Resistencia a los medicamentos para terapias dirigidas es generalizada y la necesidad de identificar mecanismos de resistencia – antes o después de la aparición clínica – es fundamental para guiar las estrategias de gestión clínica alternativas. A continuación, presentamos un protocolo para acoplar derivación de líneas resistentes a los fármacos in vitro con la secuenciación para acelerar el descubrimiento de estos mecanismos.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Caracterización molecular detallada de los genomas tumorales de tecnologías de secuenciación robustas y herramientas de análisis de datos mejorada ha llevado al descubrimiento de alteraciones genéticas clave en tipos específicos de cáncer 1,2. El desarrollo de terapias específicas dirigidas a estas lesiones genéticas, como HER2, BCR-ABL, EGFR y ALK, han mejorado significativamente la calidad de vida de los pacientes 1,2. Sin embargo, a pesar de la especificidad de este enfoque, la respuesta clínica a la mayoría de las terapias individuales ha sido subóptima como resistencia emerge en última instancia. Recientemente, se ha hecho un progreso significativo en la comprensión de las bases moleculares de la resistencia a terapias dirigidas. Curiosamente, se está haciendo evidente que un mecanismo prominente de la resistencia implica actividad de destino / vía persistente. Como ejemplo de ello, receptor de andrógenos (AR) -dirigida tratamiento Enzalutamida de cáncer de próstata conduce a un enriquecimiento de la activación de mutaciones en AR sí, manteniendo AR señalización output en presencia del inhibidor de 3-5. Este conocimiento ha conducido a una agresiva campaña para 1) el desarrollo de antagonistas de tercera generación que pueden seguir para suprimir ambos WT y la función mutante-AR en Enzalutamida resistente CP 3 y 2) identificar posibles nodos intermedios de la señalización AR que pueden ser objeto de intervención terapéutica . Del mismo modo, la resistencia a otras clases de inhibidores como los dirigidos EGFR, BRAF y ABL a menudo conducen a mutaciones que reactivan el adictivo quinasa 1 original.
Con el conocimiento de que la resistencia surge, inevitablemente, en la mayoría de los pacientes, el desarrollo de enfoques para llevar con prontitud estos mecanismos a la luz que permitirá el desarrollo de terapias eficaces de seguimiento. Un enfoque que está siendo ampliamente utilizado es el de analizar la genómica de los tumores refractarios clínicos en relación a los tumores no tratados previamente o -sensibles para identificar enriquecimientos / agotamientos en lesiones genéticas que pueden ser susceptibles de ddescubrimiento alfombra. A pesar de su promesa, hay dos principales inconvenientes de este planteamiento que dificultan el descubrimiento rápido. En primer lugar, el acceso oportuno a material tumoral para la interrogación genómico puede servir como un obstáculo significativo en el movimiento de la terapia para curar. En segundo lugar, la deconvolución de la gran cantidad de lesiones genéticas en el entorno resistente puede ser un reto ya que los tumores pueden presentar significativa intratumoral heterogeneidad 6,7.
A la luz de estos desafíos, se ha incrementado la dependencia de descubrimiento preclínico de los mecanismos de resistencia. Este enfoque puede permitir la identificación de los mecanismos de resistencia importantes antes de los ensayos clínicos 1 que pueden orientar las estrategias alternativas de gestión clínica en los pacientes que llevan estos mecanismos, ya sea antes de la terapia o después de la aparición de resistencias.
Una de estas herramientas de descubrimiento preclínico que está siendo ampliamente utilizada es aplicar RNAi pantallas funcionales imparciales. Para examenplo, Whittaker y sus colegas aplicaron una pantalla de RNAi escala del genoma para identificar que la pérdida de la NF1 media la resistencia a los inhibidores de la RAF y MEK través de la activación vía MAPK sostenida 8. Se encontró que estos hallazgos clínicamente relevante como se observó la pérdida de función de las mutaciones en NF1 en las células tumorales -mutant BRAF que son intrínsecamente resistentes a la inhibición de la RAF y en tumores de melanoma resistentes a vemurafenib activación 8. Sin embargo, a pesar del éxito de este enfoque, muchos objetivos clínicamente relevantes a menudo no están identificados, presumiblemente debido a la tendencia de este enfoque de pérdida de función.
En contraste, una herramienta para el descubrimiento de menos sesgada preclínica de los mecanismos de resistencia implica la generación de líneas celulares resistentes a través de la exposición prolongada a compuesto de interés junto con el perfil genómico o transcriptómica basado en NGS. Este enfoque se ha aplicado con éxito por varios grupos para identificar espontánearecurrentes individuales variantes de nucleótidos o expresión alteraciones que permiten la resistencia 5,9,10. Por ejemplo, una mutación F876L recurrente en AR fue descubierto recientemente en clones resistentes in vitro 3-5 y en xenoinjertos de tumores in vivo 5 antes de la identificación de esta mutación en la clínica 4. Muy recientemente, bhang y sus colegas (2015) 11 utilizado ClonTracer en dos modelos clínicamente relevantes para demostrar que la mayoría de los clones resistentes que surgen durante la exposición prolongada de drogas eran parte de una preexistente subpoblación que sugiere que las mutaciones más funcionalmente relevante es probable que ya preexistente que se convierten seleccionados para durante la selección 11.
En contraste con el perfil genómico de los tumores tratados anteriormente, este enfoque se beneficia de menos heterogeneidad como clones '' homogéneos resistentes se utilizan para el análisis de facilitar la disección genética más precisa de los conductores potenciales. Ademmineral, emocionante, además de la posibilidad de que el descubrimiento de mecanismos de resistencia, este método también se puede aplicar para identificar los mecanismos celulares de la acción y metas de pequeñas moléculas bioactivas para el que esta información es desconocida 10. Dadas las ventajas claras y los múltiples usos de este enfoque, aquí se presenta un protocolo que detalla la implementación exitosa de una pantalla tan preclínico para maximizar el potencial de descubrimientos clínicamente significativas.
Selección de la línea (s) celular: Caracterización del estado genético y la inestabilidad genómica
Sin lugar a dudas, el factor más importante en el descubrimiento de los mecanismos de resistencia con éxito clínicamente relevantes es la selección inicial de la línea celular. Se deben considerar dos factores. En primer lugar, el objetivo de seleccionar la línea de células (s) del mismo linaje / subtipo albergar los rasgos genéticos que definen la enfermedad (por ejemplo., BRAF V600E en el melanoma). Interrogación de los datos transcriptómica y mutación públicamente disponibles para ambas líneas celulares y tumores primarios 30-32 / metástasis para una variedad de indicaciones 33,34 facilitará el proceso de selección. Aunque la identificación de líneas celulares con alteraciones genéticas clínicamente relevantes es ideal, en algunos casos esto puede no ser posible debido a la falta de líneas celulares disponibles o viable debido a factores tales como la dificultad y la longitud del proceso de selección.
<p class="jove_content"> Con respecto al punto anterior, un segundo factor a considerar a continuación, durante la selección de la línea celular es la facilidad o la viabilidad de la resistencia de detección utilizando la línea deseada. Por ejemplo, factores tales como la proliferación y las tasas de mutación intrínsecas pueden afectar en gran medida de la velocidad de descubrimiento. Con este fin, las líneas celulares pueden ser utilizados con una cinética de crecimiento más rápidas y deficiente en mecanismos de ADN MMR en la esperanza de que la aparición de resistencia espontánea puede acelerarse 35. Sobre la base de la base de datos COSMIC, existen varias líneas de células candidato con deficiencia en uno de los dos genes MMR mutados con frecuencia, MSH2 o MLH1 (Cuadros 2 y 3). Alternativamente, si las líneas celulares de interés no existen defectos en el rodamiento en MMR, tratamiento agudo con mutágenos químicos o físicos ADN reactivos tales como el agente alquilante N-etil-N -nitrosourea (ENU) se puede utilizar para mejorar la inestabilidad genómica. Aunque ambos enfoques May S significativamenteHorten el tiempo para alcanzar los clones resistentes y el seguimiento de la secuenciación, las pruebas funcionales estrictas se debe realizar en genes candidatos como un mayor número de no funcional, las mutaciones de pasajeros es probable que surjan. SNVS puede ser ordenaron para maximizar las posibilidades para la identificación de mutaciones funcionalmente relevantes. En primer lugar, la elección de esas mutaciones que son recurrentes en los clones independientes aumentará la probabilidad de estas mutaciones son conductores de resistencia. En el caso de mutaciones recurrentes no se identifican, centrándose en SNVS que se ajustan al mecanismo de acción del fármaco (por ejemplo, la diana de fármaco o un efector aguas abajo conocida de la diana de fármaco) pueden ser significativa. En última instancia, el patrón oro es siempre evaluación experimental de la actividad que confiere resistencia de los SNVS candidatos de expresión de ADNc ectópica en células parentales sensibles a fármacos.ADN vs secuenciación del ARN
Una vez clones resistentes se han generado, el ADN y / o ARNpueden ser secuenciados en función de la necesidad. La secuenciación del ADN, ya sea exoma o secuenciación de todo el genoma, permitirá la identificación de las variantes de la línea germinal y somática, como SNP, indeles y número de copia variantes. Mientras que el más económico de usar la secuenciación del exoma se centra en la generación lee de codificación de las regiones conocidas, la secuenciación del genoma completo generará datos de secuenciación de todo el genoma que puede facilitar la identificación de mutaciones en los elementos no codificantes tales como potenciadores o miRNAs 36. Sin embargo, ya que los datos de expresión génica no se mide durante la secuenciación de ADN, es difícil predecir qué mutación (s) es probable que sea un conductor funcional. En este sentido, la secuenciación de ARN, aunque más costoso, ofrece esta ventaja. El hecho de que la mutación de llamada sólo se realiza en especies de ARN expresadas aumenta la probabilidad de que la mutación de interés puede ser un conductor funcional. Además de permitir un estudio más centrado de mutaciones para la prueba funcional de seguimiento, la secuenciación de ARN tambiénofrece la ventaja añadida de ser capaz de identificar alteraciones genéticas de expresión, corte y empalme alternativo y nuevas especies de ARN quiméricos, incluyendo fusiones de genes que también pueden servir como potentes drivers de resistencia.
Tubería de Bioinformática
Comandos de ejemplo se proporcionan para fines de ilustración, pero la documentación más detallada y tutoriales están disponibles en el Instituto Broad 16 y deben leerse detenidamente antes de comenzar el análisis de NGS. Los siguientes comandos están diseñados para un entorno de shell de UNIX en un sistema en el que han sido pre-instalado todas las herramientas y los datos de referencia. Estos comandos también asumen archivos FASTQ que contiene la secuencia de extremo emparejado lee de dos muestras, llamado "padres" y "resistente", se han recibido del proveedor y se coloca en el directorio "data". En la mayoría de los casos, estos comandos deben adaptarse o optimizados para una aplicación específica utilizando arg de línea de comandos adicionalesdocu- (por ejemplo, añadiendo "-t 8" al comando bwa permite la operación multiproceso en 8 núcleos de CPU). Grupos de lectura (que asignan alineaciones de muestras biológicas), a menudo hay que añadir a los archivos BAM incluso si sólo hay una muestra por cada archivo bam, con el fin de cumplir con los requisitos de formato de archivo para ciertas herramientas. Leer parámetros del grupo RGID, RGSM, RGPL, RGPU y RGLB puede ser cadenas arbitrarias que describen el nombre de la muestra, la plataforma de secuenciación, y la estrategia de la biblioteca.
In vitro vs ensayos in vivo
Aunque varios mecanismos de resistencia identificados por selección in vitro se han verificado para ser clínicamente relevante, existe una posibilidad de que los mecanismos no pueden servir como mecanismos pertinentes o predominantes de resistencia clínica. Una razón para esto puede incluir un papel esencial para el micro-entorno en la conducción de resistencia a la terapia, un componente que está desprovisto en el protocolo experimental / d de configuracióniscussed hasta el momento. De hecho, varios estudios han demostrado que los agentes anti-cáncer que son capaces de matar las células tumorales se vuelven ineficaces cuando las células tumorales se cultivan en presencia de células del estroma que implican mecanismos innatos de resistencia conferida por el estroma 37,38. Para identificar tales mecanismos de resistencia adquiridos inducida estroma, se puede considerar llevar a cabo in vitro co-cultivo o en ensayos de resistencia tumor in vivo. Desde el anterior ensayo es bastante complejo, muchos han recurrido a la generación de xenoinjertos de tumores resistentes a los fármacos para tratar el posible papel del estroma en la resistencia a la conducción. Tales estudios han descubierto ambos idénticos 5 y 39 únicos mecanismos de resistencia relativa a la selección in vitro, lo que implica que el estroma puede de hecho jugar un papel en este último. Sin embargo, hay que ser consciente de la cantidad de tiempo que puede tomar para generar tumores resistentes tales como la complejidad del seguimiento genómica análisis complexities debido a la heterogeneidad molecular y celular intra-tumoral.
Identificación de objetivos
Además de descubrir mecanismos de resistencia a fármacos, este enfoque perfil genómico a base de NGS también se puede aplicar para identificar dianas celulares de sondas químicas. Históricamente, múltiples métodos imparciales han sido utilizados para identificar los mecanismos celulares de la acción y las metas de los productos químicos de bajo peso molecular con actividades biológicas, incluyendo la purificación por afinidad junto con la proteómica cuantitativa, métodos genómicos levadura, el cribado RNAi, y la inferencia computacional enfoques 40. Como una extensión a la elucidación de los mecanismos de resistencia a fármacos utilizando el perfil genómico o transcriptómica basada en NGS de las poblaciones de células fenotípicamente resistentes, la identificación de variaciones únicas recurrentes de nucleótido único (SNVS) o alteraciones de expresión que permiten la resistencia puede ofrecer una visión de dianas celulares funcionales de compuestos. Tsu se basa en la idea de que un subconjunto de mecanismos de resistencia observados puede implicar mutaciones recurrentes en los genes que codifican los objetivos directos de proteínas de la molécula pequeña. Recientemente, varios informes validan la utilidad del enfoque, en particular mediante la combinación con otros enfoques, incluyendo a gran escala de sensibilidad línea celular de cáncer de perfiles, para revelar las dianas celulares de molécula pequeña sondas 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |