방법 논문

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

DOI:

10.3791/54171

⸱

2016년 10월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Oncology, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, 2Sino-British Research Centre for Molecular Oncology, National Center for International Research in Cell and Gene Therapy, Zhengzhou University, 3School of Basic Medical Sciences, Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

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CRISPR 관련 엔도뉴클레아제 Cas9는 단일 가이드 RNA(gRNA)에 의해 지시된 특정 게놈 유전자좌를 편집할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 시스템은 다양한 유기체의 게놈을 편집하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 여기에서는 RNA 유도 Cas9을 사용하여 VV에 감염된 CV-1 세포의 세포질에서 백시니아 바이러스(VV) 게놈을 편집하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. RNA-guided Cas9는 이중 가닥 DNA 절단을 유도하여 VV의 표적 부위에서 효율적이고 특이적으로 상동 재조합을 촉진하고 transgene은 상동 재조합에 의해 이러한 부위에 통합될 수 있습니다. transgene(s)과 함께 부위 특이적 상동 벡터를 사용함으로써, 이 영역에 통합된 적색 형광 단백질(RFP) 유전자를 가진 N1L 유전자 결실 VV는 기존 상동 재조합 방법에서 얻은 것보다 10배 더 높은 성공적인 재조합 효율로 생성되었습니다. 이 프로토콜은 RNA 유도 Cas9 시스템을 성공적으로 사용하여 향상된 효율성으로 돌연변이 VV를 생성하는 것을 보여줍니다.

서론

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백시 니아 바이러스 (VV)는 폭스 바이러스 제품군에 속하는 포락선 DNA 바이러스이며, 천연두의 박멸의 의학에서 가장 큰 업적 중 하나에 중요한 역할을하고있다. 천연두의 포스트 박멸의 시대에, VV는 VV 벡터로 다양한 병원체의 유전자를 삽입하여 HIV 및 기타 전염성 질환 1-7에 대한 백신에 대한 유전자를 전달하는 벡터로 개발되었다. VV 또한 광범위 특히 종양 타겟팅 복제 콜리 틱 백시 니아 바이러스의 개발을 위해 암 면역 8-14을위한 벡터로서 사용되었다. 암세포에 대한 향상된 선택성 효과적인 백신 벡터를 생성하기 위하여, 바이러스 게놈 내에서 변형 유전자 결실 또는 유전자 치료의 도입을 포함해야한다.

DNA 기술의 발달과 VV으로 분자 생물학 및 바이러스학, 외래 DNA의 삽입 나은 이해를 달성 하였다 원래D 1980 (15)에 상 동성 재조합 (HR)을 사용. 이 방법은 여전히 ​​VV 벡터를 구성하기위한 널리 사용되는 것입니다. 유전자 변형의 도입 이전에 감염된 세포에서 VV 게놈과 재조합 HR위한 셔틀 벡터를 사용하여 달성된다. 그러나,이 방법은 (1 % 미만의 상동 재조합 효율 16) 매우 비효율적 인 것으로 판명되었다 종종 비 대상 영역 및 / 또는 바이러스 팽창시의 마커의 손실에 선별 마커의 임의의 삽입을 초래한다.

게놈 유전자좌에 외래 DNA를 삽입 DNA 상동 재조합의 효율을 극적으로 이중 가닥 나누기 (DSBs) (17)의 존재로 향상 될 수있다. 따라서, 목표 궤적에서 DSBs을 유도 할 수있는 기술은 VV의 게놈 엔지니어링에 대한 큰 잠재력을 보유하고있다.

최근에 개발 된 CRISPR-Cas9 시스템은 VV 유전자 영역에 DSBs 트리거에 대한 약속을 보여줍니다. CRISPR-Cas9는 RNA-입니다침입 파지 및 기타 해외 유전 재료 18 ~ 20에 대한 적응 면역에 관여 인도 뉴 클레아. 미생물 종 (21)의 범위에서 세 CRISPR-CA는 시스템이있다. 유형 II-CRISPR 카스 시스템은 널리 진핵 세포 대규모 바이러스의 게놈 편집에 사용된다. 그것은 (연쇄상 구균 pyogenes의에서)에 RNA 유도 Cas9 효소로 구성되어, 하나의 가이드 RNA (sgRNA)와 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA) 22-24. Cas9 / sgRNA 복합체는 포유 동물 세포 22 5'- NGG-3 'Protospacer 인접 모티브 (PAM) 서열 23 항 상보 20 뉴클레오티드 게놈 서열을 인식한다. 성공적 유 전적으로 변형 된 세포, 바이러스의 효율적인 생성을 위해 사용 된 및 동물 모델 22-32.

CRISPR-Cas9 시스템은 VV의 세포질에서 상동 재조합과 함께 대상으로 게놈을위한 효율적인 도구가 될 입증 CV-1 세포를 감염S는 돌연변이 백시 니아 바이러스를 33, 34을 생성한다. 이러한 방법의 적용 가능성을 확장하기 위해, 우리는 이러한 시스템의 방법론에 대한 상세한 정보를 제시한다. 기술 된 프로토콜은 특정한 유전자 결실 돌연변이 VV를 생성 및 / 또는 치료 용 유전자와 돌연변이 바이러스를 암하는데 사용될 수있다.

프로토콜

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대상 RNA와 Cas9 구축 및 수리 기증자 벡터 1. 준비

  1. gRNAs의 클로닝
    1. 앞서 설명한 25 원리 다음 백시 니아 바이러스의 N1L 유전자 타겟팅 가이드 RNA 표적 서열을 디자인. 백시 니아 바이러스의 게놈에 대한 가이드 RNA 표적 서열 정렬 (이 경우, 백시 니아 바이러스 리스터 균주를) 상관 오프 - 타겟 gRNA 표적 서열을 배제한다.
    2. 합성하고 이전 25 바와 같이 gRNA 클로닝 벡터 내로 gRNA 올리고 클론. 생거 시퀀싱 (33)에 의해 생성 된 벡터의 각 개별 gRNA의 순서를 확인합니다. 결과 gRNA이 gRNA N2 (33)로 구성 이름을 지정합니다.
      주 : gRNA 대상 부위가 N1L 유전자 내이며, 왼팔, 오른쪽 아암 사이의 영역에 있다고 수리 공여체 벡터 커버 (도 1 참조).
  2. 에 핵 이행 시그널 (NLS)를 결여 Cas9 유전자를 복제pST1374 벡터와 PST-Cas9 (33)와 같은 구조를 지정합니다.
    주 : 포유 동물 발현 벡터는 복제 Cas9 발현 벡터의 구축에 사용될 수있다.
  3. HR 수리 기증자 벡터의 건설
    1. 수정 (33)의 대상 영역으로 VV의 N1L 유전자를 사용합니다. 왼쪽과 오른쪽 팔의 길이는 약 500-600 bp의 각 대상 영역을 측면 있는지 확인합니다.
      참고 : 왼쪽 팔 / 오른팔 대상 지역 50 bp의 중첩까지 가질 수있다 (그림 1 참조).
    2. 앞서 33, 34 바와 같이 N1L 영역 수리 공여체 벡터를 복제하고 PT-N1L로 수리 공여체 벡터를 나타낸다.
      참고 : 수리 기증자 벡터와 그 대상 지역에 대한 그림 1을 참조하십시오. VV의 다른 영역은 영역 (유전자) - 특정 gRNA (들) 및 지역별 수리 기증자 벡터를 사용하여 대상이 될 수 있습니다. 모든 클로닝 벡터는 수리 공여체 벡터의 구축에 사용될 수있다.
    3. 플라스미드의 확장
      1. 화학적으로 관할 E.으로 플라스미드를 변환 콜라이 제조업체의 지시에 따라. 제조사에 의해 제공된 프로토콜 참조 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다.

    2. 시드 세포 (1 일)

    1. 유지 CV-1, 37 ℃에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 세포 (원숭이 신장 섬유 아세포), 5 % CO와 함께 2.
    2. 80-90% 합류 있습니다를 Trypsinize CV-1 세포
      1. CV-1 세포를 함유하는 T-175 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거한다. PBS를을 잔류 혈청을 제거하고 대기음하기 위해 멸균 PBS의 5 mL를 단일 층을 씻어. 세포를 커버하고 세포 분리를 돕기 위해 약 5 분 동안 37 ° C 배양기에서 플라스크를 배치 할 2.5 mL를 1 × 트립신 - EDTA 솔루션을 추가합니다.
      2. 더하다세포 배양 배지 10 ㎖의 부드러운 피펫 작용에 의해 세포를 중단한다 (단계 2.1 참조). 혈구를 이용하여 세포 수를 카운트.
      3. 6 웰 플레이트에 시드 셀
        1. 6 웰 플레이트의 각 웰에 세포 배양 배지 2 ㎖에 시드 2 × 105 CV-1 세포 트랜 스펙 션 전날.
          참고 : 트립신을 제거하는 추가 원심 분리 단계는 필요하지 않습니다.

