Method Article

종양 개발의 평가를 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하고 후속 치료에 대한 반응의를 폐암의 마우스 모델에서

DOI:

10.3791/53904

⸱

May 20th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary Medicine, Keio University School of Medicine, 2Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 선암종 마우스 모델의 폐에서 종양 결절 발달을 감지하는 방법과 시간 경과에 따른 결절 크기 및 치료에 대한 반응 변화를 모니터링하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 평가의 정확성은 종말점 조직학적 정량화로 확인되었습니다.

Abstract

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폐암은 세계에서 가장 치명적인 암입니다. 폐암에 대한 새로운 치료법을 찾기 위해 전 세계적으로 집중적인 연구가 진행되고 있습니다. 폐암의 여러 마우스 모델을 사용하여 암 발생 메커니즘을 연구하고 다양한 치료 전략을 실험하고 있습니다. 그러나 생쥐의 폐에서 종양 결절의 발달을 확인하고 다양한 실험 및 치료 개입에 대한 반응으로 종양 결절의 크기 변화를 모니터링할 수 있는 실시간 기술이 없기 때문에 질병의 경과와 치료에 대한 적시 반응에 대한 정확한 설명을 얻을 수 있는 능력이 저하되고 있습니다. 본 연구에서는 폐선암종의 마우스 모델에서 폐 종양의 발생을 감지하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캐너를 사용하는 방법을 설명합니다. 다음으로, micro-CT를 이용한 월간 추적 관찰을 통해 추가 결절의 출현, 이전에 검출된 결절의 크기 증가, 치료에 대한 반응으로 결절의 크기 감소 또는 완전한 해상도와 같은 폐 종양의 동적 변화를 확인할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, 이 실시간 평가 방법의 정확성은 종말점 조직학적 정량화를 통해 확인되었습니다. 이 기술은 폐암 동물 모델에 대한 보다 복잡한 실험을 계획하고 수행할 수 있는 길을 열어주며, 시간과 자원을 절약하면서 발암 메커니즘과 다양한 치료 방식의 효과를 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.

Introduction

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폐암은 세계 1 주위에 암 사망의 주요 원인이다. 폐암의 예방, 조기 진단 및 치료에 대한 연구는 전 세계에 걸쳐 2,3- 많은 연구소에서 진행되고있다. 폐암 여러 동물 모델이 개발되었으며, 이들은 암 줄기 세포의 존재를 결정하는 폐 발암과 원래 셀의 기전 연구에 유용하게 입증하고 다양한 신규 한 치료 전략 4를 검토한다. 이전 모델 마우스 (5)의 민감한 균주에 발암 물질에 의한 종양 개시에 의존했다. 폐암 특이 유전자 조작 병변의 결과로서 발생하는 넉 아웃 형질 전환 마우스 모델의 발전은 실질적으로 종양 유도 및 인간 간암 4 모방 여러 측면을 제어하는 능력이 개선되었다. 그러나, 폐암 동물 모델의 사용에서 주요한 문제는 실시간에있어서의 부재이며정확하게 파악하고 마우스의 폐에서 종양의 발생과 발전을 모니터링하고 치료에 반응에서의 지속적인 성장 또는 감소로 그 크기에 이후의 변화를 문서화 할 수 있습니다. 이 작업은 몇 시간, 노력, 자원 소모 기술 종양을 파악하고 자신의 실험 결과를 평가에 의존하는 연구자를 강제하고있다. 종양 유도에 응답하여 고유 한 마우스 간 변동의 존재는 데이터의 변동을 줄이기 위해 각 실험군의 동물의 다수의 이용을 필요로한다. 실시간으로 치료에 대한 종양의 성장 또는 응답을 평가하는 무능력 샘플에서 자원의 낭비의 결과, 맹목적으로 그들이 올바른 데이터를 수집하는 것을 보장하기 위해 장기간의 실험 프로토콜에 여러 시간 지점에서 쥐를 안락사 연구자를 강요했다 너무 이르거나 너무 늦은 시간 지점에서 수집.

본 연구에서, 방법은 작은 동물 마이크로 C을 악용omputed 단층 촬영 (마이크로 CT) 스캐너는 감지하고 추적 폐 종양을 마우스 생활하는 것은 도입에 있습니다. 우리는 우리의 최근 기술 Sftpc-rtTA 및 트레 - Fgf9-IRES-EGFP 이중 형질 전환 (DT) 빠르게 독시사이클린 6,7와 유도 다음 폐 선암을 개발하는 마우스를 사용했다. 마이크로 CT의 사용은 (무엇보다도) 우리를 수 있도록 유도 후 폐에 종양 결절의 발전을 확인하고 실험적인 치료에 반응하여 종양 결절의 변화를 관찰, 유도 전에 비정상적인 폐의 이상에 마우스를 제외합니다. 마우스 및 조직 학적 평가 종점 안락사 마이크로 CT로 진행 실시간 평가의 정확성을 확인 하였다. 우리는이 기술은 가치있는 자원을 절약 관측 시간을 단축하고 결과의 정확성과 이해를 증가시키면서 폐암 동물 모델을 이용하여보다 계획된 실험을위한 길을 열 것이라고 믿는다.

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Protocol

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동물 실험은 게이오 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

참고 :이 연구에서 우리는 Sftpc-rtTA 및 폐 선암이 빠르게 독시 싸이클린 6,7를 포함하는 우를 공급함으로써 유도 한 후 개발하는 트레 - Fgf9-IRES-EGFP DT 마우스를 사용했다. 그러나, 모든 평가 절차는 다른 폐암의 마우스 모델에 적용될 수있다.

1. 실험 개요 :

  1. 기준선에서 폐의 상태를 식별 :
    1. 종양 유도하기 전에, DT 마우스가 8 일 때 - 12 주 오래 된, 최초의 마이크로 CT 스캔 (아래 2 항과 3 항 참조) 수행합니다. 이는 폐 기준 검사로서의 트랜스 누설로 인한 자발적 개발 노쥴의 유무를 확인하고, 종양 유도 전에 기존 폐 병변이없는 문서.
  2. 종양 유도를 시작합니다 :
    1. 일반 채널에서 DT 마우스 스위치독시 싸이클린 차우에 아야 폐포 세포에서 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) 9 발현을 유도하는 종양 개발을 시작합니다. 독시 싸이클린 우 (200 ppm의) 광고 무제한을 제공합니다.
  3. 마우스의 폐에서의 종양 결절의 발달을 확인 :
    1. 프리 유도 주사에 비해 종양 결절의 발달을 식별하는 마이크로 CT 스캔을 수행.
  4. 치료에 대한 반응을 평가 :
    1. 치료에 응답하여 종양 결절의 변화를 감지 FGF 수용체 (FGFR) 억제제 AZD4547을 관리하는 마이크로 CT의 능력을 시험하기 위해, 다음 5, 10 주 후에 추가 마이크로 CT 스캔을 수행한다.
  5. 엔드 포인트 평가 :
    1. 조직 학적 평가 (아래 섹션 6 참조)에 대한 모든 처리 및 제어 마우스 및 프로세스 조직을 안락사.

마이크로 CT 이미지 획득 2. 준비 마우스 :

  1. 마이크로 CT 스캐너와 컴퓨터를 켭니다.
  2. 카릭"R_m CT2"라는 소프트웨어에 K, 다음 "워밍업"을 클릭합니다.
  3. 마우스가 마이크로 CT 실에서 배치 될 때 샘플 침대를 제거합니다. 플라스틱 포장으로 침대를 감싸.
  4. 표시된 수준까지 마취 기화기에 이소 플루 란을 추가하여 마취 유도 상자를 설정합니다. / 분 3 L의 이소 플루 란 유량을 설정합니다.
  5. 유도 박스로 산소의 흐름을 시작 및 / 분 1 L의 유량을 설정하는 산소 탱크를 연다.
  6. 마취 유도 상자에 마우스를 놓고는 깊이 자발적인 운동과 피부 핀치에 응답이없는 경우 (조직 손상이나 피부에 휴식을 일으키지 않는 피부의 작은 배의 부드러운 핀치)에 의해 마취되어 있는지 확인합니다.
  7. 마취 동안 각막 건조를 방지하기 위해 안구 윤활제를 적용합니다.
  8. 마이크로 CT 실을 열고 샘플 침대에 등쪽면 마우스를 놓습니다. 마우스의 머리를 잡고 순으로 하였다 낮은 사지에서 아래로 몸을 당겨r은 스트레칭과 대칭 몸을 곧게합니다.
  9. 유도 상자에 마취 흐름을 끄고 마이크로 CT 실에 연결하는 관으로​​ 전원을 켭니다.
  10. 연속 마취를 관리하는 마우스의 코에 마취 튜브를 놓습니다.
  11. 위치에 마우스를 해결하기 위해; 마우스 및 플라스틱 포장으로 샘플 침대를 래핑합니다.
    참고 : 깊은 마취 스캔 중에 약간의 움직임이나 몸의 꼬임이 흐릿한 이미지와 해석에 어려움이 발생하기 때문에 샘플 침대에 싸서 마우스를 유지하는 것이 중요하다.
  12. 마이크로 CT 실을 닫습니다.
  13. 90 kV의 160 μA 및 4.5 분에 스캔 시간에 마이크로 CT 시스템을 조정합니다. 50 × 50 × 50 μm의 24 × 19mm로 이미지 범위와 복셀 크기를 설정합니다. 하트 비트에 대한 동기 모드를 사용합니다.
  14. 해당 폴더에 새 이미지를 저장하기 위해 "데이터베이스"에 새 폴더를 확인합니다.
  15. 스캔을 시작합니다.
  16. 검사 완료 후, 빈 케이지에 마우스를 이동하고 의식을 회복 할 때까지를 관찰합니다. 완전히 마취의 영향에서 회복 될 때까지 다른 마우스와 함께 넣지 마십시오.

3. 사전 유도 마이크로 CT 이미지 시각화 및 분석 :

  1. : 마이크로 CT 이미지를 시각화하려면 다음 웹 사이트에서 무료로 ImageJ에 소프트웨어를 다운로드 http://imagej.nih.gov/ij/ . 주 : 모든 마이크로 CT 데이터 파일 약 500 TIF 파일 스택이다 (이 .tif). 다른 이미지보기 소프트웨어도 사용할 수있다.
  2. 직렬 마이크로 CT 이미지 파일을 열고 그 반대의 경우도 마찬가지 복부하거나 목에서 각 마우스의 모든 이미지를 스크롤합니다.
  3. 나이브 야생형 마우스의 스캔을 사용하여, (도 1a 참조) 마우스 해부학의 지식에 기초하여 다른 영역 가슴 정상적인 해부학 적 구조의 밀도를 식별한다.
    1. 에 커서를 잡아컴퓨터 마우스와 목에 가슴을 통해 희끄무레 한 복부 내장 및 다이어프램에서까지 시작 스크롤.
    2. 뼈 가슴 케이지 랜드 마크 (측면에있는 뒤로 리브의 앞에 흉골, 척추)를 확인합니다.
    3. 가슴의 전면과 심장 근처 종격동의 주요 혈관의 마음을 확인합니다.
    4. 오른쪽으로 분기합니다 왼쪽 주 기관지 후 더 작은 기관지에 분기 계속 (목 및 가슴 위쪽의 수준에서 작은 어두운 원 등) 기관 루멘을 준수하십시오. 각 기관지 밀접 두세 혈관 (도 1a)와 연결되어 있습니다.
  4. 유엔에 의한 DT 마우스의 스캔을 검사 시작하고 이상의 존재를 식별합니다.
    1. 더 이상의 실험에서 이상 전 유도 폐 그림자 (예를 들어, 결절, 기종 수포 등)와 마우스를 제외합니다. (그림 1C-E, G, H ).

4. 종양 유도 :

  1. 정상 폐 검사를 보였다 실험 쥐에서 종양의 개발을 유도하기 위해, 독시사이클린 함유 차우 (200 ppm으로)에 정기적으로 우에서 자신의 음식을 전환합니다.

5. 후속 검색 :

  1. 10주 후 폐 (도 2 참조)에서의 종양 결절의 발달을 확인하기 위해 마우스의 초 미세 CT 스캔을 수행한다.
  2. 두 그룹으로 쥐를 분할합니다. 한 그룹에 10 주 이상에 대한 다른 대조군에 위약 (10 주 / 6 주 일 동안 위 튜브를 통해 125 μg의 / kg / 일)을 FGFR 차단제 AZD4547을 관리 할 수​​ 있습니다.
  3. 오주 이상 - 4 세 번째 검사를 수행하여 결절 그림자의 변경 사항을 따르십시오.
  4. 처리 10 주 마지막에, 네 번째 스캔을 수행한다.
  5. CO 2 흡입 또는 0.1 밀리그램 / 펜 토바 비탈의 200 μL의 복강 내 주사 모든 쥐를 안락사.
  6. 에다음 모양 / 비정상적인 그림자의 실종 (그림 3 확인, 유도 후 치료에 응답 종양 결절의 역동적 인 변화를 식별하는 두 개 이상의 서로 다른 시간 지점에서 동일한 마우스의 일련 스캔 이미지에서 비슷한 위치를 식별 ).
  7. 다른 시간 지점에서 동일한 마우스에서 동일 평면의 식별을 용이하게하기 위해, 마우스의 가슴에서 해부학 적 랜드 마크 구조와 관심의 평면을 연결하려고합니다.
    1. 이러한 기관, 그 분기점, 좌우의 주요 기관지, 대동맥, 다이아 프램, 큰 혈관으로 랜드 마크를 사용합니다.
      참고 : 흉부 척추, 갈비뼈와 흉골을 포함한 가슴 뼈 때문에 스캔 위치를 잘못 해석의 가능성을 증가 샘플 침대에 마우스 신체 정렬 일반적인 작은 경사의 위치 랜드 마크 덜 유용하다. 마찬가지로, 검사 파일 내의 화상 일련 번호 identifyin위한 신뢰할g 시간의 경과로 인해 다른 하나의 시간 지점에서 마우스 본체의 길이 변화의 동일한 위치. 서로 다른 시간 지점에서 동일 평면을 식별 실패 또는 부정확는 연구 결과 거짓 긍정적 / 부정적 해석 될 수 있습니다.

