방법 논문

건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs) 생체

DOI:

10.3791/53290

⸱

2016년 5월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Physics, University of California, San Diego, 3Section of Neurobiology, University of California, San Diego

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 체적 신경 전달 물질 방출의 광학 검출을위한 셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자 (CNiFERs)를 만들 수있는 프로토콜을 제시한다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 기반 신경 전달 형광 설계 기자 (CNiFERs)는 신경 과학자 광학적 생체의 뇌에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기위한 새로운 수단을 제공한다. 특정 CNiFER 안정적 특정 G 단백질 결합 수용체, G의 Q에 커플 / 11 G 단백질 및 FRET 기반 칼슘) 검출기 (, TN-XXL를 표현하는 인간 배아 신장 세포에서 생성됩니다. 수용체의 활성화는 FRET 신호의 증가를 이끈다. CNiFER 클론은 도파민에 대한 D2R, 예를 들어, 특정 신경 전달 물질의 고유 수용체를 이용하기 때문에 CNiFERs는 nM의 감도와 초 시간 응답이 있습니다. CNiFERs 직접 뇌에 이식 생체 내에서 볼륨 전송을 측정하기에 이상적 미만 백 ㎛의 공간 해상도와 신경 전달 물질 방출을 감지 할 수 있도록하고 있습니다. CNiFERs 또한 VI 잠재적 교차 - 반응성에 대한 다른 약물을 스크리닝하는데 사용될 수있다VO. 우리는 최근의 GPCR에게 G I / O G 단백질에 그 부부를 포함 CNiFERs의 제품군을 확장했다. CNiFERs은 아세틸 콜린 (ACH), 도파민 (DA)과 노르 에피네프린 (NE)를 검출 할 수 있습니다. 어떤 GPCR이 CNiFER 소설을 생성하는데 사용될 수 있음을 감안할 때 대략 인간 게놈 800 GPCRs에 있다는 것을 우리는 설계, 실현 및 CNiFER 임의의 타입을 테스트하기 위해 여기 일반적인 방법을 설명한다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

완전히 신경 뇌에서 통신하는 방법을 이해하기 위해, 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 측정하는 방법을 갖는 것이 필요하다. 생체 내에서 신경 전달 물질을 측정하기위한 몇 가지 잘 확립 된 기술이있다. 하나의 일반적으로 사용되는 기술은 캐뉼라 뇌에 삽입 뇌척수액 소량의 수집 및 고성능 액체 크로마토 그래피 및 전기 검사 1을 사용하여 분석되는 미세 투석이다. 미세 투석 프로브 몇 직경 정도의 공간 분해능을 가지며, 예를 들어 ~ 200 μm의 마이크로 프로브 직경 0.5 mm. 이 기법의 시간 해상도는, 그러나, 일반적으로 ~ 5 분 1 이상을 지속 샘플링 간격으로 느립니다. 또한, 분석은 실시간으로 제작되지 않습니다. 다른 기술은 뇌에 삽입되는 탄소 섬유 프로브를 사용하여 고속 스캐닝 순환 전압 전류 법 (FSCV)이다. FSCV 우수한 온도가구강 해상도 (초 단위), 고감도 (나노 몰), 30 μm의 5의 프로브 직경 공간 해상도. 그러나 FSCV는 탄소 전위차 프로브 (2)에 전압 특성 산화 및 환원 프로파일을 생성 송신기들로 제한된다.

신경 전달 물질을 측정하는 세 번째 기술은 유 전적으로 인코딩 된 신경 전달 물질 (NT)....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서 수행되는 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라, 그리고 시내산에서 의학의 아이칸 학교와 캘리포니아 대학 샌디에고에서 IACUCs에 의해 승인되었습니다.

1. HEK293 세포 변형에 대한의 Lentivirus를 GPCR이 발현 생성

  1. 상용 소스, 예를 들어, cdna.org에서 특정 GPCR에 대한 cDNA를 가져옵니다. 다르게는, PCR을 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 GPCR 유전자를 증폭한다. 이러한 pCDH-CMV-MCS-EF1-순수하지 않아 (pCDH) 등의 렌티 바이러스 발현 벡터를 얻습니다. DNA를 전파 할뿐만 아니라, 렌티 바이러스를 생성하기 위해이 벡터를 사용한다.
  2. PCR에 의한 렌티 바이러스 발현 벡터로 GPCR의 cDNA 클론. PCR의 서브 클로닝에 대한 자세한 내용은, 로렌스 (8)을 참조하십시오.
  3. 확장하고 제조업체의 지침에 따라 같은 독소가없는 '맥시'준비 키트를 사용하여 GPCR-pCDH DNA를 정화. pCDH이 mutation- 인으로 GPCR cDNA를 클로닝 확인DNA 염기 서열에 의해 무료.
    주 : 앞서 바이러스 생산을위한 DNA를 제출에 넣고 DNA의 순도의 크기를 확인하는 적절한 제한....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

특정 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 유전자 코드 [칼슘 2 +] 센서, TN-XXL하십시오 CNiFER 안정적 적어도 두 개의 단백질을 발현하도록 유전자 조작 된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포에서 파생됩니다. TN-XXL은 칼슘 이온 -6,15-의 질문에 답변 시안과 노란색 형광 단백질 각각 eCFP과 황수정, 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 겪는다. 내생 G q를 G 단백질에 그 부부의 GPCR의 활성화는 [칼슘 2 +]를 PLC / IP 3 경로를 통해 TNXXL 칼슘 검출기에서 FRET의 증가로 이어지는 (그림 1) 세포질의 증가를 발생시킨다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CNiFERs의 생성은 광학적으로 생체 내에서 뇌의 신경 전달 물질의 방출을 측정하기위한 혁신적이고 독특한 전략을 제공합니다. CNiFERs 이상적으로 신경 전달 물질에 대한 예 extrasynaptic 해제, 볼륨 전도를 측정하기에 적합합니다. 중요한 것은, 각 CNiFER은 뇌의 신경 전달 물질의 농도의 변화 생리 광 측정을 제공하는 천연 GPCR의 특성을 가지고있다. 지금까지 CNiFERs은 아세틸 콜린을 검출 생성 된 (M1-CNiFER) (6), 도파민 (D2-CNiFER) (7)과 노르 에피네프린 (α1a-CNiFER) 7.

주에서, CNiFER는 GPCR을 통해 신호하는 신경 전달 물질 생성 할 수 있습니다. G의 Q G 단백질을 통해 GPCR 신호가 더 이상 수정이 HEK293 세포에 필요하지 않은 경우에 대해. G 통해 신호의 GPCR은 I .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 전자 제품에 대한 지원은 G의 qi5 및 G QS5 cDNA를, A. 슈바이처를 제공 B. 콘 클린 (캘리포니아 대학 샌프란시스코)를 감사, N. 테일러 증거 읽기 클론, 이안 Glaaser 로버트 리프킨의 심사에 대한 지원 및 TN-XXL에 대한 올리비에 Griesbeck. (; DA037170 DA029706), 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB) (EB003832), 호프만 - 라 로슈 (88610A)과 "신경 과학이 작품은 약물 남용에 미국 국립 연구소 (NIDA)를 통해 연구비에 의해 지원되었다 NIDA (DA007315)를 통해 남용 "훈련 보조금의 마약 관련.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pCDH-CMV-MCS-EF1-퓨로 System BiosciencesCD510B-1복제: 렌티바이러스
생성 12 x 75 *BD Falcon High Clarity 폴리프로필렌 라운드 바닥 테스트 튜브BD Biosciences352063FACS
BD 40 um Falcon 세포 여과기BD Biosciences352340FACS
0.05% Trypsin EDTA Invitrogen25200056FACS
96 웰 플레이트, 평평한 바닥, 투명 코닝 3596FACS
96웰 세포 배양 플레이트 코닝 CLS3997Flexstation
Optilux 블랙 클리어 바텀 코닝 3603Flexstation
Flexstation 피펫 팁분자 장치9000-0911Flexstation
아세틸콜린 염화물   시그마-알드리치A2661플렉스스테이션
노르에피네프린   Sigma-AldrichA7256Flexstation
도파민 염산염   시그마-알드리치PHR1090플렉스스테이션
GABA   시그마-알드리치A2129플렉스스테이션
히스타민   시그마-알드리치H7125플렉스스테이션
글루타메이트   시그마-알드리치49621플렉스스테이션
에피네프린   시그마-알드리치E4642플렉스스테이션
소마토스타틴     시그마-알드리치S1763플렉스스테이션
5HT     Sigma-AldrichH9523Flexstation
VIP 알파 다이어그노스틱스     SP-69627Flexstation
Orexin AAlpha Diagnostics Inc.     12-p-01Flexstation
Substance P   Sigma-AldrichS6883Flexstation
아데노신Sigma-AldrichA4036Flexstation
멜라토닌 Sigma-AldrichM5250CFlexstation
형광판 리더 및 소프트웨어분자 장치Flexstation 3Flexstation
  Glutamax를 함유한 DMEM(고포도당);  Life Technologies10569-010조직 배양
  태아 소 혈청LifeTechnologies 10082-139조직 배양
  펜/스트렙  항생제LifeTechnologies 15140-122조직 배양
  푸로마이신   InvivoGenant-pr-1조직 배양
  피브로넥틴 Sigma-AldrichF0895조직 배양
CoolCell LX 무알코올 제어 속도 세포 동결 상자BioexpressD-3508)조직 배양
시아노아크릴레이트 접착제 록타이트록타이트 no. 495수술 및 입체 사출
플라스틱 파라핀 필름 VWR파라필름®수술 및 입위 주사
나노 인젝터Drummond3-000-204수술 및 입위 주사
유리 전극Drummond3-000-203G수술 및 입위 주사
핸드 헬드 드릴OSADAExl-M40수술 및 입위 사출
드릴 용 버Fine Scientific19007-05; 19007-07)수술 및 입위 주사
살균 목욕FST18000-45, 핫 비드 살균기수술 및 입위 주사
이소 플루란 챔버 / 마스크하이랜드 의료 장비564-0427, 이소 플루란 기화기, O2 유량계, 갱 밸브가있는 HME 109 탁상용 마취 기계; 564-0852, 유도 챔버 16X7X7.5cm수술 및 입위 주사
Zeiss수술 및 입위 주사3D 내시경
광섬유 광수술 및 입위 주사
Betadine 수술 및 입위주사
70%(V/V) 이소프로필 알코올수술 및 입위주사
포비돈-요오드 준비 패드dynarex1108수술 및 입방주사
NaCl 0.9%(주사, USP, 918610)수술 및 입정주사
CYCLOSPORINE(INJECTION, USP)수술 및 입체 주사
Buprenex (주사) 부프레노르핀 (0.03 μ g per g 설치류)Sigma-Aldrich수술 및 입체 주사
안과 연고 AkornNDC 17478-235-35수술 및 입체 주사
SurgifoamEthicon수술 및 입체 주사
그립 치과 시멘트Dentsply#675571, 675572수술 및 입체 주사
인스턴트 SuperGlue NDindustries수술 및 입위 주사
LOCTITE 4041수술 및 입위 주사
METABONDC & B수술 및 입체 주사
번호 0 커버 유리Fisher수술 및 입체 주사
입위 프레임 Kopf수술 및 입위 주사
직장 프로브 및 발열 패드FHC40-90-8D, DC 온도 컨트롤러, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm 가열 패드 40-90-5D-02, 직장 서미스터 프로브수술 및 입위 주사
Thorlabs수술 및 입위 주사용 광학 브레드 보드
입체 주사
Kwik-Cast (실리콘 엘라스토머)세계 정밀 기기수술 및 입체 주사
봉합사   에티콘18' ', 1667, 4-0수술 및 입위 주사
가위Fine Scientific Tools91500-09, 15018-10수술 및 입위 주사
ForceptsFine Scientific Tools11252-30; # 55, 11295-51; Grafe, 11050-10수술 및 입위 주사
학생 Halsted-Mosquito 지혈Scientific Tools91308-12수술 및 입위 주사
소액 혈관 소작 장치 키트Fine Scientific Tools18000-00수술 및 입위 주사
핫 비드 살균기Fine Scientific Tools18000-45수술 및 입위 주사
실리콘 매트가 있는 악기 케이스Fine Scientific Tools20311-21수술 및 입위 주사
실리콘 매트가 있는 플라스틱 살균 용기Fine Scientific Tools20810-01수술 및 입위 주사
in vivo 이미징을 위한 2P 고정 스테이지 형광 스코프OlympusFV1200 MPE생체 내 이미징
다광자 레이저SpectraPhysicsMai Tai DeepSee생체 내 이미징
그린 레이저Olympus473nm 레이저생체 내 이미징
xy 번역 기반ScientificaMMBP생체 내 이미징
YFP 및 CFP용 FRET 필터 큐브Olympus생체 내 이미징
10x 및 40x 침수 대물렌즈Olympus생체 내 이미징
에어 테이블Newportin vivo 이미징
맞춤형 광밀폐 케이지Thorlabin vivo 이미징
팔 가있는이미징 미네랄 오일 Fisher S55667 수술 및 Fine

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
  2. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammet....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

CNiFERsNeurotransmitter DetectionGPCR ReceptorsFRET Calcium SensorHEK293 CellsLentivirus InfectionFACS AnalysisDose Response CurveIn Vivo InjectionTwo Photon Imaging

관련 논문