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방법 논문

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

15.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54240

⸱

2016년 9월 6일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Graduate School of Sciences, The University of Tokyo, 2Faculty of Pharmaceutical Sciences, Doshisha Women's College

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

꿀벌 일벌은 군체 활동 유지와 관련된 다양한 작업에 종사하고 있습니다. 노동자의 업무는 나이에 따라 바뀝니다(연령에 따른 분업). 젊은 일꾼들은 새끼를 돌보는 일에 종사하고(수벌), 나이 든 일꾼들은 꿀과 꽃가루를 찾는 일에 종사합니다(수렵 채집자). 노동자의 생리학은 이러한 역할 변화와 관련하여 변화합니다. 예를 들어, 하인두선(HPG)의 주요 기능은 주요 로열젤리 단백질(MRJP)의 분비에서 탄수화물 대사 효소의 분비로 바뀝니다. 일반적인 군집에서는 일꾼이 나이가 들어감에 따라 일꾼의 업무가 변하기 때문에 노화와 함께 발생하는 생리적 변화를 역할 이동과 함께 발생하는 생리적 변화를 구별하기는 어렵다. 역할 이동과 관련하여 HPG를 포함한 일벌 조직의 생리적 변화를 연구하기 위해서는 거의 같은 나이의 일벌이 다른 작업을 수행하는 단일 코호트 군집을 준비하여 꿀벌 군집 개체군을 조작하는 것이 유용할 것입니다. 여기에서는 이 분석을 위해 단일 코호트 콜로니를 준비하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 단일 집단 군집 준비 후 6-8일이 지나면 평소보다 일찍 채집 작업을 수행하는 조숙한 채집자가 군체에 나타납니다. 대표적인 결과는 HPG 유전자 발현의 역할과 관련된 변화를 나타내었으며, 이는 역할과 관련된 HPG 기능을 시사합니다. 군체 개체군을 조작하는 것 외에도 내분비계 분석은 역할 관련 생리학을 조사하는 데 중요합니다. 여기에서는 엑디손의 활성 형태인 20-하이드록시엑디손(20E)과 청소년 호르몬 유사체인 메토프렌으로 근로자를 치료하기 위한 자세한 프로토콜도 설명합니다. 처리된 꿀벌의 생존율은 HPG의 유전자 발현을 조사하기에 충분했습니다. 20E 및/또는 메토프렌 처리에 대한 반응으로 유전자 발현 변화가 관찰되었으며, 이는 호르몬 처리가 HPG의 생리적 변화를 유도하는 것을 시사합니다. 여기에 설명된 호르몬 치료 프로토콜은 근로자 생리학에 대한 호르몬 효과를 조사하는 데 적합합니다.

서론

유럽 ​​꿀벌, API를 mellifera이는 고도로 조직 된 사회 (1)와 eusocial 곤충이다. 작업자 꿀벌 (노동 계급) 식민지 활동을 유지하기 위해 다양한 작업에 종사하고 있으며, 이러한 작업은 노동 2-4의 연령과 관련된 부문이라고 우화 후 작업자 꿀벌의 연령에 따라 변경합니다. 젊은 노동자 (<십삼일 세) 고령 근로자는 동안, 로얄 제리 (간호사 꿀벌)을 분비하여 하이브에 무리를 돌봐 (> 15 일)는 하이브 (초지) 2-4 이외의 꿀과 꽃가루를 수집합니다. 노동자의 생리는이 역할 변화와 관련하여 변경합니다. 예를 들어, 하인두암 샘 (HPGs)의 기능은 2,5를 구하고으로 간호의 역할 변화와 관련 외분비 머리에있는 땀샘, 변화를 쌍. 간호사 꿀벌 HPGs는 주로 꿀벌 우유의 주요 구성 요소 주요 로얄 젤리 단백질을 합성. 한편, 주로 사일리지의 HPGs포도당과 과당 수크로오스로 변환하여 허니에 꿀을 처리하기 위해, 예컨대 α 글루코 III 탄수화물 대사 효소를 합성한다. 우리의 이전 연구는 밝혀 그 역할 변화 6-9시 α - 글루코시다 III, 변경 내용을 암호화하는 주요 로얄 젤리 단백질 및 Hbg3를 인코딩 mrjp2의 표현.

