여기에서 우리는 고립 된 인간의 혈소판 내가 로테를 억제제 복잡한에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 연구하는 생체 접근으로 모델을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법은 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 추적 동위 상대적 정량을 채용하고 연구 다양한 디자인을 적용 할 수있다.
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방법 논문
미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
교란된 미토콘드리아 대사는 다양한 질병에서 원인적인 역할을 하는 것으로 새로운 관심을 받고 있습니다. 대사 경로의 변화를 조사하려면 외부 요인을 잘 제어할 수 있는 모델이 필요하며, 이를 통해 재현 가능하고 의미 있는 결과를 얻을 수 있어야 합니다. 많은 연구에서 이러한 목적을 위해 형질전환된 세포 모델을 사용합니다. 그러나 많은 암 세포주에서 발생하는 대사 재프로그래밍은 혼란스러운 변수를 유발할 수 있습니다. 이러한 이유로 일차 세포가 바람직하지만, 대사 연구를 위한 적절한 바이오매스를 확보하는 것은 어려울 수 있습니다. 여기에서 우리는 인간 혈소판이 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 분석과 함께 대사 연구를 수행하기 위한 플랫폼으로 활용될 수 있음을 보여줍니다. 이 접근법은 상대적 정량화 및 동위원소 표지에 적합하여 특정 대사 경로의 활성을 조사할 수 있습니다. 개인 기증자 또는 혈액 은행에서 혈소판을 사용할 수 있기 때문에 이 모델 시스템을 임상 연구에 적용할 수 있으며 규모를 확대할 수 있습니다. 여기에서는 분리된 혈소판을 사용하여 복합 I 억제제 로테논에 대한 반응으로 이전에 확인된 보상 대사 변화를 확인합니다. 보다 구체적으로, 해당과정의 감소는 아세틸-CoA 수치를 유지하기 위한 지방산 산화의 증가를 동반합니다. 우리의 결과는 혈소판이 세포 대사에 대한 생체이물(xenobiotics)의 효과를 조사하기 위해 쉽게 접근할 수 있고 의학적으로 관련된 모델로 사용될 수 있음을 보여줍니다.
서론
역기능 미토콘드리아 대사는 신경 변성, 암, 심혈관 질환 (30)을 포함하여 다양한 질환에 연루되어왔다. 따라서, 많은 노력이 질병의 발병에 기여하는 대사 결함을 특성화에 배치되었습니다. 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS)는 복잡한 생물학적 매트릭스에서 분석의 정량화를위한 황금 표준으로 간주되며 종종 대사 연구 8 사용된다. 종종 인간의 질병과 관련이 접근하고 잘 정의 된 모델을 달성 생물 의학 연구의 경우입니다 그러나, 도전이다.
많은 연구는 세포 대사 7,9에 생체 이물질 또는 유전 적 이상의 영향을 프로빙을위한 세포 모델을 변형 사용한다. 혼란을 도입 할 수 암 세포에서 발생하는 대사 재 프로그래밍 (21) 요인 때문에 적합하지 않습니다. 이러한 문제는 circumve 될 수 있습니다대사 분석에 충분한 미생물을 얻는 것은 어려울 수 있지만, 일차 전지 모델 nted. 또한, 문화에 사용되는 항생제의 많은 양의 영향은 잠재적으로 혼란 미토콘드리아 연구 (16)과 같이 강조하고있다.
인간 혈소판 대사 연구 5,22,27,32 충분한 미토콘....
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프로토콜
윤리 정책 : 인간의 샘플의 처리에 관한 모든 프로토콜은 대학의 펜실베니아의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따르십시오.
버퍼의 1. 준비 및 100 배 스톡 솔루션
- 기본 타이로드의 버퍼 1 L를 준비합니다. 2 ∙ 2 H 2 O, 0.224 g의 KCl, 및 0.095 g의의 MgCl 2. DDH 2 O.과 1 L에 총 볼륨을 조정 8.123 g의 NaCl, 1.428 g의 수 NaHCO3, 0.466 g의 염화칼슘을 결합 필터는 기본 타이로드의 버퍼를 소독.
- 포도당과 팔 미트 산의 100 배 재고 솔루션을 준비합니다. 100 배 포도당 재고 솔루션의 경우, DDH 2 O 1 ㎖에서 100 mg의 포도당 또는 [13 C 6] 글루코스 공수를 용해 100 배 팔미 테이트 솔루션의 경우, 팔 미트 산의 2.56 mg을 에탄올 1 ㎖에서 [13 C 16] -palmitic 산 2.72 mg의 용해. 필터 100X 원액 살균.
- 적절한 농축 타이로드의 버퍼를 준비합니다
- 비 표지 연구....
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결과
우리가 노출 로테 논에 결과 이전에 설명한 보상 대사 적응의 일반화를 재현 한이 방법의 유용성을 입증합니다. 이 결과는 이전에 세포 배양 모델에서 발견되었으며,이 연구는이 대사 변화도 anuclear과 세포 배양과 같은 실험적 인공물 경향이없는 혈소판 발생하면 테스트하고자 하였다. 그들의 신진 대사 활동을 유지하지만,이 작품은, 인간의 주입을 위해 너무 오래된 것으로 간주되었던 펜 외상 센터, 6 일 된 혈소판을 시행 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이 아이솔레이션 하였다. 총 흐름이 더 이상 환자에게 투여하는 데 유용 혈소판 가용성 96- 웰 플레이트 기반 높은 처리량 임상 견본 또는 실험 조건의 한정된 수로부터 용이하게 확장 될 수있다.
우리 그룹은 이전에 나는 복잡한 (그림 2)의.......
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토론
여기에서 우리는 교란 미토콘드리아 대사 연구를위한 플랫폼으로 고립 된 혈소판의 유틸리티를 보여 주었다. 특히, 우리는 로테으로 복잡한 I 억제에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 특징으로하고있다.
본 연구는 인간의 혈소판에 세포 라인에서 로테 논에 의해 복잡한 I 억제의 역할 이전에보고 된 연구 결과를 확장했다. 중요한 것은,이 또한 억제 로테 혈소판 석시 닐 -CoA를 형성 혈소판 βHB 닐 -CoA의 증가를 자극하고 아세틸 -CoA의 혈소판 수준에 영향을 미치지 않는 것이 판명되었다.
큰 관심이 유형의 분석의 유효성 및 재현성을 보장하기 위해주의해야한다. 혈소판은 전혈로부터 분리 될 경우 림프구 오염 및 혈소판 활성화를 방지하기 위해, 전술 한 바와 같이, 상기 분리는 림프구 언 디스 포함 된 버피 코트를 떠나는 전념 특별한주의와 정확하게 진행해야turbed. 용량 반응 곡선은 의미가하기 위해서는, 연속 희석은 각 단계에서.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.
감사의 글
우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 T32ES019851의 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>시약 | |||
| 염화나트륨(NaCl) | 시그마-알드리치 | 746398 | |
| 중탄산나트륨(NaHCO3) | 시그마-알드리치 | S5761 | |
| 염화칼슘 이수화물(CaCl2 * H2O) | 시그마-알드리치 | 223506 | |
| 염화칼륨 (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 염화마그네슘 (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| 포도당 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| 팔미트산 | 케이맨 | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic | Acid Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| 물(H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (최적) |
| 포름산 | Fischer Scientific | 85171 | (최적) |
| 디메틸설폭사이드 | 시그마-알드리치 | 472301 | |
| 에탄올 | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| 메탄올 | 피셔 Scientific | A454-4 | (optima) |
| 암모늄 아세테이트 | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC 바이알(플라스틱) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml 유리 원심분리기 튜브 | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 오아시스 고체상 외출(SPE) 컬럼 | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer 피펫 | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 방수 인큐베이터 | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| 삼중 사중극자 질량 분석기 | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| 출처 | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC 컬럼 | Phenomenex | Luna C18 | 3 μ M 입자 크기, 200mm x 2mm |
참고문헌
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evide....
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재인쇄 및 허가
