नैदानिक शुरुआत के बाद से पहले या करने के लिए – – लक्षित चिकित्सा विज्ञान के लिए दवा का विरोध व्यापक और प्रतिरोध के तंत्र की पहचान करने की जरूरत है विकल्प नैदानिक प्रबंधन रणनीति के मार्गदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम इन तंत्रों की खोज में तेजी लाने का अनुक्रमण के साथ इन विट्रो में दवा प्रतिरोधी लाइनों की जोड़ी व्युत्पत्ति के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
मजबूत अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और बेहतर डेटा विश्लेषणात्मक उपकरणों से ट्यूमर जीनोम का विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन विशिष्ट प्रकार के कैंसर 1,2 में महत्वपूर्ण आनुवंशिक परिवर्तन की खोज करने के लिए प्रेरित किया है। ऐसे HER2, बीसीआर-एबीएल, EGFR और ALK के रूप में इन आनुवंशिक घावों के उद्देश्य से निशाना बनाया उपचारों के विकास में काफी रोगियों 1,2 के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार हुआ है। प्रतिरोध अंततः के रूप में उभर हालांकि, इस दृष्टिकोण की विशिष्टता के बावजूद ज्यादातर एकल उपचार के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया उप इष्टतम किया गया है। हाल ही में, महत्वपूर्ण प्रगति लक्षित चिकित्सा विज्ञान के लिए प्रतिरोध के आणविक आधार को समझने में किया गया है। दिलचस्प, यह प्रतिरोध का एक प्रमुख तंत्र लगातार लक्ष्य / मार्ग गतिविधि शामिल है कि स्पष्ट होता जा रहा है। इस मामले में के रूप में, एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) प्रोस्टेट कैंसर के enzalutamide उपचार, एआर अपने आप में म्यूटेशन को सक्रिय बनाए रखने के संवर्धन के लिए होता है -directed एआर संकेत outpअवरोध करनेवाला 3-5 की उपस्थिति में संघ राज्य क्षेत्र। इस ज्ञान में WT और उत्परिवर्ती-एआर समारोह में दोनों को दबाने के लिए जारी रख सकते हैं कि तीसरी पीढ़ी के विरोधी विकसित) 1 के लिए एक आक्रामक अभियान के लिए प्रेरित किया enzalutamide प्रतिरोधी पीसीए 3 और 2) चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए निशाना बनाया जा सकता है कि एआर सिगनल की संभावित नीचे की ओर नोड्स की पहचान । इसी प्रकार, इस तरह के EGFR, BRAF और एबीएल को निशाना बनाने वाले के रूप में अवरोधकों के अन्य वर्गों के लिए प्रतिरोध अक्सर मूल खेलों काइनेज मार्ग 1 पुन: सक्रिय कि म्यूटेशन के लिए सीसा।
प्रतिरोध अनिवार्य रूप से सबसे अधिक रोगियों में उभर रहे हैं कि ज्ञान के साथ, दृष्टिकोण विकसित कर शीघ्रता से प्रभावी अनुवर्ती उपचारों के विकास की अनुमति होगी रोशनी करने के लिए इन तंत्रों में लाने के लिए। व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है कि एक दृष्टिकोण घ के लिए उत्तरदायी हो सकता है कि आनुवंशिक घावों में संवर्धन / depletions की पहचान के सापेक्ष उपचार-भोले या संवेदनशील ट्यूमर के लिए नैदानिक आग रोक ट्यूमर के जीनोमिक्स का विश्लेषण करने के लिए हैगलीचा खोज। अपने वादे के बावजूद, त्वरित खोज में बाधा है कि इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख देनदारियों देखते हैं। सबसे पहले, जीनोमिक पूछताछ के लिए ट्यूमर सामग्री के लिए समय पर पहुँच पाने के इलाज के लिए चिकित्सा से बढ़ने में एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में सेवा कर सकते हैं। ट्यूमर महत्वपूर्ण इंट्रा-tumoral विविधता 6.7 पेश कर सकते हैं, क्योंकि दूसरे, प्रतिरोधी सेटिंग में आनुवंशिक घावों के असंख्य की deconvolution चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