HPGs 포함 작업자 조직에서 생리적 변화는, 롤 시프트 또는 작업자의 나이와 관련되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 단일 집단을 조제 같은 꿀벌 콜로니 인구 조성물을 조작하는 것이 유용 할 것이다 식민지는 거의 같은 나이의 노동자들은 다른 작업 10, 11을 수행합니다. 로빈슨 등의 알. (1989)는 단일 콜로니 10 코호트를 구축하는 방법을 설명했다. 단일 코호트 식민지 초기에 여왕과 0~2일 된 근로자를 포함한다. 며칠 식민지를 설정 한 후, ALM의 노동자같은 나이 OST 다른 작업을 가정합니다. 다른 근로자가 평소보다 일찍 꼴 작업을 수행함으로써 조숙 한 초지라고하는 반면 일부 노동자들은 전형적인 식민지로 간호 작업을 수행합니다. 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이의 유전자 발현 비교는 노동자 조직 12-16의 역할 관련된 생리에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 여기, 우리는 HPGs (16)의 역할 - 및 / 또는 연령 관련 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한 간단히 HPG 생리학을 평가하기 위해 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 mrjp2 및 Hbg3의 유전자 발현을 확인하는 방법을 설명한다.

단일 코호트 식민지에서 노동자 생리학의 분석뿐만 아니라, 내분비 시스템의 검사 역할 관련 작업자 생리의 규제 메커니즘을 분석하는 것이 중요하다. 알것입니다 청소년 호르몬 (JH)곤충 애벌레의 '현 상태'호르몬과 같은 WN, 작업자 꿀벌 11 꼴에 간호의 역할에 변화를 가속화합니다. 또한, 변형하는 동안 털갈이 호르몬으로 알려져있다 에크 디손은, 버섯 몸에 작업자 뇌 17-19의 높은 중심을 표현 에크 디손 신호 분자를 코딩하는 유전자와 같은 역할 변화에 관여 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 또한 HPG 생리학의 내분비 시스템의 효과 분석 (의 발현에 대한 자세한 에크 디손의 활성 형태 20E 근로자를 치료하기 위해 우리의 이전 연구 (16)에 사용되는 프로토콜 및 methoprene하는 JH 아날로그를 설명 mrjp2 및 Hbg3).

