히, 확실하게 유지할 수없는 일 수있다. 촬영 후, 복부는 동물이 의식 될 때까지 부드럽게 마사지한다. 이것은 복부 통증을 방지하기 위해 90 분 이상보다 각 동물에 대한 총 이미징 및 제조 시간을 초과하지 않을 것을 권장.

플라스틱의 치수보드는 종양이나 동물의 크기에 따라 재조정 될 필요가있다. 종양의 크기가 5mm 미만이면, 종양은 단단히 MR 이미지에서 발생할 수 4mm 깊...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 정소성 췌장암 마우스 모델링을 도와준 Jeffrey Sellers에게 감사를 표합니다. 이 작업은 UAB 방사선학과의 Research Initiative Pilot Awards와 NIH 보조금 2P30CA013148 및 P50CA101955의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMInvitrogen11965-118
소 태아 혈청Harlan LaboratoriesBT-9501
BetadinePurdue 제품67618-153-01
5-0 Prolene 봉합사Ethicon8720H
9.4T MR 스캐너Bruker Biospin CorporationBioSpec 94/20 USR
GadoteridolBracco Diagnostics IncNDC 0270-1111-03
마이크로 폴리에틸렌 튜브Strategic Applications, Inc#PE-10-25
30 G 블런트 팁 니들Strategic Applications, Inc89134-194
모니터링 및 게이팅 시스템SA 기기, Inc모델 1030이것은 작은 동물의 보호 등급과 체온을 동시에 측정하는 MR 호환 시스템입니다.
주사기 펌프New Era Pump Systems, Inc.NE-1600
시리즈

참고문헌

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