6. 마우스 안락사와 폐 컬렉션 :

  1. CO 2 흡입 또는 0.1 밀리그램 / 펜 토바 비탈의 200 μL의 복강 내 주사로 쥐를 안락사.
  2. 복부 벽을 길이 방향으로 절단하여 복부 내장을 노출. 복부 대동맥을 해부하여 폐에 혈액의 부피를 감소하기 위해 마우스를 출혈.
  3. 미세 가위로 다이어프램 슬릿; 이는 따라서 폐 붕괴 흉강에서 부압이 손실 될 것이다. 절단과 앞쪽에 가슴 벽의 갈비뼈의 일부를 제거하여 폐와 심장을 노출. trache을 노출 피부와 연부 조직을 절단하여 목의 정면 부분을 청소에이.
  4. 심장과 흉선 동맥을 절단. 식도에서 분리하는 기관 뒤 집게를 삽입합니다.
  5. 다음 G24 정맥과 기관을 Cannulate 삽입 된 부분 주위에 나사를 조여 제자리에 고정합니다.
  6. 팽창 및 25cm 칼럼을 사용하여 기관 캐 뉼러를 통해 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 폐를 고정한다. 캐 뉼러를 분리 한 다음 PFA의 누출을 방지 후두에 첨부 파일 오프 상부 기관을 잘라 나사를 조입니다.
  7. 봉합 실에서기도를 당겨 첨부 파일에서 해부하고, - 블록 엉 폐와 제거 아래로 계속합니다. 4 % PFA 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브에 삽입합니다. 전체 조직 침투 및 고정을 보장하기 위해 PFA O / N에 폐를 남겨, 다음 표준 파라핀 블록 (8)로 조직을 처리합니다.
  8. 헤 마톡 실린 및 에오신 표준 기술을 사용하여 함께 마이크로톰 및 얼룩 6 음 두께의 조각으로 파라핀 블록을 잘라.

    9. 7. 조직 학적 평가 :

    주 : 디지털 조직 학적 평가를 위해 "슬라이드 스캐너"의 사용은 여기에 기술되어 있지만, 평가를위한 일반 현미경 영상 학적 평가의 사용이 가능하다.

    1. 슬라이드 스캐너 악기와 컴퓨터를 켭니다.
    2. 은 "NDP 스​​캔"소프트웨어를 클릭합니다.
    3. "슬라이드 배치"슬라이드의 시리즈를 스캔 "반자동 모드"스캔 모드를 선택합니다.
      참고 : 순차 주사하는 동안 슬라이드를 집어 들고 로봇 팔은 유리 슬라이드의 가장자리에있는 요철에 매우 민감하다.
    4. 기계로로드하기 전에 모든 유리 슬라이드의 가장자리를 만져. 모든 커버 유리의 돌기 또는 건조 장착 매체가 있으면 커터 메스를 닦아.
    5. 슬라이드 카세트에 슬라이드를 넣습니다. 시편의 해치를 열고 위치 "하나"로 카세트를 밀어;. 문을 닫다.
    6. 컴퓨터 소프트웨어에서, 다음, "OK"버튼을 클릭 카세트에서 해당 위치에 모든 슬라이드에 짧은 설명 이름을 제공합니다.
    7. "브라이트"프로필 모드를 선택합니다.
    8. 임시 스캔을 시작하기 위해 "시작 배치"를 클릭합니다.
      참고 : 시스템이 모든 슬라이드를 스캔 완료되면, 소프트웨어는 자동으로 모든 슬라이드에 조직과 영역을 감지하고 관심의 영역으로 제안합니다.
    9. 필요한 경우, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 지역의 경계를 잡아 당겨 관심 영역을 재정의.
      참고 : 관심의 영역이 훨씬 긴 스캔 시간이 될 것 같은 슬라이드 과도하게 큰 영역을 정의.
    10. 모든 슬라이드에 대한 관심의 영역에 만족하면 모든 슬라이드를 스캔 시작 "스캔"을 클릭합니다.
      스캔 한 파일이 낮고 고해상도 디지털 관찰 할 수 있으며, 이미지는 JPEG로 내보낼 수 있습니다 참고 :파일.

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Results

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폐의 이상으로 쥐의 식별 기준에서 수행되었다. DT는 마우스가 8했다 종양 유도, 전 - 연령 12 주, 모든 쥐의 폐는 마이크로 CT로 스캔했다. 놀랍게도, 마우스의 약 50 %는 후속 연구에 포함하기에 부적합하다고 우리를 강제 이상을 보여 주었다. 이러한 이상이 결절 모양의 그림자, 큰 하나 또는 여러 개의 작은 기종 수포 및 / 또는 엽성 무기폐 (그림 1A, C, DE, GH)이었다. 그 후, FGF9의 유전자와 종양 유도 (이상 없음) 정상 폐 검사를 보였다 마우스는 폐포 세포 및 후속 종양 개발에 FGF9의 발현을 유도 독시 싸이클린 우 정기적 우로 전환했다 activated.Only했다. 종양 유도 개시에서 십주 후 마우스 폐에 종양 결절의 발전을 확인 마이크로 CT 스캔을 수행하기 위해 실시 하였다. 이들은 D 밝혀모든 마우스에서 변수 크기의 여러 결절의 evelopment (그...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

종양 결절의 발달 등 계획 폐암과 관련된 실험을 실시하고 과학자있게 폐암 동물 모델에서 치료에 대한 반응의 실시간 폐 기형의 식별 및 모니터링을 위해 여기에 설명 된 마이크로 CT 기반 방법 정확하고 효율적인 실험 시간과 자원을 절약하면서. 우리는 이전에 같은 목적으로 6 MRI를 사용했습니다. MRI와 폐 결절의 검출을위한 스캔 임계 값의 명확성이 연구 6에 기재된 마이크로 CT 스캔과 것과 떨어진다.

(다른 유전 적 배경과 종양 유도 방법과) 유사한 폐 선암 마우스 모델을 사용하는 이전의 연구는 분명 피하거나 그들이 마이크로 CT 스캐닝 9, 10을 사용했다 향상되었습니다 수있는 몇 가지 단점을 가지고 있었다. 그들은 이렇게 교란 위험, 어떤 사전 유도 폐 이상 또는 결절을 식별 할 수단이 없었다부적합한 동물을 포함하여 그 결과. 또한 유도 후 또는 (차 종양을 유도하는) 야생형 마우스에 암 세포를 전파 한 후 종...

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 건강 보조금 HL111190의 AEH (허가 번호 25461196)와 TB에 대한 JSPS KAKENHI에서의 원조 보조금 (보조금 번호 23390218과 15H04833) 및 국립 연구소 (DMO)에 의해 지원되었다. 저자는 동물의 유전자형과 조직 학적 섹션의 준비를 돕는 그녀의 노력에 대한 미유키 야마모토을 인정하고 싶습니다. 우리는 기술 지원 및 시약에 대한 공동 연구 자원, 의과 대학, 게이오 대학에 감사하고 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
마이크로-X-레이– 컴퓨터 단층 촬영RigakuR_mCT2
NanoZoomer RS 디지털 병리학 시스템하마마츠 RS C10730
NDP.view2  시청 소프트웨어하마마츠 U12388-01
http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html Isoflurane 기화기 - 퍼넬 필VETEQUIP911103
유도 챔버, 2 L  W9.5 &배; D23 &횟수; H9.5VETEQUIP941444
IsofluraneMylanES2303-01
AZD 4547LC LabratoriesA-1088
PentobarbitalKyoritsuSOM02-YA1312
G24 캐뉼라 TerumoSP-FS2419
파라포름알데히드Wako163-20145
MicrotomeLeicaRM2265
독시사이클린SLC 일본/PMI Nutrition International5TP7
ImageJ 소프트웨어 국립 보건http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet 연고 (구식 윤활제)DechraNDC 17033-211-38
원

References

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