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프로토콜

단일 코호트 식민지 1. 준비

  1. 세 꿀벌 식민지 두 개의 단일 코호트 식민지를 만들려면 새로 등장 노동자의 충분한 수를 얻기 위해를 준비합니다.
    1. 콤에 덮인 주변 세포의 일부 번데기는 갈색 눈과 핀셋을 사용하여 출장 빗를 열어 착색 된 표피가 있는지 확인합니다. 이 번데기 주변 콤 세포에 존재하는 경우, 전체의 빗 번데기 대부분 약 1~3일을에 등장 할 것이다.
    2. 그 후, 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 된 후 이러한 번데기가 포함 된 빗를 수집하고 식민지 사이의 변동성을 최소화하기 위해 세 개의 식민지에서 빗 섞는다.
  2. 빈 하이브 상자에 수집 된 빗를 놓고 습한 조건에서 33 ° C (> 60 % 상대 습도)에 품어. 수집 된 빗에서 삼일 (식민지 3,000 근로자)을 통해 약 6,000 새롭게 등장 근로자를 수집합니다.
  3. worke의의 양을 결정오 새롭게 등장 노동자의 중량을 기준으로 R은 임의로 조작되지 식민지에서 수집.
    1. 무작위로 저울을 사용하여 조작되지 식민지에서 수집 한 다섯 새롭게 등장 노동자의 무게를.
      참고 : 다섯 새롭게 등장 근로자의 무게는 일반적으로 500-600 밀리그램이다.
    2. 오 새롭게 등장 근로자의 평균 무게에 의해 수집 된 노동자의 무게를 나누어 수집 된 노동자의 양을 추정한다.
  4. 수성 포스터 페인트 마커를 사용하여 약 1,800 근로자 (식민지 당 900 노동자)의 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다.
    참고 : 빨 마커 페인트를 적용하는 데 사용되는 재료의 표에 나열되어 있습니다.
  5. 두 빗, 한 빗 포함 꿀, 보존 식품 등의 꽃가루와 알을 낳는 여왕에 의해 또 다른 빈 빗 포함 된 새 하이브 상자에 여왕 약 3,000 0-2일 된 근로자를 소개합니다. 꿀과 꽃가루 FR이 포함 된 빗를 수집톰 모든 부착 꿀벌 후 다른 조작되지 식민지가 제거됩니다.
    참고 : 핵 하이브 상자 (소형 하이브 상자)의 사용을 권장합니다.
  6. 단일 코호트 식민지를 만든 후 6 ~ 8 일 페인트 마크 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 수집합니다.
    1. , 간호사 꿀벌 수집 한 무리 돌봐 빗 세포에 머리를 넣어 노동자를 선택합니다. 많은 무리와 성인 근로자를 포함 빗에서 간호사 꿀벌을 수집 핀셋을 사용합니다.
      참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 수집 된 근로자의 HPGs이 개발하는 경우, 이러한 노동자들은 간호사 꿀벌로 정의됩니다. 핀셋으로 흉곽을 잡고하는 콤 근로자를 선택하는 것이 좋습니다.
    2. 초지를 수집하려면, 자신의 뒷다리에 꽃가루 부하 자신의 두드러기로 돌아 근로자를 캡처하는 곤충 그물을 사용합니다.
      참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 캡처 노동자의 HPGs이 수축 나타날 경우 해당 근로자는 초지로 정의됩니다.
  7. CLAS세 그룹, '개발', '중간'으로 HPG를 sify하고, 실체 현미경 아래에서 절개하여 '말라 비틀어 진'.
    1. 꿀벌 비행 또는 걸을 수있을 때까지 10 ~ 15 분 동안 냉장고에 곤충 케이지에서 10 ~ 15 벌을 마취. 그런 다음 얼음에 꿀벌을 이동하고 5 분 동안 얼음에 마취를 완료합니다.
      참고 : 마취를 달성하기 위해 총 15 ~ 20 분 정도 걸립니다. 마취 시간을 단축 할 필요가있을 때에는 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다.
    2. 가위와 핀셋으로 몸에서 머리를 해부하다. 핀 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 머리를 고정합니다. 머리를 해결하기 위해 안테나의 기지에 두 개의 핀을 삽입합니다. 곤충 생리 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2)에 고정 된 머리를 만끽 해보세요.
    3. 쌍안 현미경 미세 핀셋을 사용하여 머리와 수술 용 칼의 표피의 앞쪽 부분을 제거합니다.
      주 : HPGs 용이 C 제거한 후 헤드에 있습니다uticle. HPG는 머리에 뇌의 주위에 존재하는 botryoid 기관이다.
    4. 표피 아래에 흰 막질 조직되는 기관 조직을 제거합니다. 그런 다음 천천히 족집게로 당겨 머리에서 HPGs을 해부하다.
    5. '개발'과 같은 대형 원형 꽈리와 HPGs를 분류. '말라 비틀어 진'작은 왜곡 꽈리와 HPGs를 분류. HPGs이 '중간'으로도 '개발'이나 '말라 비틀어 진'에 해당하는 분류.
      참고 : HPG 상태의 세 가지 클래스가 그림 2에 표시되어 보여 대표 사진.
    6. 주제 '개발'과 같은 RNA 추출에 '말라 비틀어 진'HPGs 각각과 간호사 꿀벌과 초지 (4 절) 사이의 HPGs에서 유전자 발현을 비교하는 '간호사 꿀벌 HPGs'와 '사일리지 콤바인 HPGs'.

20E 2. 주입

  1. DESCR 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 수집절차 1.6.1에서 ibed.
    참고 : 꿀벌을 사육하는 바와 같이 HPGs이 꿀벌에 검사 할 수 없습니다.
  2. 냉장고 (안 얼음)에서 4 ° C에서 꿀벌을 마취.
    참고 : 마취를 달성하기 위해 약 30 분 소요됩니다. 마취 시간이 단축되는 경우, 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다.
  3. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정.
  4. 유리 바늘 풀러를 사용하여 보정 된 모세관 마이크로 피펫으로부터 이루어지는 분사구를 사용하여 헤드의 전방 측면에 20E 액 1 μl를 주입한다.
    1. 에탄올 곤충 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2) 혼합물 (20E)를 용해 (1 : 4) 2.5 μg의에서 / μL.
    2. 고무 튜브에 분사구를 연결 관의 양측에 옐로우 마이크로 피펫 팁을 연결한다.
    3. 은 마이크로 피펫을 사용하여 파라 필름에 20E 솔루션 1 μl를 놓고 입에 노란색 마이크로 피펫 팁을 개최분사구로 용액을 그리 거라고.
    4. 안테나의 기본에 주입 팁을 삽입하고 노란색 마이크로 피펫 팁을 통해 불어 솔루션을 주입.
      주 :이 단계에 도시 된 프로토콜은 대표적인 주입 방법이지만, 자동 주입 장치의 사용이 20 필요한 안전 권장된다.
  5. 후면은 1 ~ 3 일 동안 어둡고 습한 조건 (> 60 % 상대 습도)에서 33 ~ 36 ℃에서 곤충 케이지에 주입 된 꿀벌 (이상적인 온도는 35 ° C)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 주사 후 꿀벌 생존 계산합니다.