इन चुनौतियों के प्रकाश में, प्रतिरोध तंत्र की प्रीक्लीनिकल खोज पर निर्भरता बढ़ गई है। इस दृष्टिकोण से पहले प्रतिरोध की शुरुआत के बाद इन तंत्र या तो पहले उपचार के लिए या सहन कि उन रोगियों में वैकल्पिक नैदानिक प्रबंधन रणनीति मार्गदर्शन कर सकते हैं कि क्लिनिकल परीक्षण करने के लिए 1 प्रमुख प्रतिरोध तंत्र की पहचान की अनुमति हो सकती है।
व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है कि ऐसा ही एक प्रीक्लीनिकल खोज उपकरण निष्पक्ष कार्यात्मक आरएनएआई स्क्रीन लागू करने के लिए है। परीक्षा के लिएमिसाल, Whittaker और सहयोगियों NF1 निरंतर हानि MAPK मार्ग सक्रियण 8 के माध्यम से आरएएफ और खल्क अवरोधकों के लिए प्रतिरोध मध्यस्थता करता है कि पहचान के लिए एक जीनोम पैमाने आरएनएआई स्क्रीन लागू होता है। NF1 में नुकसान के समारोह म्यूटेशन आरएएफ निषेध करने के लिए और सक्रियण 8 vemurafenib के लिए प्रतिरोधी मेलेनोमा ट्यूमर में आंतरिक रूप से प्रतिरोधी रहे हैं कि BRAF -mutant ट्यूमर कोशिकाओं में मनाया गया के रूप में इन निष्कर्षों को चिकित्सकीय प्रासंगिक होना पाया गया है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की सफलता के बावजूद, कई चिकित्सकीय प्रासंगिक लक्ष्यों को अक्सर संभवतः कारण इस दृष्टिकोण के नुकसान के समारोह पक्षपात करने, पहचान नहीं कर रहे हैं।
इसके विपरीत, प्रतिरोध तंत्र की प्रीक्लीनिकल खोज के लिए एक कम पक्षपाती उपकरण NGS आधारित जीनोमिक या transcriptomic रूपरेखा के साथ युग्मित ब्याज की मिश्रित करने के लिए लंबे समय तक निवेश के माध्यम से प्रतिरोधी सेल लाइनों की पीढ़ी शामिल है। यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक सहज की पहचान करने के लिए कई समूहों द्वारा लागू किया गया हैप्रतिरोध 5,9,10 सक्षम है कि आवर्तक एकल nucleotide वेरिएंट या अभिव्यक्ति परिवर्तन। उदाहरण के लिए, एआर में बारम्बार F876L उत्परिवर्तन हाल ही में इन विट्रो 3-5 में प्रतिरोधी क्लोन में और क्लिनिक 4 में पहले इस उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए इन विवो 5 में जेनोग्राफ्ट ट्यूमर में खोज की थी। हाल ही में भंग और उनके सहयोगियों ने कहा कि सबसे कार्यात्मक प्रासंगिक म्यूटेशन सुझाव एक पूर्व मौजूदा उप-जनसंख्या का हिस्सा थे लंबे समय तक दवा प्रदर्शन के दौरान उठता है कि प्रतिरोधी क्लोन की है कि बहुमत दिखाने के लिए दो चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल में ClonTracer इस्तेमाल किया (2015) 11-पूर्व मौजूदा पहले से ही होने की संभावना है कि चयन 11 के दौरान के लिए चयनित हो जाते हैं।
