건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs) 생체

Summary

우리는 체적 신경 전달 물질 방출의 광학 검출을위한 셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자 (CNiFERs)를 만들 수있는 프로토콜을 제시한다.

Abstract

세포 기반 신경 전달 형광 설계 기자 (CNiFERs)는 신경 과학자 광학적 생체의 뇌에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기위한 새로운 수단을 제공한다. 특정 CNiFER 안정적 특정 G 단백질 결합 수용체, G의 _Q에 커플 _{/ 11} G 단백질 및 FRET 기반 ^칼슘) 검출기 (, TN-XXL를 표현하는 인간 배아 신장 세포에서 생성됩니다. 수용체의 활성화는 FRET 신호의 증가를 이끈다. CNiFER 클론은 도파민에 대한 D2R, 예를 들어, 특정 신경 전달 물질의 고유 수용체를 이용하기 때문에 CNiFERs는 nM의 감도와 초 시간 응답이 있습니다. CNiFERs 직접 뇌에 이식 생체 내에서 볼륨 전송을 측정하기에 이상적 미만 백 ㎛의 공간 해상도와 신경 전달 물질 방출을 감지 할 수 있도록하고 있습니다. CNiFERs 또한 VI 잠재적 교차 - 반응성에 대한 다른 약물을 스크리닝하는데 사용될 수있다VO. 우리는 최근의 GPCR에게 G _{I / O} G 단백질에 그 부부를 포함 CNiFERs의 제품군을 확장했다. CNiFERs은 아세틸 콜린 (ACH), 도파민 (DA)과 노르 에피네프린 (NE)를 검출 할 수 있습니다. 어떤 GPCR이 CNiFER 소설을 생성하는데 사용될 수 있음을 감안할 때 대략 인간 게놈 800 GPCRs에 있다는 것을 우리는 설계, 실현 및 CNiFER 임의의 타입을 테스트하기 위해 여기 일반적인 방법을 설명한다.

Introduction

완전히 신경 뇌에서 통신하는 방법을 이해하기 위해, 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 측정하는 방법을 갖는 것이 필요하다. 생체 내에서 신경 전달 물질을 측정하기위한 몇 가지 잘 확립 된 기술이있다. 하나의 일반적으로 사용되는 기술은 캐뉼라 뇌에 삽입 뇌척수액 소량의 수집 및 고성능 액체 크로마토 그래피 및 전기 검사 ^1을 사용하여 분석되는 미세 투석이다. 미세 투석 프로브 몇 직경 정도의 공간 분해능을 가지며, 예를 들어 ~ 200 μm의 마이크로 프로브 직경 0.5 mm. 이 기법의 시간 해상도는, 그러나, 일반적으로 ~ 5 분 ¹ 이상을 지속 샘플링 간격으로 느립니다. 또한, 분석은 실시간으로 제작되지 않습니다. 다른 기술은 뇌에 삽입되는 탄소 섬유 프로브를 사용하여 고속 스캐닝 순환 전압 전류 법 (FSCV)이다. FSCV 우수한 온도가구강 해상도 (초 단위), 고감도 (나노 몰), 30 μm의 5의 프로브 직경 공간 해상도. 그러나 FSCV는 탄소 전위차 프로브 ^(2)에 전압 특성 산화 및 환원 프로파일을 생성 송신기들로 제한된다.

신경 전달 물질을 측정하는 세 번째 기술은 유 전적으로 인코딩 된 신경 전달 물질 (NT) 바이오 센서 ^(3)를 통해 직접입니다. 이 방법으로 융합 단백질은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) - 기반 형광체 ^(4)의 쌍 또는 순열 GFP ^(5)에 결합 된 송신기에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 생성된다. 앞의 두 방법과 달리,이 바이오 센서는 전적으로 인코딩 된 형질 전환 동물의 생산을 통해 또는 급성 세포 감염 바이러스 제제의 사용과 같은 신경 세포와 같은 숙주 세포의 표면에 발현. 현재까지 유전자 부호화 바이오 센서 만 detectin 개발되어왔다g 글루타메이트와 GABA ^3-5. 이러한 기술에 대한 제한은 nM의 범위에서 낮은 감도 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)를 통해 신호를 예를 들어 송신기, 고전 신경 전달 물질, 신경 펩티드 및 신경 조절의 다수 검출 확대 없게되었다. 실제로, 인간 게놈에서 거의 800 GPCRs에있다.

이러한 부족을 해결하기 위해, 우리는 GPCR을 통해 신호를 어떤 신경 전달 물질의 광학적 측정 자료에 혁신적인 도구를 개발했습니다. CNiFERs (셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자)가 자극하면 [Ca를 ²⁺ 즉이 유전자 부호화 FRET 계 ^칼슘 센서에 의해 검출되어, 세포 내에서의 증가를 유발 특정 GPCR을 발현하도록 유전자 클론 HEK293 세포이다 TN-XXL. 따라서 CNiFERs은 신경 전달 물질 수용체, 형광의 변화에​​ 직접 결합 실시간 광 (R)을 제공하는 변환지역의 신경 전달 물질 활동의 EAD 아웃. 특정 신경 전달 물질에 대한 고유 수용체를 이용하여, CNiFERs 화학 특이성, 친 화성 및 내생 발현 수용체의 시간적 동성을 보유한다. 지금까지, 우리는 CNiFERs 세 가지 유형, 도파민을 검출하는 M1 수용체를 이용하여 아세틸 콜린의 검출을 작성한 D2 수용체를 사용하고 α1a 수용체 ^6,7을 사용하여 노르 에피네프린을 검출하기위한 하나. CNiFER 기술은 GPCR의 유형은 의무가있어 쉽게 확장과 확장 성이다. 이 조브 기사에서, 우리는 설명하고 모든 응용 프로그램에 대한 생체 CNiFERs의 설계, 실현 방법, 테스트를 보여줍니다.

Protocol

본 연구에서 수행되는 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라, 그리고 시내산에서 의학의 아이칸 학교와 캘리포니아 대학 샌디에고에서 IACUCs에 의해 승인되었습니다.