Methoprene 3. 응용 프로그램

  1. 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 후 전형적인 식민지에서 번데기가 포함 된 빗를 수집합니다. 33 ~ 36 ℃에서 콤을 품어 일일 최대를위한 다습 한 조건에서 (> 60 % 상대 습도) (이상적인 온도는 35 ° C)입니다.
    2. 수집 된 빗에서 새로 등장 꿀벌 수집 및 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 프로토콜에 설명 된 포스터 페인트를 사용하여 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다. 그들의 식민지로 표시 꿀벌을 돌려줍니다.
  2. 육일 후, 식민지에서 (6 일 이전) 그린 근로자를 수집합니다. 핀셋으로 자신의 흉곽을 잡고 빗에서 그린 근로자를 선택합니다.
  3. 절차 2.2에서와 같이 (안 얼음) 냉장고에 4 ° C에서 꿀벌을 마취. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정 및 마이크로 피펫을 사용하여 머리에 아세톤에 용해 methoprene 용액 (50-250 μg의 / μL)의 1-5 μl를 적용합니다. 아세톤에 내성 필터 팁을 사용합니다.
    참고 : 아세톤 죽음에 이르는 꿀벌에 유해한 영향을 미칠 수 있습니다. 꿀벌의 높은 사망률이 관찰되는 경우, 최소 1 μL로 아세톤의 양의 감소가 권장된다.
  4. 후면 33 ~ 36 °의 C (이상적인 t에서 곤충 케이지에서 꿀벌럼 온은 어둡고 습한 조건에서 7 일간 35 ° C) (> 60 % 상대 습도)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 국소 적용 후 꿀벌 생존 계산합니다.
    참고 :이 기사에서는 생존 꿀벌 7 일 응용 프로그램 (표 3) 후 계산됩니다.

4. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR

  1. 꿀벌 마취 및 1.7.4에 단계 1.7.1에 설명 된대로 HPGs을 해부하다.
  2. 사용할 때까지 -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 microcentrifuge 관에서 해부 HPGs를 수집합니다.
  3. 단백질 변성을위한 시약 400 μl를 추가합니다.
    참고 :이 시약 (재료의 표 참조) 상업적으로 사용할 수 있습니다.
  4. 미세 원심 관 내부에 맞는 균질화 유봉과 전기 믹서 핸드 헬드를 사용하여 HPG 조직을 균질화. 끊는 얼음를 Lyse 조직 세포에 1 분 동안 약 300 rpm의 회전 속도로 균질화시킨다.
    참고 : 휴대용 전기 믹서가 시판되고 (재료의 표 참조).
  5. 80 μl의 클로로포름을 넣고 잘 섞는다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
  6. 4 ℃에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 단계를 전송합니다. 이소프로판올 1 μL 글리코겐 (5 ㎎ / ㎖)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 20 분 동안 -20 ℃에서 인큐베이션.
  7. 4 ° C에서 10 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
  8. 펠렛에 75 % 에탄올 400 μl를 추가하고 잘 혼합, 4 ° C에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 한 번 더이 절차를 반복합니다.
  9. 5-10 분 동안 펠렛을 공기 - 건조 후, 10 μL의 RNase가없는 물에 녹인다.
    참고 : 펠렛의 완전 건조가 물에 RNA 펠렛의 불용 화의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 젖은 펠렛은 적합용해.
  10. NanoDrop 또는 유사한 같은 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다.
  11. 어떤 오염 게놈 DNA를 분해하기 위해 30 분 동안 37 ℃에서 배양에서의 DNase I의 2.0 U와 총 RNA의 500 NG를 취급합니다.
  12. 역 전사의 DNase I 처리 RNA 200 NG 및 시판되는 키트를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 특이 적 프라이머 (mrjp2 (재료 및 시약의 테이블의 목록 참조) 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 '와 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). 다음과 같이 PCR을 수행 : 95 ° C X 30 초 + (95 ° C × 5 초 + 60 ° C X 15 초 + 72 ° C × 20 ​​초) 45 ~ 55주기를 X].
  13. 신장 인자 1α-F2 (EF1α˗F2) 또는 리보솜 단백질 49 (rp49) 9,16,21,22의와 성적 증명서의 양을 정상화. 이 유전자는 신뢰할 수있는 제어 g입니다QRT-PCR을 사용하여 HPGs 유전자 발현을 분석 ENES.
  14. 통계 소프트웨어를 사용하여 두 실험 그룹 (간호사 꿀벌 대 조숙 기계, 제어 꿀벌 대 20E 처리 꿀벌 및 제어 꿀벌 대 methoprene 처리 꿀벌) 사이에 유의 한 차이를 감지하는 두 개의 꼬리 t 테스트를 수행합니다.
    주 : F-테스트 분산의 균일 성을 가정하면, 스튜던트 t 검정을 사용할 수있다. 그렇지 않으면 웰치 t 테스트가 사용될 수있다.