    Cas9 플라스미드 및 gRNA 플라스미드 3. 형질 (주 2)

    1. 0.5 μg의 PST-Cas9 플라스미드와 제조자의 지시에 따라 형질 감염 시약을 이용하여 0.5 μg의 gRNA N2 플라스미드 (단계 2.2.3.1에서 제조) 형질 CV-1 세포.
    2. 배양기에서 24 시간 동안 세포를 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2) (단계 2.1에 기재되어 있음) 새로운 세포 배양 배지로 2 ㎖의 배지를 교체한다.

    CV-1 세포 및 셔틀 기증자 V 4. 감염엑터 형질 HR에 대한 (3 일)

    1. 2 × 105 PFU / ml의 농도로 세포를 DMEM 배지로 백본 VVL15 바이러스 희석. Cas9 및 gRNA 플라스미드의 24 시간 후 형질 전환은 형질 CV-1 세포의 각 웰에 희석 바이러스의 100 μL를 추가합니다.
    2. 2 시간 후 바이러스 감염, 제조업체의 지침에 따라 형질 전환 시약을 사용하여 HR에 대한 VVL15 감염된 세포에 1.0 μg의 셔틀 기증자 벡터를 형질. 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 형질 감염된 세포를 놓습니다.

    5. 수확 재조합 바이러스 (4 일)

    1. 단계 4.2 HR위한 셔틀 도너 벡터 형질 감염 24 시간 후, 세포 스크래퍼를 이용하여 형질 감염된 CV-1 세포를 분리. cryovial에 세포 현탁액을 수집하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에 저장합니다.
      참고 : 즉시 살균제있는 모든 세포 배양 배지 유출을 닦아 다음 70 %이든 다시 닦아올.

    수정 된 VV 6. 정제 (1 라운드)

    1. 1 일에, 아니라 각 3 × 10 5 CV-1 세포와 함께 15 6 웰 플레이트 씨앗.
      1. 제 2 일에, 3 분 동안 37 ℃ 수욕 단계 5.1에서 동결 된 세포 현탁액을 해동 및 세포 파편을 제거하지 않은 세포 용 해물을 얻기 위해 30 초 동안 격렬 크리오 바이알 (cryovial)을 소용돌이.
    2. CV-1 세포의 한 6- 웰 플레이트를 감염, DMEM 3 ㎖의 세포 용 해물 1 μL로 희석하고 이미 미디어의 위에, 6 웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 세포 용 해물을 0.5 mL를 넣고 선물. 단계 6.1에서 제조 된 모든 6 웰 플레이트를 감염.
      참고 : 세포 파편의 제거가 필요하지 않습니다.
    3. 감염 이틀 후에는 (즉, 4 일째), 플라크의 위치를 선회함으로써 마커 펜을 사용하여 플레이트 아래의 플라크 10X 대물 렌즈를 이용하여 형광 현미경 하에서 RFP 양성 플라크를 식별 라벨.
      주 : 대표 RFP 양성 플라크 그림 3.
      1. 여섯 가지 RFP 양성 플라크를 데리러 200 μL의 무 혈청 DMEM 세포 배양 배지를 포함하는 여섯 표시 크리오 바이알 (cryovial)를 준비합니다. 표지 된 플라크 (들) (단계 6.3)를 웰로부터 세포 배양 배지를 흡인. 하는 P200 피펫에 200 μL 팁을 부착 30 μL에 볼륨을 설정 한 cryovial에서 ~ 10 μL 세포 배양 배지을.
      2. 매체를 방출하지 않고 피펫 푸시 버튼을 누른 채 하나의 표지 플라크의 영역을 스크래치 팁을 사용합니다. 분리 된 세포를 위로 들어 올려 무 혈청 DMEM 190 μL를 포함하는 cryovial로를 전송 피펫 푸시 버튼을 놓습니다.
      3. (마지막 단계)에서 긁힌 세포와 유리 병에서 다른 10 μL 매체를 가지고 가능한 한 많은 긁힌 세포를 수집하기 위해 동일한 RFP 양성 플라크를 세 번 따기의 절차를 반복합니다. 같은 유리 병에 모든 세포를 전송하고 -80 ° C에서 유리 병을 저장합니다.
        참고 : 정화의 두 번째 라운드가 즉시 수행되는 경우 또는, 10 분 동안 드라이 아이스에 크리오 바이알 (cryovial)을 동결.

    수정 된 VV의 7 정제 (두 번째 라운드)

    1. 각에 씨앗 3 × 10 5 CV-1 세포 아니라 여섯 6 웰 플레이트와 문화를 24 시간 동안 세포.
    2. 3 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (단계 6.3.3에서) 냉동 크리오 바이알 (cryovial)를 해동 후 세포 용 해물을 얻기 위해 30 초 동안 적극적으로 크리오 바이알 (cryovial) 와동.
      1. 6 웰 플레이트 잘 하나에 혼합 세포 용 해물의 0.5 μL를 추가합니다. 각 상패 하나의 6 웰 플레이트를 감염. 2 일 동안 5 % CO 2 (두 번째 라운드 상패 정화)와 37 ° C에서 VV 감염 6 웰 플레이트를 품어. 그런 다음 6.3 절을 반복합니다.
        참고 : 이상 여섯 RFP 양성 플라크가 포착 될 수있다 둘 이상의 6- 웰 플레이트는 각각의 플라크 정제를 위해 사용될 수있다.

    플라크 푸리 8. 또한 라운드문법 없애기

    1. 하나의 양성 플라크 형성 모든 플라크 현미경 RFP 양성인 것으로 나타날 때까지 단계 7에 기재된 동일한 프로토콜 다음 정제의 또 3-5 라운드에서 수행한다.
      참고 : 다음이 플라크가 순수한 것으로 간주됩니다.
    2. 플라크는 순수되면 6.3 절에 설명 된대로 (그림 4, RFP를 표현하는 모든 감염된 세포), -80 ° C에서 cryovial 및 저장에 긍정적 인 플라크를 수확. 단계 9와 10에 설명 된 프로토콜을 다음과 플라크를 확인합니다.

    9. 확장하고 정제 된 플라크 (들)

    1. 바이러스 감염 전에 6 웰 플레이트 1 일 각 웰에 씨 3 × 10 5 CV-1 세포.
    2. 세포 용 해물을 얻기 위해 3 분 동안 37 ° C의 수조에서 8.2에서 동결 해동 cryovial. CV-1 세포의 6 웰 플레이트 잘 하나에 (세포 파편을 제거하지 않고) 모든 해물을 추가한다 (단계 9.1에서 시드). 5 37 ° C에서 감염된 CV-1 세포를 품어최대 3 일 %의 CO 2.
      1. 모든 정제 된 플라크 (적어도 세 플라크)를 확장합니다.
        주 : 감염 시간 해물에서 바이러스의 양에 따라 1-3일 다르다.
    3. 50 % 이상의 세포들이 현미경 하에서 관찰 된 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낼 때, 셀 스크레이퍼를 사용하여 VV 감염된 세포를 수확 (세포는 쉽게 분리 및 RFP 긍정적 반올림). 15 ㎖의 튜브에 세포 배양 배지와 함께 분리 된 세포를 수집한다.
      1. 3 분간 300 g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상층 액을 제거하고 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 세포 펠렛을 유지하거나 10 단계 즉시 세포 펠렛을 사용합니다.

    PCR을 사용하여 돌연변이 VV의 수정 10. 확인

    1. 제조 업체의 프로토콜을 따르는 DNA 추출 키트를 사용하여 단계 9.3.1에서 제조 된 세포 펠렛에서 VV DNA를 추출합니다. 두 번 증류수 200 μL와 DNA를 용출.
      참고 : DNA를 추출하고 복제가 올바른 수정 / 삽입이 포함 된 것으로 확인되면 바이러스 생산을 위해 나머지를 유지하기 위해 펠릿의 볼륨의 절반을 사용합니다.
    2. N1L 유전자의 삭제와 N1L 영역으로 RFP 유전자 삽입 확인.
      1. N1L 유전자 (L025)와 N1L 유전자에 대해 고안된 프라이머를 사용하여 유전자 L026 걸친 DNA 단편을 증폭한다. RFP 특이 프라이머를 사용하여 RFP 유전자를 증폭한다. A52R 특이 적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 A52R 걸친 제어 DNA 단편을 증폭한다.
        참고 : 특정 프라이머에 대한 자료 목록을 참조하십시오.
        1. PCR의 마스터 믹스 키트를 사용하여 PCR을 수행한다. 25 μL DNA 템플릿의 2 μL를 사용하여 PCR 반응 세트, 2 분 동안 94 ° C에서 PCR 반응을 변성 한 후 다음 단계에 따라 PCR의 30주기를 실행 : 15 초 동안 94 ° C에서 DNA를 변성 후, 어닐링 15 초 동안 52 ° C에서 DNA 템플릿에 프라이머는 30 초 72 ° C에서 PCR 반응을 확장합니다.
    3. 1 % 아가로 오스 겔 (33)을 사용하여 PCR 산물을 해결. 자외선 겔 문서를 사용하여 겔 이미지를 캡처. N1L PCR이 부정하고 A52R 및 RFP의 PCR 양성이면 플라크 올바르게 N1L 영역으로 변경된다.

결과

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새로운 VV 벡터 건설 용 키 시작점 설계 및 게놈의 특정 영역을 대상으로 할 수있는 도너 셔틀 벡터를 생성하는 것이다. 이 연구에서, VV N1L 유전자는 예를 목표로 하였다. 재결합과 VV의 대상 영역에 대한 도너 셔틀 벡터의 카세트는도 1에 도시된다. 상동 재조합의 효율성을 향상시키기 위해, Cas9와 N1L 특정 gRNA 발현 플라스미드는 CV로 공동 형질 감염시켰다 상동 재조합 (33)을 수행하기 48 시간 전에 세포 -1. 하루 (24 시간) 후 형질은 RFP는 CV-1 세포 (그림 2)로 표현 하였다. 상동 재조합의 전체 해물 (5 단계)와 CV-1 세포의 감염 후 긍정적 인 RFP 및 음의 플라크는 모두 CV-1 세포 (그림 3)에서 관찰되었다. 정화 프로토콜 설명에 따라, 순수 플라크 공동 정화의 3-5 라운드 경기를 얻을 수 ULD. 도 4에 도시 된 바와 같이, 돌연변이 백시 니아 바이러스와 순수 플라크 유래의 세포 용 해물 감염 후 모든 플라크는 RFP 신호를 선보였다. 도 5에 도시 된 바와 같이 VV 정확한 유전자 변형 있던 순수 돌연변이, PCR은 표적 N1L 유전자의 부재를 확인하기 위해 사용되었는지를 확인하기 위해. 변형 된 바이러스의 PCR은 RFP에 긍정적 신호와 N1L 대한 존재 신호 (보여 도 5 레인 AG) 온전한 N1L 영역과 컨트롤 바이러스 (CTR)에 대한 N1L의 PCR 결과 양성된다. A52R의 제어 DNA 단편은 모든 재조합 바이러스 및 클릭률 바이러스에 양성이었다. RFP 양성 플라크의 HR 효율이 실험 (그 이전 일 34에서 94 %에 있었다)에서 100 % (6/6)입니다. 본원에 기재된 방법은 기존의 프로토콜 (33), (34)에 비해 100 배 재결합 효율이 향상되었다.

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그림 1. 상동 재조합 도너 셔틀 벡터의 카세트 및 VV 게놈의 표적 영역은 정제 마커 유전자 RFP는 H5 프로모터에 의해 구동된다. RFP에 유전자의 영역 N1L 결과 타겟팅 수리 도너 벡터는 상 동성 재조합 후 N1L 영역에 포함된다. 'X'는 백시 니아 바이러스 게놈에 동일한 시퀀스를 대체 할 수리 기증자 벡터의 상 동성 순서를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 :. afte 상동 재조합 후 CV-1 세포 1 일 이미징 어느 날R 상동 재조합, 수리 기증자 벡터에 의해 VV 감염과 형질 세포는 RFP-긍정적 A :. 위상 대비 이미지 (원본 배율 100 배) B :. 형광 현미경 이미지 (원래 배율 100 배)가. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :. 돌연변이 바이러스의 첫 번째 라운드 정화의 RFP 양성 플라크 돌연변이 바이러스의 1 라운드 정화에는 대상 영역 삭제와 RFP 양성 플라크 (레드 라인으로 동그라미는)에 의해 형성된 플라크에 의해 둘러싸여있다 야생 (노란색 선으로 동그라미) 형 바이러스 A :. 위상 대비 이미지 (원본 배율 100 배) B :. 형광 MICRoscopy 이미지 (원본 배율 100 배). 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4 :. VV는 정화의 3-5 라운드 후, 순수한 플라크 모든 플라크로 얻었다 순수한 돌연변이는 RFP 양성이었다 A :. 위상 대비 이미지 (원본 배율 100 배) B :. 형광 현미경 이미지 (원래 배율 100 배) . 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5 : VerificatioVV에서 추출 된 순수 돌연변이 VV. DNA의, n은 CV-1 세포를 감염. N1L N1L이 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인 된 대상 영역의 결실은 N1L 영역으로 RFP의 삽입은 RFP의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인 하였다. 레인 AF 여섯 정제 플라크에 해당 차선 G는 이전의 연구 (33)에서 확인 N1L 삭제와 제어 패이고, 차선 클릭률 (제어) (N1L 영역에 그대로 포함) 야생형 우두 바이러스입니다. A52R 유전자는 모든 샘플에 대한 제어 유전자로 증폭되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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치료 목적을위한 VV의 수정에 관한 두 가지 주요 목적이있다. 하나는 항 종양 치료 용으로 바이러스를 감쇠하는 티미 딘 키나제 (TK) 유전자로 특정 유전자를 제거한다. 다른 하나는 (예를 들면 GM-CSF와 같은) 원하는 치료 또는 유전자 (예 : 루시 페라 제 유전자 등) 마커 유전자 VV 팔이다. 이 중 하나를 달성하기 위해서는 대상 지역 / 유전자의 삭제를 포함한다. 직접적인 DNA 라이 게이션 방법 (35) 및 시험 관내 패키징 방법 36 TK 유전자 돌연변이와 변형 된 백시 니아 바이러스를 생성하기 위해 이전에 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법에 의한 게놈에서 고유 한 제한 효소 부위의 부족 게놈의 다른 영역의 돌연변이에 관한 어플리케이션을 한정하고있다. 돌연변이 VV를 만드는 현재의 접근 방식은 상동 재조합 incorporati을 유도 2 시간 VV 감염 후 CV-1 세포에 선택 마커 (RFP 또는 GFP)와 셔틀 (기증자) 벡터의 형질을 포함한다대상 영역으로 선택 마커를 ng를. 마커 양성 플라크의 선택은 자신의 정제 24 시간 후 형질옵니다. 플라크 정제 공정은 10 라운드까지 걸릴 마지막 3~4주 종종 오프 대상 지역에 삽입 선택 마커로 바람직하지 않은 재조합 바이러스에 이르게 할 수 있습니다. DNA 이중 가닥 나누기 효과적으로 포유 동물 세포 37 상동 재조합을 유도 할 수 있으며,이 메커니즘을 활용하여, 돌연변이 VV의 생성 효율을 대폭 향상시킬 수있다. gRNA 유도 Cas9 시스템 성공적 게놈 편집에 사용하고 (25), 진핵 생물 (22)에 상 동성 재조합의 효율을 향상시켜왔다. 최근에, 숙주 세포에서 헤르페스 심플 렉스 바이러스는 gRNA 유도 Cas9 의해 편집 된 I 아데노 바이러스 유형의 게놈 시스템 (24). 이는 최근 CRISPR Cas9 시스템 효율적 VV 게놈 편집 및 표현하는 VV 벡터를 구성하기위한 강력한 도구임을 입증되었다특정 유전자.

두 N1L gRNA 유도 Cas9과 기존의 상동 재조합 (HR) 방법은 N1L의 동일한 대상 사이트에서 성공적인 HR 이벤트의 결과. 흥미롭게도, 그러나 전통적인 HR 방법보다 효율이 훨씬 높은 수준에서 Cas9 유도 HR을 gRNA 유도. 따라서 gRNA 유도 Cas9의 사용은 돌연변이 VVS를 얻기 위해 많은 플라크를 정화 할 필요가 없다. 이 작품에서 우리는 크게 gRNA 유도 Cas9 시스템 (33)을 이용하여 돌연변이 VV의 생성 효율 및 시간 프레임을 개선. 참고로, 상동 재조합의 높은 효율을 얻기위한 하나의 중요한 단계는 종래의 상 동성 재조합을 수행하기 전에 24 시간 동안 Cas9 및 gRNA 발현 플라스미드와 CV-1 세포를 형질 감염이다. 24 시간 간격 Cas9 및 gRNA 합리적인 수준에서 표현 될 수있다. 우리가 다른 gRNA가 t 서열을 발견 게다가 특정 유전자 타겟팅 gRNA 순서 최적화 될 필요가있다argeting N1L 유전자 효율성 33, 34으로 변화.

편집 VV의 CRISPR / Cas9에 대한 제한은 재결합의 첫 번째 라운드에서 RFP 양성 플라크의 낮은 속도입니다. 지루한 스크리닝 1 차 만드는 재조합 바이러스를 포함 RFP 양성 플라크 충분한 수 보통 적어도 10 6- 웰 플레이트가 필요할를 얻었다. 따라서, 이러한 한계를 극복 할 수있는 프로토콜을 최적화 할 필요성이 여전히 존재한다.

RFP 양성 플라크의 작은 크기는 6 웰 플레이트를 감염시키기 위해 사용되는 용 해물의 고용량에 의한 또 다른 잠재적 인 문제이다. 이를 극복하기 위하여, 용 해물의 작은 부피가 큰 크기의 RFP 양성 플라크를 획득하기 위하여 6- 웰 플레이트를 감염시키기 위해 사용되어야한다. 분해물의 작은 부피를 사용해도 RFP-부정적인 RFP에서 양성 플라크의 더 나은 분리를 위해 사용된다. 따라서 플라크 정화의 적은 라운드 순수한 RFP 양성 플라크를 얻기 위해 필요합니다.

. CRISPR-Cas9 오프 대상 효과를 보여 주었다. VV 33 34 게놈 편집 그러나 gRNA 신중한 디자인, 오프 - 타겟 효과를 회피 할 수있다.이 VV의 게놈을 편집하는 gRNA 유도 Cas9 시스템을 사용하는 특정의 장점이다. 생물 의학 연구 및 병진 의학의 돌연변이 VVS의 개발을 가속화 할 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여, VV의 약속을 감안할 때. 또한, 이러한 시스템은 또한 그 액틴 기반의 운동을 위해 VV에 의해 사용되는 신호 전달 경로의 절개와 같은 세포 생물학의 발견을 촉진한다.

공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 MRC DPFS 보조금(MR/M015696/1) 및 중국 과학기술부(2013DFG32080)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Plasmid #4182441824AddgenegRNA cloning vector
pST137413426AddgeneCas9 cloning vector
pGEMT easyA1360promegarepair donor vector cloning
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliC4040-10Invitrogentransformation
QIAprep Spin Miniprep Kit 27106Qiagen플라스미드 추출
Dulbecco' s 이글' s 배지 (DMEM)11965-092Life Technologies세포 배양 배지
소 태아 혈청 (FBS) SH30088.03HIHyclone세포 배양 혈청
페니실린, 스트렙토마이신15070-063Thermo Scientific항생제
Effectene301425Qiagen트랜스펙션
Thermo Scientific Nalgene 극저온 바이알; 2.0  mLW-06754-96Thermo Scientific수집 바이러스
형광 현미경 Olympus BX51 형광 올림푸스는RFP 양성 plque
DNeasy Blood & 조직 키트69506QiagenDNA 추출
Extensor Long PCR ReddyMix 마스터 믹스AB-0794/BThermo ScientificPCR 시약
10cm 배양 접시Z688819-6EA시그마세포 배양 
6웰 플레이트Z707759 시그마세포 배양 
셀 스크레이퍼C5981시그마스크랩 셀
1x 트립신-EDTA 솔루션T4299시그마트립신화 세포
Virkon95015661Anachem Ltd소독제
팔콘 튜브CLS430791-500EA시그마홀드 셀 서스펜션
N1L 포워드 5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'시그마PCR 프라이머
N1L 리버스  5'-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'시그마PCR 프라이머
A52R 포워드 5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'시그마PCR 프라이머
A52R 리버스 5'-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3'시그마PCR 프라이머
RFP 포워드 5'- GCTACCGGACTCAGATCCA-3'    시그마PCR 프라이머
RFP 리버스 5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'시그마PCR 프라이머
ArgaroseA7431시그마리졸브 PCR 제품
G:BOX F3G:BOX F3SyngeneUV 젤 독

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CRISPR Cas9CV 1RFPN1L

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