1. HEK293 세포 변형에 대한의 Lentivirus를 GPCR이 발현 생성

1. 상용 소스, 예를 들어, cdna.org에서 특정 GPCR에 대한 cDNA를 가져옵니다. 다르게는, PCR을 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 GPCR 유전자를 증폭한다. 이러한 pCDH-CMV-MCS-EF1-순수하지 않아 (pCDH) 등의 렌티 바이러스 발현 벡터를 얻습니다. DNA를 전파 할뿐만 아니라, 렌티 바이러스를 생성하기 위해이 벡터를 사용한다.
2. PCR에 의한 렌티 바이러스 발현 벡터로 GPCR의 cDNA 클론. PCR의 서브 클로닝에 대한 자세한 내용은, 로렌스 ^(8)을 참조하십시오.
3. 확장하고 제조업체의 지침에 따라 같은 독소가없는 '맥시'준비 키트를 사용하여 GPCR-pCDH DNA를 정화. pCDH이 mutation- 인으로 GPCR cDNA를 클로닝 확인DNA 염기 서열에 의해 무료.
   주 : 앞서 바이러스 생산을위한 DNA를 제출에 넣고 DNA의 순도의 크기를 확인하는 적절한 제한 효소로 소화 분취.
4. 바이러스 코어 시설 등 솔크 연구소의 펜. 대학, 또는 노스 캐롤라이나 대학에서 같은 하나를 사용하여 렌티 바이러스를 생성, 또는 사내에서 ⁹ 생성합니다. T75 플라스크에 HEK 세포의 형질 전환을위한 내 독소없는 DNA의 약 25 μg의 (> 1 μg의 / μL)를 사용합니다. 1.8 ~의 흡광도 비율 (A ₂₆₀ / A _280)를 갖는 DNA가 높은 순도를 확인하십시오.
   주 : / ㎖ 10 ¹¹ -10 ¹² GC는 HEK293 세포의 형질 도입을위한 최적 ~ 바이러스의 역가.

2. 체외에서 배양을 위해 HEK293 / TN-XXL 백본 세포 유형 선택

G는 _{I / O와} 같은 G의 _{Q / (11),} 또는 GPCR의 _G의 G 단백질이 DIC, 예를 들어, G 단백질 결합 특이성을 결정 참고 :G 단백질 키메라가 CNiFER 필요 여부 tates. 예를 들어 G _q를 -coupled 수용체, M1 무스 카린 수용체를 들어, HEK293 / TN-XXL 백본 HEK293 세포 유형으로 (# 3g8)을 선택합니다. G _{I / O} -coupled 수용체를 들어, 키메라 G 단백질 G의 _{qi5 ^10를} 필요합니다. _G의 -coupled 수용체를 들어, G의 _{QS5 키메라는} ^10이 필요하다. 이 프로토콜에서, D2R CNiFER의 구조는 일 예로서 사용된다. _{I / O} G 단백질과 G를 통해 D2R 신호를 안정적으로 키메라 G 단백질, G의 _qi5, 예를 들어, HEK293 / TN-XXL / G의 _qi5이 _ # qi5.6을 표현 HEK293 세포를 필요로한다.

1. 연구 실험실에서 HEK293 / TN-XXL / G의 _qi5 _ # qi5.6 클론 세포를 얻습니다. 참고 : 클론 세포를 다음, HEK293 / TN-XXL G _q를 -coupled 수용체 (# 3g8), HEK293 / TN-XXL / G의 _qi5 (# qi5.6) G에 대한 _{I / O} -coupled 수용체 및 HEK293 / TN -XXL / G _QS5 (# qs5.47) _G의 -coupled 재에 대한수용체를 요청 ^6,7에 따라 자유롭게 사용할 수 있습니다.
2. 성장 및 HEK293 성장 미디어 (표 1) 5 ㎖와 T25 플라스크에 ~ qi5.6에 _ # 90 % 포화 상태 HEK293 / TN-XXL / G의 _{qi5를 확장합니다.} 5 % (v / v)의 CO _2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포를 성장한다.
   주 : HEK293 세포를 배양하는 모든 작업은 표준 멸균 조직 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다.
3. 첫 번째 T25 플라스크에서 미디어를 흡입하여 HEK293 세포를 수확. 부드럽게 PBS 5 ㎖를 추가하고 플라스크를 흔들어 세포를 씻으십시오.
4. PBS를을 제거하고 0.05 % (w / v)의 트립신 / EDTA (표 2) 1 ㎖를 추가합니다. 5 % (v / v)의 CO _2, 37 ℃에서 1 분 내지 2 부화.
5. 세포를 수집하고 15 ML 원뿔 튜브를 멸균하기 위해 전송합니다. 세포 배양 원심 분리기 1000 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 대기음.
6. HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 사용한 혈구 세포의 개수트리 판 블루. 셀 밀도를 계산하고 3 단계로 진행합니다.

