HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

Sara Serra; Silvia Deaglio

doi:10.3791/54124

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방법 논문

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

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DOI:

10.3791/54124

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2016년 7월 20일

Sara Serra¹ , Silvia Deaglio¹

¹Department of Medical Sciences, Human Genetics Foundation (HuGeF), University of Turin

이 논문에서

요약

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 조건에서 배양된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포의 퓨린 대사를 측정하기 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 쉽고 재현 가능한 방법을 나타냅니다.

초록

이 방법은 민감하고 특이 신뢰성 및 재현성을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC) 분석을 개발하여 다양한 배양 조건 하에서 정제 만성 림프 구성 백혈병에 의해 생성 된 세포 외 퓨린 뉴클레오티드 및 뉴 클레오 시드 (CLL) 세포의 정량화 검증 설명 . 크로마토 그래피 아데노신 5'- 모노 포스페이트의 분리 (AMP), 아데노신 (ADO) 이노신 (INO)의 극성 화합물의 보존에 사용되는 실리카 계, 역상 컬럼상에서 RT에서 수행된다. 방법 / 분 1.00 mL의 유속으로 7mm의 암모늄 아세테이트 및 아세토 니트릴로 구성된 이진 이동상을 포함한다. 용출액은 260 nm에서 설정된 광 다이오드 어레이 UV 검출기를 이용하여 모니터링된다. 표준 검량선 각 퓨린 화합물의 분석 정량 식을 계산하기 위해 생성된다. 시스템 제어, 데이터 획득 및 분석이 수행된다. 이 프로토콜을 적용, AMP, 및 ADO INO은 각각 7, 11, 11.9 분에서 용출하고, 각 샘플의 총 실행 시간은 20 분이다. 이 프로토콜은 매트릭스로서 배양 배지를 이용하여 세포 유형 및 세포주 (현탁액 및 부착 모두) 다른 적용될 수있다. 이점은 간단하고 빠른 샘플 준비 및 분석을 위해 상등액을 소량의 요구이다. 또한, 무 혈청 배지를 사용하는 아세토 니트릴과 단백질 침전 단계를 건너 허용하는 영향 퓨린 화합물의 최종 농도. 방법의 한계 중 하나는 각각의 단일 샘플을 실행하기 전에 실행 평형 열의 요건 이상 실험의 총 동작 시간을 결정하고 높은 처리량 스크리닝 응용을 방지한다.

서론

아데노신 (ADO)가 글리코 시드 결합을 통해 리보스 당 분자 잔기에 부착 된 아데닌 분자와 퓨린 뉴 클레오 사이드이다. 되면 세포 외 환경에 존재하는, 상기 면역계의 작용에 의해 과도한 손상으로부터 세포를 보호한다. 이 역할은 예 ¹ 대장염, ^당뇨병이 천식 ³ 패혈증 ^4, 허혈 ^5와 같은 다른 질병 모델을 사용하여 강조되어왔다. ADO 주요 기능 중 하나는 종양 면역 회피 ^6에 기여 종양 미세 환경의 면역 반응을 억제한다. 이러한 이유로, ADO 형성과 관련된 시그널링 메커니즘은 상당한 치료 학적 이익 ^(7)이다.

조직의 미세 ADO 수준은 정상적인 생리 조건 하에서 확실하게 면역 세포의 감도 임계 값보다 상대적으로 낮다. 그러나 동안 저산소증, 허혈, 염증, 감염, 대사스트레스와 종양의 변화는 빠르게 ^팔을 높일 ^{수 있습니다.} 분비하고 분비 방법으로 조직 손상을보고하고 세포 보호 일반적으로 볼 수있는 조직 반응을 생성하기 위해 : 조직 교란 신호에 응답하여 상승 된 세포 수준 ADO는 이중 기능을 갖는다.

세포 ....