방법 논문

ELISA 기반 바인딩과 경쟁 방법은 신속 리간드 - 수용체 상호 작용을 확인하는 방법

DOI:

10.3791/53575

⸱

2016년 3월 14일

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1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

이 논문에서

요약

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제시된 프로토콜은 리간드-수용체 상호작용의 신속한 조사를 위한 두 가지 효소 결합 면역흡착 시험(ELISA) 기반 기술을 설명합니다: 첫 번째 시험은 리간드와 수용체 간의 해리 상수를 결정할 수 있습니다. 두 번째 시험은 리간드-수용체 상호작용에 대한 차단 펩타이드의 신속한 스크리닝을 가능하게 합니다.

초록

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```html

신호전달 경로에 대한 종합적인 이해는 리간드-수용체 상호작용에 대한 상세한 지식을 요구합니다. 이 기사는 리간드-수용체 상호작용의 조사를 위한 효소 연결 면역흡착 분석법(ELISA)의 빠르고 신뢰할 수 있는 두 가지 포인트 바이 포인트 프로토콜을 설명합니다: 직접 리간드-수용체 상호작용 분석(LRA)과 경쟁 LRA입니다. 사례 연구로서, 다양한 람다 인터페론(IFNL)과 수용체의 알파 서브유닛(IL28RA) 간의 상호작용에 대한 ELISA 기반 분석이 제시됩니다: 직접 LRA는 수용체와 IFN 리간드 간의 해리 상수(KD 값)를 결정하는 데 사용되며, 경쟁 LRA는 IFNL이 그들의 수용체 결합 부위에서 경쟁하도록 설계된 올리고펩타이드의 억제 능력을 결정하는 데 사용됩니다. KD 및 반수 최대 억제 농도(IC50) 값을 추정하기 위한 분석 단계가 설명됩니다. 마지막으로, 논의는 제시된 방법의 장점과 단점을 강조하고 결과가 리간드-수용체 상호작용에 대한 더 나은 분자적 이해를 어떻게 가능하게 하는지를 설명합니다. ```

서론

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신호 전달 경로의 포괄적 인 이해는 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 자세한 지식이 필요합니다. 그 특정 수용체와 특정 리간드의 상호 작용을 평가하기위한 대부분의 방법은 시간이 많이 걸리고, 노동 집약적, 비싼 특정 장비와 전문 지식 1을 필요로한다.

직접 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (LRA)와 경쟁 LRA :이 문서에서는 면역 분석법 (ELISA)을 연결하는 효소에 따라 리간드 - 수용체 상호 작용을 조사하기 위해 두 빠르고 신뢰할 수있는 포인트 별 프로토콜을 설명합니다. ELISA는 일상적으로 거의 모든 실험에서 사용 된 매우 민감한 특정 용이 가능한 기술이다. ELISA를 수행하고 다양한 패션에 적응 될 수있다. 제시된 프로토콜은 다른 인터페론 람다 (INFLs)와 그 수용체 간의 상호 작용 연구를 위해 최적화된다.

직접 LRA는 quantificati 수 있습니다리간드 - 수용체의 리간드 농도에 대해 결합함으로써 결합 곡선을 산출한다. 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 적절한 모델을 사용하여, 데이터가 상기 해리 상수 (K D)를 추정하기 위해 분석 될 수있다.

제시된 프로토콜, 일반적으로 사용되는 힐 방정식 리간드 결합 수용체를 모델링에 적용된다. 이러한 표면 플라즈몬 공명 기술 2,3- 다른 방법은 두 단백질 사이의 결합 친화도의 측정을 할 수 있지만,이 기술은 종종 노동 집약적 고가이고 특별한 실험 장비를 필요로한다.

LRA는 경쟁 저해 펩티드의 스크리닝을 가능 : 리간드 결합 수용체 펩티드가 농도에 대해 정량화된다. 이것은 펩티드의 억제 효과를 설명하는 용량 - 반응 곡선을 산출한다. 데이터는 상기 IC (50) (반 최대한 억제 농도를 추정하기 위해 분석 될 수있다 ) 블로킹 펩타이드.