3. HEK293의 렌티 바이러스 형질 도입 / TN-XXL / Gqi5 세포

1. 0.7 × 10 ⁶ HEK293 / TN-XXL / G의 _{qi5 세포와} T25 플라스크을 시드. 후 약 1 일, 50 % 컨 플루 언트 될 때까지 ~ ​​5 % (v / v)의 CO _2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포를 성장한다. 남아있는 세포를 동결 (8.2-8.3 단계). 이 세포는 GPCR이 부족 즉 CNiFER 제어하는 CNiFER 될 것입니다.
2. 감염 당일 HEK293 성장 배지 (표 1) 2 ㎖ 총 부피 ¹⁰⁹ GC / ㎖ ~ 최종 농도로 GPCR 발현 렌티 바이러스 (단계 1.4)을 희석. 예를 들어, T25 플라스크에 2ml의 매체에 10 ¹¹ GC / ml의 바이러스의 20 μL를 추가한다.
   주 : 바이러스 역가 정보 바이러스 핵심 기능이 제공되어야한다. 원심 분리기 튜브에 렌티 바이러스와 미디어를 결합하고 부드럽게 씹다. lentiv의 높은 역가irus는 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2)입니다.
3. T25 플라스크에서 미디어를 대기음. 단계 3.2에서 바이러스 / 미디어 혼합물의 2 ML을 추가합니다. 5 % (v / v)의 CO _2와 37 ° C에서 T25 플라스크 O / N을 품어.
4. 감염 1 일 후, 바이러스 / 미디어 혼합물을 대기음 및 HEK293 성장 미디어를 포함 퓨로 마이신로 교체 (2 μg의 / ㎖ 표 1). 퓨로 마이신은 형질 세포에 대한 선택합니다. ~ 1~2일 후, 약 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % (V / V) CO _2, 37 ℃에서 플라스크를 인큐베이션.
5. 단계 4.1에서 10 점 작용제 / 활성 곡선을 생성하기위한, 피브로넥틴으로 피복 된 96 웰 플레이트 (투명 바닥 검정색)을 준비한다. 멸균 후드에서 96 웰 플레이트의 행 A와 B에서 잘 당 50 μL의 피브로넥틴 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 접시를 품어. PBS와 린스 당 5 분 동안 두 번 씻어. HEK293 성장 배지의 50 μl를 첨가하고, 5 % (V / V) CO _2, 37 ℃에서 O / N을 _{배양한다.}
   참고 : Fibron을ectin 처리 된 판은 시판되고있다.
6. 단계 2.3-2.6 (표 2)에 설명 된대로 T25 플라스크에 세포를 수확.
7. HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. FACS 분석을위한 세포의 1.5 ml의와 T25 플라스크을 시드. 또한, 냉동 및 저장을 위해 세포를 1 ㎖와 T75 플라스크을 시드 (단계를 참조 8.2-8.3)
8. 10 포인트 곡선 작용제를 들어, 웰 당 세포 현탁액 100 ㎕와 함께 (단계 3.5) 피브로넥틴 - 코팅 된 96- 웰 플레이트의 처음 두 행 (A 및 B)을 시드.
9. ~ 1-2일 후, 5 % (V / V) CO _2, 37 ℃ ~ 약 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 HEK293 A를 T25 플라스크하는 T75 플라스크에서 성장하는 세포를 96 웰 플레이트를 인큐베이션.

4. FACS 및 단일 CNiFER 클론의 분리

1. 10 점 작용제 활성 곡선을 생성하는 96 웰 플레이트를 사용한다.
   주 : (FACS) 분석을 형광 활성 세포 분류를 시작하기 전에,이 확인하는 것이 중요작용제 응답 (10 점 작용제 곡선)에 대한 형질 세포 검사에 의한 GPCR의 발현. 이 시험은 형광 플레이트 판독기를 사용하여 수행된다.
   1. 10 점 작용제 활성화 곡선 약물 플레이트를 준비합니다. 문헌에서 결정될 수있다 EC ₍₅₀₎ 예측 브래킷 (10) 다른 작용제 _농도를 선택합니다.
      참고 : CNiFER 판 3 희석 약물 판은 1 조정 (중복)에 각 농도의 3 배를 포함합니다. 예를 들어, D2 CNiFER를 테스트하기위한 약물 플레이트는 3 배의 농도에서 도파민 (10) 서로 다른 농도를 포함 0.2, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 및 1000 nM의. CNiFER 판에 따라서 도파민의 최종 농도는 0.067, 0.167, 0.333, 1.00, 1.67, 3.33, 6.67, 10.0, 16.7, 333 nm의 수 있습니다.
   2. 인공 뇌척수액 (ACSF) (표 1)을 사용하여 효능 제 용액을 준비한다. 'ACSF', 예를 들어, A1 및 A2 두 개의 우물을 사용하여,와 '더 셀', 예를 들어, B1 및 B2 두 우물.
      주 : 일련의 희석 방법을 사용하여 약물의 상이한 농도를 준비한다. CNiFER 클론 및 약물 농도 (그림 3)을 추적하는 템플릿을 만듭니다.
   3. FRET 측정 및 솔루션 전송을 수행하기위한 96 웰 형광 플레이트 리더 프로그램 소프트웨어를 사용합니다.
      1. 37 ° C에 플레이트 리더 온도를 설정합니다.
      2. TN-XXL과 FRET을 측정, 436 ± 4.5 nm의 (중앙 ± HWHM)로 여기 파장을 설정합니다. eCFP과 황수정에 대한 527 ± 7.5 nm의 485 ± 7.5 nm의 방출 필터를 설정합니다. 각각 eCFP과 황수정의 컷오프 (475)에 필터와 515 nm의를 설정합니다.
      3. 485 nm 내지 527 nm의 180 초의 총 매 4 초에서 방출을 측정하는 플레이트 판독기 프로그램. 30 초를 수집 한 후, CNiFER 접시에 100 μL에 3 배 약물 플레이트에서 50 μl를 제공 할 수있는 옵션을 선택합니다베이스 라인 형광.
   4. 행 A와 B에서 미디어를 대기음하고있는 96 웰 CNiFER 플레이트 ~ 90 %의 합류 (단계 3.9)에 ACSF의 100 μl를 추가합니다.
   5. 96 웰 CNiFER 플레이트와 플레이트 리더로 ​​'3 배'약물 플레이트를 넣습니다. 37 ° C에서 접시를 평형 ~ 30 분을 허용합니다. 그리고, 프로그램을 시작한다.
   6. , 플레이트 리더 데이터를 분석 스프레드 시트에 형광 값을 보냅니다. CNiFERs와 우물에서 (세포없이 우물에서 각각의 신호에 대해 수행) 배경 측정을 뺄 수식을 만듭니다. 형광 강도가베이스 라인-자극 사전 정상화, F _황수정 (t)는 / F _황수정 (베이스 라인) 및 FRET 비율 (ΔR / R.,는 식 1)을 계산 피크 응답 527 nm 내지 485 nm의 배출에서를 사용하여 (단계 11 참조 ).
      참고 작용제와 ΔR / R에 큰 변화가있을 경우,이 GPCR의 발현을 나타내는 하나의 FACS 분석 (단계 4.2)로 진행할 수있다. 일 경우감수는 칼슘 2 ⁺ 반응을 테스트하고 그 FRET 기반 센서가 작동 확인, 예를 들어, A21387을 ^칼슘 이온 운반체를 사용하여 문제를 해결, 작용제와 더 FRET 응답하지 않습니다. 이온 운반체가 작동하는 경우, 수용체 가능성이 발현되지 않았다.
2. FACS 하루전, 피브로넥틴으로 코팅 된 네 개의 96- 웰 플레이트를 준비 정렬 된 세포를 수집한다 (단계 3.5 참조). HEK293 성장 배지의 50 μl를 첨가하고, 5 % (V / V) CO _2, 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
3. 5 % 준비 (/ w를 V) BSA PBS (5 ㎍ / 100 mL) 및 멸균 병에 필터 (0.2 μm의).
4. T25 플라스크에 성장 세포 (참조 단계 2.3-2.5, 표 2)를 수확. 5 %의 PBS (w / v)의 BSA 4 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 원심 분리기.
5. (/ V W) PBS에서 BSA가 ~ 5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 최종 농도를 제공하는 매체를 흡인하고, 5 % ~ 5 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁.
   참고 : FA 확인세포 밀도 및 정렬 조건에 대한 특정 요구 사항에 대한 CS의 핵심 시설.
6. 대단히 짧은 시간을 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너로 재현 탁 세포를 필터링합니다. 바닥 튜브 라운드 5 ml의 폴리 프로필렌에 세포를 전송합니다. FACS 시설에 전송을 위해 얼음에 튜브를 놓습니다.
7. FACS 시설에서 형질 도입 된 HEK293 세포를 정렬한다. FACS에 매개 변수가 사이토 다음과 같이 흐름 프로그램 : 샘플 홀더, 노즐, 20 PSI 100 μm의 4 ° C를 설정합니다. 사전 정렬 분석을 바탕으로, 선택 세포, 즉, 큰 eCFP 형광 (eCFP 여기, eCFP 방출) 및 대형 FRET (eCFP 여기, 황수정 방출) 형광을 가지고 '게이트'(아래 결과, 그림 2 참조를 선택 ).
8. 입금 개별 잘 HEK293 퓨로 마이신과 함께 성장 배지의 50 μl를 함유 한 클론 당으로, 단계 4.2에서 제조 된 96- 웰 플레이트로 정렬 셀. (퓨로 마이신에 따을 HEK293 성장 미디어의 50 μl를 추가상상력 1) 잘 당 100 μL의 총. 5 % (v / v)의 CO _2와 37 ° C에서 세포 O / N을 유지한다.
   참고 : HEK293 성장 미디어 형질 세포의 선택 퓨로 마이신이 포함되어 있습니다.