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결과

단일 콜로니 코호트 제조 프로토콜의 개요는도 1a에 도시되어있다. 컬렉션 샘플 단일 코호트 식민지를 준비에서 실험의 시간 코스는 그림 1B에 표시됩니다. 간호 행동이나 구하고 행동에 대한 행동 기준을 만족 근로자는 단일 코호트 식민지에서 수집하고, HPG의 개발은 이러한 노동자 추정 표 1은 세 그룹으로 HPG 개발의 분류를 보여줍니다.; 크기에 따라 '개발', '중간'및 '주름진'. HPGs의 세 가지 클래스를 보여주는 대표적인 사진은 그림 2에 표시됩니다. 결과는 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 모두, 프로토콜에 설명 된 기준에 따라, 또한 단일 코호트 식민지에서 관찰되었다 나타냅니다. HPGs에 mrjp2 및 Hbg3의 발현이었다 엔HPG 기능은 작업자의 역할

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토론

단일 코호트 식민지의 제조

여기에서 우리는 일벌의 역할의 변화와 관련된 HPG 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하는 우리의 이전 연구 (16)에서 사용되는 프로토콜을 설명했다. 절차 1.6-1.7 및 그림 2에 설명 된 기준을 만족 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지는 단일 코호트 식민지 (표 1)에서 관찰되었다. HPG의 분류 기준으로 미국에서 그림 2의 사진은 유용 할 것이다. 노동자의 행동과 HPG 개발 모두에 따라 기준은 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 또는 초지를 정의하기위한 유효합니다. 점차 꼴로 간호의 역할 변화는 그 식민지에서 진행 : 그 꼴을 행동에 점차 역할 시프트 2시 증가하면서 간호 동작에서 보낸 시간의 양이 점차 감소한다. 따라서, 작업자가 그 독점적 수집하기 어렵다단지 행동 기준으로 간호 또는 꼴을 수행합니다. HP...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 일본 문부과학성(MEXT)의 과학 연구 보조금(B)과 혁신 분야 '시스템 분자 행동학'에 대한 과학 연구를 위한 보조금 보조금의 지원을 받았습니다. T.U.는 일본 젊은 과학자 과학 진흥 협회(Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists)로부터 보조금을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
UNIPOSCA미쓰비시 연필PC-5M벌에 표시를 적용하기 위한 마커 펜   
20-하이드록시엑다이손시그마 알드리치H5142
메토프렌시그마 알드리치33375
번식 케이스 곤충IRIS OHYAMACP-SS
전기모션 믹시어 ISO23M-R25조직의 균질화
TRIZol 시약Invitrogen15596-026총 RNA 추출
DNase I Takara2270A
PrimeScript RT 시약 키트TakaraRR037A역전사용 시약
SYBR Premix ExTaq IITakaraRR820A실시간 PCR
LightCycle 1.2 기기시약 Roche12011468001real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μ l)Real-Time PCR을 위한 재료4929292001Roche
용

참고문헌

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