पहले चर्चा ट्यूमर के जीनोमिक प्रोफाइलिंग के विपरीत, कम विविधता से इस दृष्टिकोण के लाभ 'समरूप' प्रतिरोधी क्लोन संभावित ड्राइवरों की अधिक सटीक आनुवंशिक विच्छेदन को सुविधाजनक बनाने के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Furthermअयस्क, excitingly, प्रतिरोध के तंत्र को उजागर करने के लिए क्षमता के अलावा, इस विधि को भी इस जानकारी को अज्ञात 10 है, जिसके लिए बायोएक्टिव छोटे अणुओं के सेलुलर कार्रवाई के तंत्र और लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। स्पष्ट फायदे और इस दृष्टिकोण के कई उपयोगों को देखते हुए, हम यहाँ चिकित्सकीय सार्थक खोजों के लिए क्षमता को अधिकतम करने के लिए इस तरह के एक प्रीक्लीनिकल स्क्रीन के सफल कार्यान्वयन का ब्यौरा एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
सेल लाइन (एस) का चयन: आनुवंशिक राज्य और जीनोमिक अस्थिरता की विशेषता
निस्संदेह, सफलतापूर्वक चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रतिरोध तंत्र को उजागर करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रारंभिक सेल लाइन चयन है। दो कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, रोग के निर्णायक आनुवंशिक लक्षण शरण इसी वंश / उप प्रकार की सेल लाइन (एस) का चयन करने के लिए लक्ष्य (जैसे।, मेलेनोमा में BRAF V600E)। संकेत 33,34 की एक किस्म के लिए दोनों सेल लाइनों 30-32 और प्राथमिक / मेटास्टेसिस ट्यूमर के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध transcriptomic और उत्परिवर्तन डेटा से पूछताछ के चयन की प्रक्रिया की सुविधा होगी। चिकित्सकीय प्रासंगिक आनुवंशिक परिवर्तन के साथ सेल लाइनों की पहचान के लिए आदर्श है, कुछ मामलों में इस वजह से इस तरह जांच प्रक्रिया की कठिनाई और लंबाई के रूप में कारकों की वजह से उपलब्ध सेल लाइनों की कमी या संभव करने के लिए संभव नहीं हो सकता है।
<p class="jove_content"ऊपर उल्लिखित बात करने के साथ संबंध है, एक दूसरा पहलू सेल लाइन चयन दौरान तो विचार लिए> कम या वांछित लाइन का उपयोग स्क्रीनिंग प्रतिरोध की व्यवहार्यता है। उदाहरण के लिए, इस तरह के प्रसार और आंतरिक उत्परिवर्तन दरों के रूप में कारकों बहुत खोज की गति पर प्रभाव कर सकते हैं। यह अंत करने के लिए, सेल लाइनों सहज प्रतिरोध के उद्भव 35 त्वरित किया जा सकता है कि उम्मीद में डीएनए एमएमआर तंत्र में तेजी से विकास कैनेटीक्स और कमी के साथ उपयोग किया जा सकता है। लौकिक डेटाबेस के आधार पर, कई उम्मीदवार सेल लाइनों दो अक्सर उत्परिवर्तित जीन एमएमआर, MSH2 या MLH1 में से एक में कमी के साथ मौजूद हैं (टेबल्स 2 और 3)। ब्याज की सेल लाइनों ऐसे क्षारीकरण एजेंट के रूप में एमएमआर, शारीरिक या डीएनए प्रतिक्रियाशील रासायनिक उत्परिवर्तजन के साथ तीव्र उपचार में असर दोष मौजूद नहीं है, तो वैकल्पिक रूप से, एन -ethyl- एन -nitrosourea (ENU) जीनोमिक अस्थिरता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि हो सकता है काफी है दोनों दृष्टिकोणप्रतिरोधी क्लोन पाने और अनुवर्ती अनुक्रमण के लिए समय Horten, कड़े कार्यात्मक परीक्षण गैर कार्यात्मक की एक बड़ी संख्या के रूप में उम्मीदवार जीन पर किया जाना चाहिए, यात्री म्यूटेशन उभरने की संभावना है। SNVs कार्यात्मक प्रासंगिक म्यूटेशन की पहचान करने के लिए अवसरों को अधिकतम करने के आदेश दिए रैंक हो सकता है। सबसे पहले, चुनने स्वतंत्र क्लोन में बारम्बार रहे हैं कि उन म्यूटेशन इन म्यूटेशन प्रतिरोध के ड्राइवर हैं संभावना में वृद्धि होगी। घटना में बारम्बार म्यूटेशन दवा की कार्रवाई की व्यवस्था है कि फिट SNVs पर ध्यान केंद्रित, पहचान नहीं कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, दवा लक्ष्य या नशीली दवाओं के लक्ष्य का एक ज्ञात बहाव के प्रेरक) सार्थक हो सकता है। अंत में, सोने के मानक हमेशा दवा के प्रति संवेदनशील पैतृक कोशिकाओं में अस्थानिक सीडीएनए अभिव्यक्ति द्वारा उम्मीदवार SNVs का प्रतिरोध-प्रदान करने गतिविधि की प्रायोगिक मूल्यांकन है।आरएनए अनुक्रमण बनाम डीएनए