5. 배양 및 정렬 된의 확장, 클론 CNiFERs

1. 각 웰에서 이전 미디어의 50 μL를 제거하고 신선한 HEK293 성장 배지 50 ㎕를 함유하는 퓨로 마이신 (표 1)로 교체하여 96 웰 플레이트에서 CNiFERs을 유지한다. 2-3주 후, 90 %의 합류 ~ 때까지이마다 5 ~ 7 일을 반복합니다.
2. 부드럽게 용지를 흡입하고 PBS로 한번 부드럽게 세척하여 수확 CNiFER 세포. PBS를를 제거하고 트립신 / EDTA (/ V 승) 0.05 %의 20 μl를 추가합니다. 5 % (v / v)의 CO _2, 37 ℃에서 1 분 내지 2 부화.
3. 트립신 처리 된 세포에 HEK293 성장 미디어 100 μl를 추가하고 세포를 재현 탁. 400 ㎕의 신선한 HEK293 성장 미디어 재치를 포함하는 24 웰 플레이트에 내용을 전송시간 퓨로 마이신. 24 웰 플레이트에 각 웰 5-7일 90 % 합류 ~까지 HEK293 성장 배지 250 μl를 대체하여 세포를 유지한다.

6. 형광 측정 플레이트 리더를 사용하여 FRET 응답을 바탕으로 후보 CNiFERs를 확인

참고 : 원래 클론의 많은 성장을 실패 이후 네 96 웰 플레이트 FACS를 다음으로> 생존과 24 웰 플레이트 단계로 확장 100 검증 가능한 클론이 있어야합니다. 잠재적 인 후보 CNiFERs를 확인하려면, 동족 작용제, 예를 들어, D2R에 대한 도파민과 FRET 응답을 3 점 분석을 사용합니다.

1. 세포가 ~ 24 웰 플레이트에서 90 %의 합류 때, 부드럽게 미디어를 대기음. 0.05 %의 ~ 100 μl를 추가 (W / V) 트립신 / EDTA 5 % (v / v)의 CO _2와 37 ° C에서 1 ~ 2 분 동안 품어. 트립신 처리 된 세포에 HEK293 성장 미디어 400 μl를 추가하고 부드러운 분쇄하여 세포를 섞는다.
2. CLO의 초기 스크리닝을위한 3 점 작용제 곡선 설정NES. 즉 각 CNiFER 클론의 경우, 세 개의 웰을, 예를 들면, A1, A2, A3의 각각에 세포 현탁액 100 ㎕ (~ 4 × ¹⁰³ 세포 / 웰)를 24- 웰 플레이트, 분취 량의 웰 중 한 피브로넥틴 코팅 된 96 웰 플레이트 (일반 바닥 블랙) (단계 3.5 참조).
3. HEK293 성장 매체의 1000 μL (1.2 ㎖의 최종 부피)를 함유하는 12 웰 플레이트에 세포 현탁액의 나머지 ~ 200 μl를 옮긴다. 90 % 합류 ~까지 5 % (V / V) CO _2, 37 ℃에서 두 플레이트를 인큐베이션. 96- 웰 플레이트는 형광 분석을위한 것이고 12- 웰 플레이트 성장과 복제를 확장하기위한 것이다.
4. 3 점 분석을 위해, 0.1, 1.0-있는 작용제의 세 가지 농도 및 특정 GPCR에 대한 10 배의 EC _{(50)을 결정한다.} 단계 4.1.1-4.1.2에 기재된 약물 플레이트 작용제 농도를 준비한다. 4.1.3-4.1.5 단계에서 설명한 바와 같이 형광 플레이트 판독기 분석법을 수행한다.
5. FR 계산단계 4.1.6에 설명 된대로 ET 비율 (ΔR / R). 다시 동결 적절한 감도 및 확장을 위해 가장 FRET 응답이 CNiFERs을 선택하고보다 포괄적 인 분석 (7 단계).
6. 단계 6.5에서 선택하고, 12 웰 플레이트에서 성장하는 클론의 경우, 제거하고 HEK293 성장 미디어 매 5 ~ 7 일의 600 μl를 교체 %의 합류 90 ~까지.
7. 점차적으로 6 웰 플레이트에 12 웰 플레이트에서 클론을 확장 한 다음 T25 플라스크에 (2.3 단계 - 2.6 및 표 2). 설명 된대로 T25 플라스크 ~ 90 %의 합류, 수확 세포 인 경우 (2.3-2.5 단계). HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁.
8. HEK293 성장 배지 9 ml를 가진 T75 플라스크에 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. 액체 N ₂ (8.2-8.3 단계)에 cryoprotection 및 저장에 대한 세포 현탁액의 나머지 4 ml를 사용합니다. 팔 1.5 ML의 cryotubes를 준비하고 얼음에 배치합니다.
9. T75 플라스크에서, 미디어 w 대체하여 세포를 유지i 번째 신선한 HEK293 성장 미디어, 예를 들어 70 ~ 80 %의 합류 때까지 10 ml의 모든 3~5일, 후 ~ 1~2주.

형광 측정 플레이트 리더를 사용하여 CNiFER 클론 7. 최종 선택

1. 플레이트 리더 분석 전날 :
   1. ~ 90 % 합류 T75 플라스크에서 수확 세포 (표 2 단계 2.3-2.6 참조). 잘 세포 현탁액의 ~ 100 μL와 5 × 10 ⁴ /에서 96 웰 피브로넥틴 코팅 된 플레이트 (일반 바닥과 검은 색) 시드. 참고 : 하나의 복제는 하나의 96 웰 플레이트에 배포됩니다.
2. 비 특정 CNiFER 응답에서 특정 효능 반응을 구별 CNiFER 클론의 종합 심사를위한 약물 플레이트를 준비합니다.
   1. 전체 용량 - 반응 곡선을 생성하기 위해 상기 예측 된 EC _(50)의 주위에 10 개의 작용제의 농도를 선택한다. '더 셀'과 'ACSF'에 대한 두 우물 두 개의 우물을 사용합니다.
   2. 비특이적 반응을 결정하기 위해, 선택 THR12 가지 신경 전달 물질 또는 변조기 (72 웰) (그림 3)의 전자 농도. 아고 니스트처럼, 약물 판 중복의 3 배 농도가 포함되어 있습니다. 예를 들면, 100 (50)의 3 배의 농도 1,000 아세틸 글루타메이트, 오렉신, VIP, 아데노신, 세로토닌, 노르 에피네프린, GABA, 물질 P, 멜라토닌, 소마토스타틴 및 히스타민, 각각 세 가지 농도 μL 및 3000 nM의 96 웰 약물 플레이트에로드됩니다.
3. 단계 4.1.3-4.1.5에 설명 된대로 솔루션 전송을 FRET을 측정하고 수행하는 형광 플레이트 리더의 매개 변수를 설정합니다.
4. 전체 투여 량 반응 곡선을 분석 피크 FRET 비율 (ΔR / R) (단계 4.1.6), 로그 작용제 농도의 함수로서 플롯을 계산하고 힐 방정식 (단계 11.4)을 장착한다. EC의 _50, 힐 계수 및 최대 FRET 비율을 결정합니다. 함수 오와 12 다른 신경 전달 물질 / 변조기, 플롯 피크 ΔR / R의 경우F 약물 농도.
5. 다른 신경 전달 물질 작용제 (비 특정 응답)에 큰 FRET 비율은 동족 효능에 대한 적절한 EC _(50)와 거의 또는 전혀 배경 응답이 10 ~ CNiFER 클론을 선택합니다.

8. 동결 다시 선택 CNiFER 클론

1. 개인 CNiFER 클론의 ~ 90 % 합류 T75 플라스크를 사용합니다. 설명 된대로 수확 세포 (2.3-2.5 단계, 표 2). 세포를 냉동, HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 열 1.5 ML의 cryotubes 레이블과 얼음에 설정합니다.
2. 예를 들면, 20 %의 5 ml의 (V는 / v)의 DMSO / 미디어 혼합물을 부드럽게 세포 현탁액을 5 ㎖ (최종 혼합 20 % HEK293 성장 매체 (v / v)의 DMSO로 1 : cryoprotection 들어, 셀 1 믹스 DMSO 농도)는 10 %이다.
3. cryotubes의 각으로 나누어지는 1 ml의. (자료 참조) 거품 절연 상자, -80 ° C의 냉동고 O / N 세포와 튜브를 고정. 전송 액체 비누에 cryotubes장기 보관 용 ID 질소.

마우스 텍스로 9 CNiFER 주입

1. 수술 전에 오토 클레이브의 모든 수술 도구를 소독. 70 % 에탄올로 닦아 깨끗한 실험실 기저귀를 내려 놓고하여 수술에 대한 반 멸균 필드를 준비합니다.
2. 수직 전극 풀러에 유리 모세관 (0.53 mm의 ID)를 잡아 당겨 CNiFER 주입 피펫을 준비합니다. 어떤 한 쌍을 사용합니다. 5 좋은 팁 집게 40 μm의 ~의 직경에 전극의 끝을 중단합니다.
   참고 :이 최고의 계수와 스테레오 줌 현미경으로 수행됩니다.
3. 이소 플루 란과 성인 (출생 후 하루 60 ~ 90) C57BL / 6 마​​우스를 마취 : 4 % (v / v)의 유도 1.5 ~ 2.0 % (v / v)의 유지 보수를 위해. 마우스가 완전히 마취되어 있는지 확인 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다.
   다시 핀치 주기적으로 마취의 깊이를 재평가 수술을 통해 수염 경련을 평가 :합니다.
4. 페이지에 안과 연고와 눈을 커버하지 못하 건조. 귀 막대와 정위 프레임에 마우스를 탑재합니다. 직장 프로브에 의해 조절 가열 패드를 사용하여 37 ° C에서 마우스 체온을 유지한다.
5. 지역을 동물 전기 면도기와 12mm로 약 5mm 쉐이브. Betadine 70 % (v / v)의 이소프로판올 다음에 적용됩니다. 절단 두개골 표면 위에 피부를 제거 메스 블레이드를 사용한다. 두개골 표면으로부터 골막을 제거 메스 블레이드를 사용한다. 노출 및 정위 수술 ^11에서 기술 한 바와 같이, 두개골의 표면을 세정.
6. 정수리와 안테 - 후방 (A / P) 및 메디 오 - 측면 (M / L)를 기록하는 빈 유리 피펫을 낮 춥니 조정합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 참조하면, 주사 부위의 위치를​​ 계산한다. 표적 부위로 피펫 시프트 이후의 창 형성 용 두개골을 표시한다. 세틴 등의 알을 참조하십시오. 설치류 ^(11)와 정위 주사에 대한 자세한 내용은.
   참고 : 주입 및 윈도우의 사이트가 등록에 따라 달라집니다이온은 공부 피질에서 신경 전달 물질 또는 펩티드 방출 돌기의 분포한다. 예를 들어, 최근의 간행물 ^7에서, 정위는 +1.0 +2.0 mm의 A / P 및 +1.0 +2.0 mm M의 /에 L로 고전적 조건 중에 도파민 방출 생체 이미징 전두엽 피질에 CNiFER 세포를 주입하기 위해 사용 된 좌표 .
7. 이전 ^12,13 바와 같이 2mm X 3mm 박형화 두개골 창을 형성한다.
   참고 : 창에 뼈가 15 ~ 20 μm의 두께이어야한다. 뼈가 충분히 ^{12, 13를} 얇게하는 경우 두개골 표면이 습하게되면 뼈에 작은 흰 반점이 표시되지해야합니다.
8. 주입하는 세포를 준비하는 동안 습기를 유지하기 위해 창에 스펀지를 담가 ACSF를 놓습니다.
9. T75 플라스크에 ~ 80 %의 포화 상태에서 재배 된 CNiFER 클론을 수확. 미디어를 기음과 멸균 PBS로 세포를 씻어.
   참고 : 트립신이 단계를 생략한다.
10. 오 PBS를 제거하고 10 ml에 사용F ACSF 플라스크의 바닥으로부터 세포를 이동시키다. 씹다 세포는 세포 덩어리를 떼어 놓다합니다. 원심 분리기는 ACSF 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁합니다. ACSF에 덮여 펠렛을 떠나, 1,400 XG에 30 초 동안 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. 이 단계는 정지 세포의 덩어리를 떠난다.
11. , 미네랄 오일 단계 9.2에서 제조 된 주입 피펫을 백필 nanoinjector에 피펫을로드하고 기름의 작은 구슬을 꺼내 플런저를 전진. 마우스 제조 근처 파라핀 플라스틱 필름의 스트립 상 CNiFER 세포 현탁액의 5 μL를 넣어. 어느 CNiFERs을 그리거나 뽑아 피펫으로 CNiFER 세포를 제어 할 수 있습니다.
12. 대상 X에 피펫을 이동하고 Y 좌표, 즉, A / P 및 M / L 단계 9.5에서 언급했다. 얇아진 두개골을 관통, 피펫을 내린 ~ 두개골 표면 아래 200 ~ 400 μm의이 층 피질의 2/3에 CNiFER 세포를 입금하는 것을 계속한다.
13. nanoinjec와 깊은 사이트에서 ~ CNiFER 세포의 4.6 NL을 주입토르, 노트 석유와 세포 인터페이스에서 운동 후 세포를 분배하기위한 5 분을 기다립니다. ~ 100 μm의 피펫을 철회하고 CNiFER 세포의 또 다른 ~ 4.6 NL을 주입, 5 분을 기다립니다. 그런 다음 CNiFERs의 역류를 방지하기 위해 천천히 부드럽게 피펫을 철회. 하나 이상의 인접 부위에 주사를 반복합니다.
14. 반복 주입 제어 HEK293 세포 (즉, HEK293 / TN-XXL / G의 _qi5이 부족 복제 GPCR)와 9.8-9.12 단계를 반복합니다. CNiFER을 분리하고 ~ 200 μm의에 의해 세포 주입 사이트를 제어 할 수 있습니다.
15. 세포 주입을 완료 한 후, ACSF으로 얇게-두개골 창을 씻어 두개골이 마를 때까지 기다립니다. 창 위에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 방울 (원료 참조)를 적용하고 신속 접착제 위에 미리 잘라 멸균 커버 유리를 배치했다. 부드럽게 초간 두개골에 대해 커버 글래스를 누른다. 2 분 ^{12, 13의} 접착제 건조를 할 수 있습니다.
16. 치과 용 시멘트 및 양식 AW와 커버 유리의 가장자리를 밀봉창 주위 엘은 침지 목적을 위해 물을 개최합니다.
17. 촬영하는 동안 마우스의 머리를 고정를 들어, (치수 및 재료에 대한 자세한 내용은 ^{14 참조)} 창 뒤에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울을 가진 맞춤형 헤드 막대를 연결합니다. 접착제가 완전히 건조 후 추가로 맞춤형 헤드 막대를 강화하기 위해 추가 치과 용 시멘트를 추가 할 수 있습니다.
18. 치과 용 시멘트의 층으로 창을 제외한 두개골 표면의 나머지 부분을 커버. 피부의 가장자리는 시멘트에 포함되어 있는지 확인하고 20 분 동안은 건조 할 수 있습니다.
19. 수술 후, 이소 플루 란 투여를 중지하고 완전히 마취에서 회복 될 때까지 장에 가열 패드에 마우스를 둡니다. 수술 후 진통제 5 재수에 대한 % 식염수 (SC)에서 (w / v)의 포도당과 0.05 mg의 0.1 / kg 프레 노르 핀 (IP, 인스턴트 버전)를 주입한다.
    인간 CNiFERs에 대한 잠재적 인 면역 반응을 최소화하기 위해 20 μL / 100g의 시클로 매일 마우스를 주입 참고 :sporine (IP) CNiFERs의 주입 전에 하루를 시작.
20. 음식과 물에 대한 자신의 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다.

CNiFER 클론의 생체 내 이미징에서 (10)

참고 : 라이브 영상이 이광자 현미경 및 헤드의 고정 장치를 사용하여 마우스를 행한다. 어떤 마취는 영상 세션 동안 필요하지 않습니다. 웨이크 상태에서 동물을 묘화 할 때, 응력 수준을 감소시키기 위해 한 번에 몇 시간에 머리 받침을 제한한다. 음식과 물을 위해 그것을 이미징 세션 사이의 홈 케이지 동물을 돌려줍니다. 잠재적 인 스트레스는 인클로저에 마우스의 일부를 실내 조명을 어둡게하고 주변에 의해 최소화된다.

1. 수술 후 당일, 헤드 고정 프레임에 두개골에 이식 금속 헤드 막대를 돌려서 이미징 플랫폼에 마우스를 탑재합니다.
   주 : 웨이크 마우스 촬상하면, 촬상 세션 인해 헤드 구속 장치에 의한 전위 응력에 몇 시간을 초과해서는 안된다.
2. 10 배 (0.30 NA)와 40 배 (0.80 NA) 침수 목표에 장착 된 두 개의 광자 이미징 현미경 헤드 억제 마우스로 영상 플랫폼을 놓습니다.
3. 460 nm의 황수정을 측정 내지 560 nm의 측정 eCFP에 대한 nm의 500 및 520에 걸쳐 505 nm의 대역 통과 필터에서 이색 거울을 가지고 FRET 영상 (eCFP과 황수정)에 대한 필터 큐브를 삽입합니다.
4. 잘 포함 얇게-두개골 창에 ACSF를 추가하고 ACSF에 침수 목표를 내립니다. 창 아래의 피질과 혈관의 표면을 찾을 수은 램프와 GFP 필터 큐브와 함께 접안 렌즈를 사용합니다.
   참고 : 혈관의 패턴은 영상의 반복 일 동안 이미지를 동일한 지역을 찾아하는 데 도움이됩니다. 수동으로 GFP 필터 큐브와 수은 램프를 사용하여 세포를 통해 피질의 표면에 초점을 맞춤으로써 CNiFERs를 찾습니다 40X 물 침지 목표로 전환합니다.
5. 두 광자 이미징 설정합니다. 액세스 포인트를 선택두 광자 이미징을위한 propriate 빛의 경로입니다. 전형적인 상업적 시스템에있어서, 두 개의 광자 촬상 모드로 전환하여 비 descanned 검출기의 광전자 증 배관 튜브 (PMT가)에 광을 리디렉션하도록 소프트웨어를 사용한다. , 근적외선 펨토초 펄스 레이저를 켜고 820 nm의 파장 5-15 %의 전력 설정을 선택합니다. 주 : 5 %의 전력은 일반적으로 시료에서 ~ 25 mW의 제공.
6. 최대 값에 가까운 PMT1 & PMT2 전압의 PMT에 따라 일반적으로 700-1,000 V를 설정합니다. 각 채널에 대한 1 게인을 설정 상기 목적을위한 Z 위치를 제로.
7. ~ 대뇌 피질의 표면에서 100 ~ 200 μm의 목적을 내리고 XY 스캔을 시작합니다. CNiFER 형광의 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해, 레이저 전력, 이득, 각각의 채널의 PMT 전압, 즉 eCFP 및 레몬을 조정한다.
8. backgroun에뿐만 아니라 CNiFER 세포를 포함하는 영역에 화상을 제한하는 소프트웨어에서 줌 기능을 사용하여D 지역. 픽셀 당 4 μs의 하나의 프레임을 2 초마다 (0.5 Hz에서)보다 더 느린 스캔 속도를 사용합니다. 적당한 신호대 잡음비, 예를 들어, 칼만 2 라인 평균화 평균화 라인을 조정한다.
9. 비행기 당 약 3 ~ 4 세포를 둘러싸고, 관심 영역 CNiFER 세포 주위 (ROI)을 그립니다. 투자 수익 (ROI) 평균 강도의 설정 실시간 분석. 시간이 지남에 CNiFER 형광을 모니터링하는 인수를 시작합니다.
10. 전에 실험 조작, 예를 들어, 사용자의 결정에 따라 전기 자극, ChR2 자극, 행동, 중 CNiFERs에서 형광을 수집합니다.
11. 촬상 실험이 완료 될 때, 홈 케이지에 마우스를 반환한다. 원하는대로 일에 걸쳐 이미지를 반복합니다. 경우 셀이 같은 영상 필드 (단계 10.4)로 다시 방향을 미리 획득 낮은 배율 혈관 화상을 참조 이미지 다시.
    주 : 이식 CNiFERs 적어도 7 일간 묘화 될 수있다.

11. 데이터 분석

오픈 이미지 파일은 투자 수익 (ROI)의 CNiFERs과 배경에 대해 하나의 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 각 ROI의 두 채널에 대한 '시리즈 분석'을 선택합니다. 탭으로 구분 된 파일로 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 수출 평균 형광 강도.

형광 값을 분석하는 수학적 소프트웨어 (자료 참조) 프로그램을 사용하십시오. 저역 통과 필터 (0.3 Hz에서) 각각의 신호는 다음과 eCFP 시트린 형광 강도로부터 각 ROI의 배경 형광을 뺄.

기준선 평균 형광을 계​​산하고 FRET 비 ΔR (t) / R을 측정하기 위해 수학 식 1에 기재된 비율을 계산한다.

CNiFERs의 감도를 결정하기 위해 로그 작용제 농도의 함수로서 FRET 비율을 플롯. 과학적 통계 소프트웨어 및 힐 식 (식 2)를 사용하여 EC ₍₅₀₎ 및 힐 계수 (n)를 결정하는 힐 식으로 장착한다.

Results

특정 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 유전자 코드 [칼슘 2 ^+] 센서, TN-XXL하십시오 CNiFER 안정적 적어도 두 개의 단백질을 발현하도록 유전자 조작 된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포에서 파생됩니다. TN-XXL은 ^칼슘 이온 ^-6,15-의 질문에 답변 시안과 노란색 형광 단백질 각각 eCFP과 황수정, 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 겪는다. 내생 G _q를 G 단백질에 그 부부의 GPCR의 활성화는 [칼슘 2 ^+]를 PLC / IP ₃ 경로를 통해 TNXXL ^칼슘 검출기에서 FRET의 증가로 이어지는 (그림 1) 세포질의 증가를 발생시킨다.

Discussion

CNiFERs의 생성은 광학적으로 생체 내에서 뇌의 신경 전달 물질의 방출을 측정하기위한 혁신적이고 독특한 전략을 제공합니다. CNiFERs 이상적으로 신경 전달 물질에 대한 예 extrasynaptic 해제, 볼륨 전도를 측정하기에 적합합니다. 중요한 것은, 각 CNiFER은 뇌의 신경 전달 물질의 농도의 변화 생리 광 측정을 제공하는 천연 GPCR의 특성을 가지고있다. 지금까지 CNiFERs은 아세틸 콜린을 검출 생성 된 (M1-CNiFER) ^(6), 도파민 (D2-CNiFER) ^(7)과 노르 에피네프린 (α1a-CNiFER) ^7.

주에서, CNiFER는 GPCR을 통해 신호하는 신경 전달 물질 생성 할 수 있습니다. G의 _Q G 단백질을 통해 GPCR 신호가 더 이상 수정이 HEK293 세포에 필요하지 않은 경우에 대해. G 통해 신호의 GPCR은 _{I ...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pCDH-CMV-MCS-EF1-퓨로	System Biosciences	CD510B-1	복제: 렌티바이러스
생성 12 x 75 *BD Falcon High Clarity 폴리프로필렌 라운드 바닥 테스트 튜브	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Falcon 세포 여과기	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
96 웰 플레이트, 평평한 바닥, 투명	코닝	3596	FACS
96웰 세포 배양 플레이트	코닝	CLS3997	Flexstation
Optilux 블랙 클리어 바텀	코닝	3603	Flexstation
Flexstation 피펫 팁	분자 장치	9000-0911	Flexstation
아세틸콜린 염화물	시그마-알드리치	A2661	플렉스스테이션
노르에피네프린	Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
도파민 염산염	시그마-알드리치	PHR1090	플렉스스테이션
GABA	시그마-알드리치	A2129	플렉스스테이션
히스타민	시그마-알드리치	H7125	플렉스스테이션
글루타메이트	시그마-알드리치	49621	플렉스스테이션
에피네프린	시그마-알드리치	E4642	플렉스스테이션
소마토스타틴	시그마-알드리치	S1763	플렉스스테이션
5HT	Sigma-Aldrich	H9523	Flexstation
VIP	알파 다이어그노스틱스	SP-69627	Flexstation
Orexin A	Alpha Diagnostics Inc.	12-p-01	Flexstation
Substance P	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
아데노신	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
멜라토닌	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
형광판 리더 및 소프트웨어	분자 장치	Flexstation 3	Flexstation
Glutamax를 함유한 DMEM(고포도당);	Life Technologies	10569-010	조직 배양
태아 소 혈청	Life	Technologies 10082-139	조직 배양
펜/스트렙  항생제	Life	Technologies 15140-122	조직 배양
푸로마이신	InvivoGen	ant-pr-1	조직 배양
피브로넥틴	Sigma-Aldrich	F0895	조직 배양
CoolCell LX 무알코올 제어 속도 세포 동결 상자	Bioexpress	D-3508)	조직 배양
시아노아크릴레이트 접착제	록타이트	록타이트 no. 495	수술 및 입체 사출
플라스틱 파라핀 필름	VWR	파라필름®	수술 및 입위 주사
나노 인젝터	Drummond	3-000-204	수술 및 입위 주사
유리 전극	Drummond	3-000-203G	수술 및 입위 주사
핸드 헬드 드릴	OSADA	Exl-M40	수술 및 입위 사출
드릴 용 버	Fine Scientific	19007-05; 19007-07)	수술 및 입위 주사
살균 목욕	FST	18000-45, 핫 비드 살균기	수술 및 입위 주사
이소 플루란 챔버 / 마스크	하이랜드 의료 장비	564-0427, 이소 플루란 기화기, O2 유량계, 갱 밸브가있는 HME 109 탁상용 마취 기계; 564-0852, 유도 챔버 16X7X7.5cm	수술 및 입위 주사
Zeiss		수술 및 입위 주사	3D 내시경
광섬유 광			수술 및 입위 주사
Betadine			수술 및 입위주사
70%(V/V) 이소프로필 알코올			수술 및 입위주사
포비돈-요오드 준비 패드	dynarex	1108	수술 및 입방주사
NaCl 0.9%(주사, USP, 918610)			수술 및 입정주사
CYCLOSPORINE(INJECTION, USP)			수술 및 입체 주사
Buprenex (주사) 부프레노르핀 (0.03 μ g per g 설치류)	Sigma-Aldrich		수술 및 입체 주사
안과 연고	Akorn	NDC 17478-235-35	수술 및 입체 주사
Surgifoam	Ethicon		수술 및 입체 주사
그립 치과 시멘트	Dentsply	#675571, 675572	수술 및 입체 주사
인스턴트 SuperGlue	NDindustries		수술 및 입위 주사
LOCTITE 4041			수술 및 입위 주사
METABOND	C & B		수술 및 입체 주사
번호 0 커버 유리	Fisher		수술 및 입체 주사
입위 프레임	Kopf		수술 및 입위 주사
직장 프로브 및 발열 패드	FHC	40-90-8D, DC 온도 컨트롤러, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm 가열 패드 40-90-5D-02, 직장 서미스터 프로브	수술 및 입위 주사
Thorlabs		수술 및 입위 주사	용 광학 브레드 보드
			입체 주사
Kwik-Cast (실리콘 엘라스토머)	세계 정밀 기기		수술 및 입체 주사
봉합사	에티콘	18' ', 1667, 4-0	수술 및 입위 주사
가위	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	수술 및 입위 주사
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30; # 55, 11295-51; Grafe, 11050-10	수술 및 입위 주사
학생 Halsted-Mosquito 지혈	Scientific Tools	91308-12	수술 및 입위 주사
소액 혈관 소작 장치 키트	Fine Scientific Tools	18000-00	수술 및 입위 주사
핫 비드 살균기	Fine Scientific Tools	18000-45	수술 및 입위 주사
실리콘 매트가 있는 악기 케이스	Fine Scientific Tools	20311-21	수술 및 입위 주사
실리콘 매트가 있는 플라스틱 살균 용기	Fine Scientific Tools	20810-01	수술 및 입위 주사
in vivo 이미징을 위한 2P 고정 스테이지 형광 스코프	Olympus	FV1200 MPE	생체 내 이미징
다광자 레이저	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	생체 내 이미징
그린 레이저	Olympus	473nm 레이저	생체 내 이미징
xy 번역 기반	Scientifica	MMBP	생체 내 이미징
YFP 및 CFP용 FRET 필터 큐브	Olympus		생체 내 이미징
10x 및 40x 침수 대물렌즈	Olympus		생체 내 이미징
에어 테이블	Newport		in vivo 이미징
맞춤형 광밀폐 케이지	Thorlab		in vivo 이미징