두 ELISA 프로토콜은 사용하기 쉽고 연구 질문의 넓은 범위로 적용 할 수있다. 어떤 종류의 재조합 단백질을 확실하고 빠르게 상호 작용 부분을 결정하기 위해 사용될 수있다. 또한, 경쟁 LRA는 리간드 또는 수용체를 모방하도록 설계 차단 펩티드를 사용하여 리간드 및 수용체의 중요한 상호 작용 위치를 결정하는데 사용될 수있다. 차단 펩타이드 효율적이고 특정 억제를 표시하는 경우, 펩타이드는 중요한 상호 작용 리간드의 사이트 (펩타이드 모방 경우 수용체) 또는 리간드 (펩타이드 모방 경우 리간드)를 차지한다.

제 1 프로토콜은 다른 INFLs의 K D 값 결정 및 리셉터의 알파 서브 유니트, 즉 설명 직접 LRA를 사용하여 인터루킨 28 수용체 (IL28RA). 다음에, 제 2 프로토콜에 20 아미노산 길이의 펩티드의 능력을 확인하는 방법을 도시INFL-IL28RA 상호 작용을 억제한다. 펩티드들은 수용체 결합 부위에서 IFNLs 경쟁하도록 설계함으로써 상호 작용 분자 이해할 수있다. 또한,이 펩타이드는 하류 시그널링 4 효과에 미치는 영향을 결정하기 위해 시험 관내 실험에서 IL28RA을 차단하는데 사용될 수있다.

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프로토콜

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1. 시약 준비

  1. 탄산염 코팅 완충액을 제조 0.36 g 나 2 CO 3 및도 3의 100 ml의 증류수에 0.84 g의 NaHCO3를 용해하는 단계; 멸균 필터를 사용까지 RT에서 0.22 ㎛의 폴리 에테르 설폰 (PES) 멤브레인 필터 저장 구동 진공을 이용하여 버퍼.
  2. 인산염에 0.05 % v / V를 트윈 20을 추가하여 세척 용액을 제조 식염수 (PBS)를 버퍼.
  3. 4 ℃에서 5g을 100㎖의 PBS에 BSA (≥98 %) 저장을 용해시켜 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) PBS 용액 (블로킹 용액)을 준비한다.
  4. 재조합 수용체, 리간드 및 차단 펩티드
    1. Reconstitutethe 재조합 인간 인터루킨 수용체 알파 서브 유닛 (IL28RA) 및 -80 ° C에서 제조업체의 지침 및 저장에 따라 인간의 IFN (IFNL1-3)의 재조합 그의 - 태그 리간드. Synthetize은 펩티드를 차단 및 이전 (4) 기술로 사용된다. 리간드의 다양한 농도를 준비하는 PBS를 사용하여S 및 검정에 사용하기위한 펩타이드.
  5. 차 항체를 준비하려면 1에서 0.1 % BSA와 PBS의 6 배 그의 마우스 단일 클론 항체를 희석 : 1,000 희석. 희석 차 항체를 제조 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1)에서 0.1 % BSA와 함께 PBS에 공액 된 염소 항 - 마우스 IgG (H + L) : 10,000 희석.
  6. 제조자의 지시에 따른 시약을 혼합하여 B TMB 용액을 제조 하였다.
  7. 실온에서 증류수와 저장소에 5 N 황산 (H 2 SO 4)을 추가하여 스톱 솔루션을 준비합니다.

2. 면역 흡수 분석법 (ELISA를)을 효소 결합

주 : 직접적인 리간드 - 수용체 상호 작용을 ELISA (직접 LRA도 1) 수용체 - 리간드 결합 친화도의 척도로서, 일정한 수용체 리간드의 해리 (K D)를 측정하는데 사용될 수있다. 경쟁 리간드 - 수용체 상호 작용 ELISA (경쟁 LRA, 그림 2) 모든리간드와 수용체 사이의 상호 작용을 방해하는 작용 펩타이드 (및 기타 차단 화합물)의 심사 OWS. 이전에 5 게시 된 기본 프로토콜은 더욱 최적화되었다.
주 :이 방법의 각 단계에서 96 웰 플레이트에 대한 솔루션을 추가 멀티 채널 피펫을 사용하여 ELISA 양이다. 솔루션 캔트 또는 세척 단계에서, 싱크에 직접 솔루션을 밖으로 던져.

  1. 직접 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (직접 LRA)
    참고 : 워크 플로의 그림은 (그림 1 참조).
    1. 재조합 수용체와 코팅 플레이트
      1. 100 NG / μL 최종 농도 카보네이트 버퍼 재조합 수용체 희석. 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 100 μl를 피펫 팅에 의해 고정 된 수용체 농도 (100 NG / μL) 96 웰 마이크로 타이 플레이트의 코트 우물. 잘 가장자리 유물을 방지하기 위해 판의 외벽을 제외합니다. 뚜껑 접시를 덮고을 품어4 ° CO / N에서 판.
    2. 차단 및 리간드의 추가
      1. 다음 날, 싱크대에 대한 판을 기울여 코팅 용액을 제거하고 세척 용액 (PBS + 0.05 % v / V를 트윈 20)와 플레이트 3 번 씻는다.
      2. 물론 멀티 채널 피펫을 사용하여 각각 5 % BSA 용액 200 μl를 사용하여 도장 판의 자유 수용체 결합 부위를 차단하고 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 배양한다.
      3. 블로킹 용액을 폐기 (. 단계 2.1.2.1 참조) 세정액 판을 3 회 세척 하였다.
      4. 상이한 농도 (AT 재조합에게 그의 태그가 리간드를 준비 예 8 ㎍ / ㎖, 4 μg의 / ㎖, 2 ㎍ / ㎖, 1 ㎍ / ㎖, 0.5 ㎍ / ㎖, 0.25 ㎍ / ㎖, 0.125 ㎍ / ㎖, 0.063 μg의 / PBS에서 ㎖, 0.031 μg의 / ㎖, 0.0 μg의 / ㎖). 빈 우물 만 PBS를 추가합니다.
      5. 중복 우물에 각 리간드 농도의 100 μl를 추가하고 수용체 - 리간드를 허용 RT에서 2 시간 동안 접시를 품어상호 작용.
    3. 항체와 배양
      1. 리간드와 인큐베이션 후, 세척 용액으로 플레이트를 3 회 세척 하였다.
      2. 피펫 차 항 그 마우스 모노클로 날 항체 용액 (1 : 1000) 100 ㎕를 각 웰에 관한 것이다.
      3. 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어; 배양 후, 항체 용액을 (단계 2.1.2.1 참조). 버리고 세정액으로 플레이트를 3 회 세척 하였다.
      4. 물론 각 : HRP 100 ㎕를 염소에게 항 - 마우스 IgG 이차 항체 용액 (10,000 1) 결합 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 접시를 품어.
      5. 항체 용액을 폐기 (. 단계 2.1.2.1 참조) 세정액 판을 3 회 세척 하였다.
    4. 기판 및 개발의 추가
      1. 실온 TMB 기질 용액을 가져와 1 TMB 기질을 용액 A 및 B를 준비 : 1 비율. 갓 각 웰에 기판을 준비 100 μl를 추가하고 15 ~ 30 분 동안 실온에서 접시를 유지합니다. 충분한 COL 후 또는 개발은 50 μl의 중지 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
    5. 접시와 데이터 분석 읽기
      참고 설명 프로토콜 측정 신호가 특이 적 결합에서 상승한다는 가정에 기초한다. 이 신호에 비특이적 결합 기여도를 추정해야 할 수도 있지만, 이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난다.
      1. 직접 450 nm에서의 흡광도 (광학 밀도, OD)를 참조하십시오.
      2. 측정 된 OD 값에서 배경 신호를 빼고이를 정규화. (10를 기록,베이스 10) 로그 스케일로 리간드 농도의 모든 값을 변환.
      3. 정규화 배경 OD 값 보정 플롯 (10 로그 스케일, X 축)의 리간드 농도에 대해 대수 (Y 축 점유 수용체 결합 부위의 일부에 해당).
      4. K D 값을 추정하는, 힐 방정식은 다음 형태로 데이터를 적합 :
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        참고 : 여기에 Y 점유 수용체 결합 부위와 Y 최대 바인딩을 최대의 분율을 의미한다; [L]은 무료로 리간드와 힐 계수의 농도를 나타낸다. 리간드에 대한 하나의 결합 부위가 존재하면, 힐 계수 N 이상의 리간드 결합 부위를 가진 시스템의 경우 = 1, 결합 전시 긍정적 협동성되면, N> 1 음극 협동성 경우 N <1 N 만약 아니오 협동성 = 1 현미경 해리 상수라고하고 반 최대 유효 농도 EC 50 (6)에 해당합니다. 겉보기 해리 상수는 K의 D = (K D) n은. 간단한 경우 N = 1에서, 결합 부위의 절반 수용체 점령의 K D = K D되어있는 리간드 농도 해리 상수에 대응한다. 이 모델은 단지 작은 분획이뿐만 아니라, 평형 상태에서 바인딩 질량 동작을 가정추가 된 리간드, 수용체에 결합되어 즉, [L] >> [RL].

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그림 1. 직접 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (직접 LRA). 직접 LRA에 대한 단계별 프로토콜입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 경쟁 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (경쟁 LRA)
    참고 :. 워크 플로우의 그림은 그림 2를 참조하십시오 경쟁 LRA 절차는 리간드에 중요한 변경 사항을 제외하고는 동일한 직접 LRA로 단계 (접시 코팅, 항체 배양, 플레이트 개발) 다음과 첨가 단계를 펩티드. 적절한 음성 대조군은이 분석을 위해 필수적이다. 이전 스크리닝 연구에서 4, 스크램블 차단 펩타이드 길항 효과를 보이지 않았다.
    1. 차단 - 리간드 및 차단 펩타이드의 추가를
      1. 다음날, 도포 액을 제거하고 (2.1.2.1 참조) 플레이트를 세척한다.
      2. 각 웰을 5 % BSA 용액 200 μl를 첨가함으로써 도장 판을 차단하고 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 배양한다.
      3. PBS의 고정 된 농도 (2 × 20 ​​NG / ㎖)에서 그의 재조합 태깅 리간드 (IFNL1-3)을 준비한다.
      4. 용량 - 반응 곡선을 보장하는 PBS 10 nM 내지 100 μM의 범위의 다양한 농도로 차단 펩티드 (참조 표 3)를 준비한다.
        참고 :이 차단 펩타이드의 IC (50) 값의 후속 결정을 할 수 있습니다. 대조군 웰에서 최대 (100 %) 결합을 유도하는 펩티드없이 단지 고정 리간드의 농도를 추가한다. 빈에서 리간드 또는 펩티드없이 단지 PBS를 추가합니다.
      5. 리간드의 50 μL (IFNL1-3) 및 각 PE의 50 μl를 추가중복의 우물에 ptide 농도.
      6. 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
    2. 플레이트 및 데이터 분석 읽기
      참고 설명 프로토콜 측정 신호가 특이 적 결합에서 상승한다는 가정에 기초한다. 이 신호에 비특이적 결합 기여도를 추정해야 할 수도 있지만, 이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난다.
      1. 직접 450 nm에서의 흡광도 (광학 밀도, OD)를 참조하십시오.
      2. 측정 된 OD 값에서 배경 신호를 빼고이를 정규화. (10를 기록,베이스 10) 로그 스케일로 펩타이드 농도의 모든 값을 변환.
      3. 정규화 배경 OD 값 보정 플롯 (10 로그 스케일, X 축)의 리간드 농도에 대해 대수 (Y 축 점유 수용체 결합 부위의 일부에 해당).
      4. IC 50 값을 측정하기 위해, 다음 식에 맞게 데이터 :
        figure-protocol-2
        참고 : 여기에 [P]는 펩타이드 농도와 힐 슬로프입니다. 힐 기울기는 용량 - 반응 곡선의 기울기에 대해 설명합니다. IC (50)는 수용체와 리간드 사이의 결합의 50 % 억제가 관찰되는 억제제의 농도에 상당한다.

figure-protocol-3
그림 2. 경쟁 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (경쟁 LRA). 경쟁 LRA에 대한 단계별 프로토콜입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

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INFL1-3 및 수용체 알파 소단위 IL28RA 사이의 해리 상수는 직접 LRA를 사용하여 측정 하였다. 결과는도 3에 도시되어 차지하는 결합 부위의 비율은 각각의 IFN 농도의 로그에 대해 도시된다. 데이터의 스캐 챠드 플롯은 오른쪽 하단 모서리에 표시됩니다. 결과는 직접 LRA는 상기 K D 값을 추정하기 위해 분석 될 수있다 결합 곡선을 얻을 수 있음을 나타낸다. K D 값은 힐 방정식 데이터 (식 1)을 끼워 맞춤으로써 결정 하였다.

IFNL1는 IFNL2 및 IFNL3 다음에 높은 결합력을 가지고 있습니다. 힐 계수 N> 1은 초기 리간드 - 수용체 상호 작용 (토론 참조) 후 추가 리간드에 대한 친 화성을 증가 제안한다. 예상 해리 상수 및 힐 계수를 표에

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토론

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ELISA는 많은 실험실에 대한 표준과 잘 확립 된 방법이다. 우리는 더 수정 이전에 게시 된 방법 5,7를 개선했다. 입증 단계별 프로토콜이 리간드 - 수용체 상호 작용의 K D 값을 결정하는 간단한 방법으로 사용할 수있는 방법을 도시한다. 또한, 리간드 - 수용체 상호 작용을 방해 차단 펩타이드 IC50이 측정 될 수있다.

대부분의 연구자들은 이전 ELISA 프로토콜을 사용하는 것처럼 주요 장점은 빠른 설치, 시약 및 익숙한 처리를 쉽게 준비합니다. 직접 LRA 프로토콜은 매우 유연하고 다양한 단백질 - 단백질 상호 작용을 측정하도록 구성 될 수있다. 된 His6 또는 대체 태그 재조합 단백질 고정화 파트너 바인딩 파트너로 사용되어야한다. 경쟁 LRA는 (ⅰ)에 대한 선별 도구로 악용 될 수있는 화합물을 (펩타이드, 항체, 또는 작은 몰을 차단하는 억제 가능성을 확인ecules) 및 (Ⅱ) 수용체 또는 리간드를 모방하도록 고안된 차단...

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공개 사항

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A.E.는 "SNSF Ambizione Score" 프로그램(PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" 바젤 대학교, Stiftungsinfektionskrankheiten 바젤, 그리고 Bangeter Rhyner Stiftung의 연구 보조금으로 지원되었습니다. J.L.은 SystemsX.ch 이니셔티브의 시스템 생물학 프로그램(9th 호출)의 iPhD 펠로십으로 지원을 인정합니다.

감사의 글

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ETH 취리히의 바이오시스템 과학 및 공학부 및 스위스 생물정보학 연구소(스위스 바젤)의 J. Stelling 교수님께 원고에 대한 비판적인 검토에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)Thermo Scientific442404ELISA 플레이트
Sodium carbonate (Na2CO3)Merck497-19-8ELISA 플레이트 코팅 버퍼용
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)Merck144-55-8ELISA 플레이트 코팅 버퍼용
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7030-100G차단용 PBS에 5% BSA
rhIL-28Rα/IFNλR1R&D systems5260-MR재조합 인간 인터루킨-28 수용체 알파
rhIL-29/IFNλ1R&D systems1598-IL/CF재조합 인간 인터루킨-29/캐리어 프리/C-말단 10-히스 태그
rhIL-28A/IFNλ2R&D systems1587-IL/CF재조합 인간 인터루킨-28A/캐리어 프리/C-말단 6-히스 태그
rhIL-28B/IFNλ3R&D systems5259-IL/CF재조합 인간 인터루킨-28B/캐리어 프리/C-말단 6-히스 태그
6x His Monoclonal antibody (Mouse)Clontech631212히스 태그가 있는 리간드를 포획하는 1차 항체
Goat anti-Mouse igG (H+L)Jackson Immuno Research115-035-166고추말린 과산화효소 접합 2차 항체
BDoptEIA TMB reagent setBD Biosciences555214ELISA - TMB 기질 용액
Sulfuric acid (H2SO4)Fulka847205 N H2SO4 (효소 반응 정지 용액)
Synergy/H1 - Microplate readerBioTeKELISA 플레이트 리더

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
  3. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
  4. Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).
  5. Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
  6. Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
  7. Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155(2009).
  8. Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51(2014).
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  11. Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
  12. Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).

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재인쇄 및 허가

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