एक बार जब प्रतिरोधी क्लोन उत्पन्न डीएनए और / या आरएनए कर दिया गया हैजरूरत के आधार पर अनुक्रम किया जा सकता। डीएनए अनुक्रमण, exome या पूरे जीनोम अनुक्रमण, या तो इस तरह के SNPs, indels रूप germline और दैहिक वेरिएंट की पहचान की अनुमति और संख्या वेरिएंट कॉपी जाएगा। सृजन ज्ञात कूट क्षेत्रों से पढ़ता है पर अधिक लागत के अनुकूल exome अनुक्रमण केंद्रित है, जबकि पूरे जीनोम अनुक्रमण ऐसे enhancers या miRNAs 36 के रूप में गैर-कोडिंग तत्वों में म्यूटेशन की पहचान की सुविधा हो सकती है, जो पूरे जीनोम के लिए अनुक्रमण डेटा उत्पन्न होगा। जीन अभिव्यक्ति डेटा डीएनए अनुक्रमण के दौरान लगाया नहीं है लेकिन, जब से यह जो उत्परिवर्तन (एस) एक कार्यात्मक ड्राइवर होने की संभावना है भविष्यवाणी करना मुश्किल है। इस संबंध में शाही सेना के अनुक्रमण, हालांकि अधिक महंगा है, यह लाभ प्रदान करता है। उत्परिवर्तन बुला ही व्यक्त आरएनए प्रजातियों पर किया जाता है कि इस तथ्य के हित के उत्परिवर्तन एक कार्यात्मक चालक हो सकता है कि संभावना को बढ़ाता है। अनुवर्ती कार्यात्मक परीक्षण भी आरएनए अनुक्रमण के लिए परिवर्तन का एक और अधिक ध्यान केंद्रित सर्वेक्षण अनुमति के अलावायह भी प्रतिरोध के रूप में शक्तिशाली ड्राइवरों सेवा कर सकते हैं कि जीन fusions सहित जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन, वैकल्पिक splicing और उपन्यास कैमेरिक आरएनए प्रजातियों की पहचान करने में सक्षम होने का जोड़ा लाभ प्रदान करता है।
जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन
उदाहरण कमांड चित्रण प्रयोजनों के लिए प्रदान की जाती हैं, लेकिन अधिक विस्तृत दस्तावेज और ट्यूटोरियल संस्थान 16 ब्रॉड से उपलब्ध हैं और NGS विश्लेषण शुरू करने से पहले अच्छी तरह से पढ़ा जाना चाहिए। निम्न आदेशों के सभी उपकरण और संदर्भ डेटा पूर्व स्थापित कर दिया गया है, जिस पर एक प्रणाली पर एक यूनिक्स खोल पर्यावरण के लिए तैयार कर रहे हैं। ये आदेश भी FASTQ फाइलों से युक्त बनती अंत अनुक्रम "माता पिता" और "प्रतिरोधी," विक्रेता से प्राप्त हुआ है और "डेटा" निर्देशिका में रखा गया है का नाम है, दो नमूने से पढ़ता मान। ज्यादातर मामलों में इन आदेशों अनुकूलित किया जाना चाहिए या अतिरिक्त कमांड लाइन ARG का उपयोग कर एक विशेष आवेदन के लिए अनुकूलितuments (जैसे, बीडब्ल्यूए कमांड को "आयकर 8" जोड़ने 8 CPU कोर भर थ्रेड आपरेशन अनुमति देता है)। बेम फ़ाइल में केवल एक नमूना कुछ उपकरण के लिए फ़ाइल स्वरूप आवश्यकताओं के साथ पालन करने के लिए, भले ही वहाँ (जैविक नमूने के संरेखण के लिए आवंटित है) पढ़ें समूहों, अक्सर बेम फाइल करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। समूह के मापदंडों RGID, RGSM, RGPL, RGPU पढ़ें, और RGLB मनमाना नमूना नाम का वर्णन तार, अनुक्रमण मंच, और पुस्तकालय रणनीति हो सकती है।
इन विवो assays बनाम विट्रो में
इन विट्रो चयन द्वारा की पहचान कई प्रतिरोध तंत्र चिकित्सकीय प्रासंगिक हो सत्यापित किया गया है, तंत्र नैदानिक प्रतिरोध के रूप में प्रासंगिक या प्रमुख तंत्र की सेवा नहीं कर सकता है कि वहाँ एक संभावना मौजूद है। इसका एक कारण यह उपचार के लिए प्रतिरोध ड्राइविंग में सूक्ष्म वातावरण के लिए एक आवश्यक भूमिका, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल / सेटअप डी में रहित है कि एक घटक शामिल हो सकते हैंइस प्रकार अब तक iscussed। दरअसल, कई अध्ययनों ट्यूमर कोशिकाओं स्ट्रोमा 37,38 द्वारा प्रदत्त प्रतिरोध की जन्मजात तंत्र जिसका अर्थ stromal कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत हैं जब ट्यूमर कोशिकाओं को मारने में सक्षम हैं कि विरोधी कैंसर एजेंटों अप्रभावी प्रदान कर रहे हैं कि पता चला है। ऐसे स्ट्रोमा प्रेरित अधिग्रहण प्रतिरोध तंत्र की पहचान करने के लिए, एक में इन विट्रो सह संस्कृति या विवो ट्यूमर प्रतिरोध assays में प्रदर्शन कर विचार कर सकते हैं। पूर्व परख काफी जटिल है, कई प्रतिरोध ड्राइविंग में स्ट्रोमा की संभावित भूमिका का पता करने के लिए दवा प्रतिरोधी ट्यूमर xenografts पैदा करने के लिए सहारा है। इस तरह के अध्ययन स्ट्रोमा वास्तव में उत्तरार्द्ध में एक भूमिका निभा सकते हैं जिसका अर्थ है कि इन विट्रो चयन करने के लिए प्रतिरोध रिश्तेदार के दोनों समान 5 और अद्वितीय 39 तंत्र का पर्दाफाश किया है। हालांकि, एक यह एक ऐसी प्रतिरोधी ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए लग सकता है समय की लंबाई और अनुवर्ती जीनोमिक विश्लेषण-complexitie की जटिलता के प्रति जागरूक होना चाहिएइंट्रा-tumoral आणविक और सेलुलर विविधता के कारण है।
लक्ष्य की पहचान
दवा प्रतिरोध तंत्र को उजागर करने के लिए इसके अलावा, इस NGS आधारित जीनोमिक रूपरेखा के दृष्टिकोण को भी रासायनिक जांच के सेलुलर लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। ऐतिहासिक दृष्टि से, कई निष्पक्ष तरीकों मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ युग्मित आत्मीयता शुद्धि, खमीर जीनोमिक तरीकों, आरएनएआई स्क्रीनिंग, और कम्प्यूटेशनल निष्कर्ष 40 दृष्टिकोण सहित जैविक गतिविधियों के साथ कम आणविक वजन रसायनों के सेलुलर कार्रवाई के तंत्र और लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यौगिकों के कार्यात्मक सेलुलर लक्ष्य में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं प्रतिरोध है कि सक्षम phenotypically प्रतिरोधी सेल आबादी, अद्वितीय आवर्तक एकल nucleotide बदलाव (SNVs) या अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान की NGS आधारित जीनोमिक या transcriptomic की रूपरेखा का उपयोग कर दवा प्रतिरोध तंत्र की व्याख्या करने के लिए एक विस्तार के रूप में। टीउसकी मनाया प्रतिरोध तंत्र की एक सबसेट छोटे अणु के प्रत्यक्ष प्रोटीन लक्ष्य सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन में म्यूटेशन आवर्तक शामिल हो सकता है कि इस विचार पर आधारित है। हाल ही में, कई रिपोर्टों विशेष रूप से 9,10 जांच छोटे अणु की सेलुलर लक्ष्य का खुलासा करने के लिए बड़े पैमाने पर कैंसर कोशिका लाइन संवेदनशीलता रूपरेखा सहित अन्य तरीकों के साथ संयोजन के द्वारा, दृष्टिकोण की उपयोगिता मान्य।
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |