Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.
Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.
कंकाल और हृदय की मांसपेशी संकुचन sarcoplasmic जालिका सीए 2 RYR द्वारा मध्यस्थता रिलीज से शुरू हो रहा है। वहाँ तीन कार्यात्मक चार समान सब यूनिटों से बना चैनल के साथ स्तनधारी RYR isoforms हैं। प्रत्येक RYR सबयूनिट एक बड़ी cytoplasmic नियामक एन टर्मिनल हिस्सा है और एक छोटी सी सी टर्मिनल हिस्सा transmembrane डोमेन है कि एक उच्च चालकता सीए 2 ताकना रूप से युक्त होते हैं। असामान्य अंतर और अंतर-सबयूनिट बातचीत RYR चैनल रोग आबाद और neuromuscular और हृदय संबंधी विकार 1 में परिणाम। पहचान और विशिष्ट RYR संरचना में शामिल डोमेन के लक्षण वर्णन: समारोह संबंध इसलिए RYR pathophysiology की समझ के लिए महत्वपूर्ण है।
पारंपरिक जैव रासायनिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत तकनीक शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में, अक्सर बैक्टीरिया में उत्पादन की आवश्यकता है। इस RYR, एक बहुत बड़ी झिल्ली पी के मामले में संभव नहीं हैrotein, ~ 5000 अमीनो एसिड से बना है, जबकि इसकी पुनः संयोजक टुकड़े आसानी से बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। इस प्रकार, वैकल्पिक अभिव्यक्ति यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं से जुड़े सिस्टम स्तनधारी अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के लिए आवश्यक हैं। हम पहले Y2H, सह आईपी और पार से जोड़ने assays कार्यरत है सामूहिक रूप से प्रदर्शित करने के लिए है कि एन टर्मिनस tetramerization एक संरचनात्मक विशेषता यह है कि संरक्षित है भर में तीन स्तनधारी RYR isoforms 2,3 है। महत्वपूर्ण बात है, हमने पाया कि एक बिंदु arrhythmogenic हृदय रोग के साथ जुड़े उत्परिवर्तन बाधित एन टर्मिनस स्वयं संघ और एक बेकार RYR चैनल 4 में परिणाम है। हम यह भी RYR cytoplasmic सी टर्मिनल पूंछ 5 के साथ-साथ मुताबिक़ intracellular सीए 2 रिलीज़ चैनल के एन टर्मिनस, inositol 1,4,5 trisphosphate रिसेप्टर 2 की oligomerization पढ़ाई करने के लिए इन तकनीकों को लागू किया है।
Y2H परख में, interactiपर बीच दो प्रोटीन (एक्स और वाई) एक कार्यात्मक प्रतिलेखन कारक (GAL4) और रिपोर्टर जीन 6-9 की आगामी सक्रियण के पुनर्गठन से मापा जाता है। डीएनए बाध्यकारी डोमेन (डीएनए-बी) / प्रोटीन एक्स संलयन (चारा) और सक्रियण डोमेन (ई) / प्रोटीन Y: दो अलग अलग क्लोनिंग वैक्टर GAL4 के दो शारीरिक रूप से पृथक करने, स्वतंत्र डोमेन के साथ दो परीक्षण किया प्रोटीन के मिश्रण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं संलयन (लक्ष्य)। Y2H एक प्रोटीन GAL4 डीएनए बी.डी. और एक ही प्रोटीन की ई fusions उत्पन्न करके खुद के साथ सूचना का आदान प्रदान के लिए कि क्या परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित Y2H उपभेदों Gal4 और GAL80 कर रहे हैं की कमी (GAL80 प्रोटीन GAL4 की एक repressor है), के रूप में अच्छी तरह से TRP1 और LEU2 की कमी के रूप में (चारा और शिकार plasmids के लिए पोषण चयन प्रदान करने के लिए, क्रमशः)। खमीर नाभिक में, पुनः संयोजक डीएनए बी और ई पेप्टाइड्स बंद शारीरिक निकटता में लाया जाता है तो केवल अपने fusions 'एक्स के माध्यम से एक संकर GAL4 प्रतिलेखन कारक उत्पादन करने के लिए: वाई interaction। इस दृष्टिकोण और रिपोर्टर जीन (β-galactosidase (β-लड़की) के लिए lacZ एन्कोडिंग) chromogenic (एक एंजाइम हिस्टिडीन जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक लिए HIS3 एन्कोडिंग) prototrophic की समानांतर transcriptional सक्रियण के माध्यम से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए तेजी से आनुवंशिक स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है। Y2H का मुख्य लाभ यह है कि यह एक विवो परख है कि यहां तक कि कमजोर या क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाता है। इसके अलावा, पता लगाने सरल विकास चयन की (मीडिया कमी हिस्टिडीन में) चारा और लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि या विशिष्ट एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए कोई जरूरत के साथ उपयोग या एक वर्णमिति की (β-लड़की) परख शामिल है। इसके अतिरिक्त, Y2H यादृच्छिक अज्ञात क्लोन (सीडीएनए पुस्तकालय GAL4 ईसवी से जुड़े हुए क्लोन) एक चारा प्रोटीन के उपन्यास बंधन भागीदारों भी पुस्तकालय प्रोटीन की सीडीएनए तक सीधी पहुंच देने के लिए का एक संग्रह स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Y2H टिप्पणियों का विस्तार करने के लिए, independईएनटी जैव रासायनिक तकनीक नियोजित किया जा सकता है। सह-आईपी और immunoblotting के साथ संयुक्त पार से जोड़ने assays जटिल नमूना मिश्रण में प्रोटीन संघों का पता लगाने के तरीकों का इस्तेमाल किया है, उदाहरण।, पूरे सेल lysates 10 हैं। उनका मुख्य लाभ यह है कि वे देशी ऊतकों से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर रिपोर्ट, अन्य तरीकों पुनः संयोजक प्रोटीन के उपयोग की आवश्यकता है कि विपरीत है। पुनः संयोजक प्रोटीन भी इस्तेमाल किया जा सकता है आम तौर पर एक स्तनधारी सेल लाइन, जहां वे अपने सही रचना और बाद translational संशोधनों की संभावना है, साथ ही subcellular स्थानीयकरण में व्यक्त किया। हालांकि, बाद से सह-आईपी और पार से जोड़ने विट्रो assays homogenized कोशिकाओं का इस्तेमाल करने में कर रहे हैं, यह आवश्यक है कि क्या इस बात की पुष्टि करने के लिए दो प्रोटीन के भागीदारों बरकरार सेल 11 में सह-स्थानीय कर रहे हैं है। हम नियमित रूप से स्तनधारी HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक का उपयोग क्षणिक स्तनधारी अभिन्न झिल्ली और साइटोसोलिक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कैल्शियम फास्फेट वर्षा विधि 2 का उपयोग-4,12-14, विस्तार में यहाँ का वर्णन किया। यह एक सस्ता तरीका कुशलता से कोशिकाओं के अंदर प्लास्मिड डीएनए वितरित करने के लिए है, लेकिन यह प्रयोग किया जाता विशेष सेल लाइन और सेल संगम, साथ ही प्लास्मिड डीएनए 11,15 की शुद्धता पर निर्भर है।
सह-आईपी परख गैर अप्राकृतिकरण की स्थिति ख्यात बातचीत भागीदारों के 10,16 के सह-शुद्धि को सक्षम करने के तहत सेल lysates से ब्याज की देशी या पुनः संयोजक प्रोटीन के अलगाव शामिल है। यह दो अलग अलग मिलान के साथ दो अलग fusions उत्पन्न करके एक प्रोटीन के साथ ही सूचना का आदान कि क्या परीक्षण करने के लिए दो स्वतंत्र एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, प्रोटीन एक्स के अलगाव के लिए immunoprecipitating एंटीबॉडी, और प्रोटीन साथी वाई का पता लगाने के लिए immunoblotting एंटीबॉडी यह प्रयोग किया जा सकता है की आवश्यकता टैग (उदा।, हा और cMyc)। immunoprecipitating एंटीबॉडी, प्रोटीन एक पर अपनी एफसी क्षेत्र के माध्यम से ही है (प्रोटीन जी, जानवरों की प्रजातियों में जहां एंटीबॉडी उठाया गया था पर निर्भर करता है या) जोagarose के लिए (या sepharose) राल संयुग्मित है। सेल lysate, homogenized कोशिकाओं के अर्थात् डिटर्जेंट में घुलनशील अंश के साथ ऊष्मायन के बाद प्रोटीन एक राल: प्रोटीन एक्स एंटीबॉडी से उपजी है। प्रोटीन इम्युनो-परिसरों बफर एसडीएस युक्त है और बाद में एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया और प्रोटीन की उपस्थिति Y 17 पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting साथ eluted हैं। सह-आईपी अत्यधिक गैर विशिष्ट बंधन से बचने के लिए डिटर्जेंट में घुलनशील प्रोटीन के साथ बाहर किया जाना चाहिए। Y जोड़ी 10,16,18: डिटर्जेंट और अपनी एकाग्रता की पसंद है, साथ ही साथ washes की संख्या, प्रत्येक एक्स के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
पार से जोड़ने oligomeric प्रोटीन परिसर के stoichiometry निर्धारित करने के लिए कार्यरत है। यह आसन्न बातचीत protomers के बीच सहसंयोजक बांड बनाने के लिए एक रासायनिक प्रतिक्रिया पर आधारित है, और इसलिए, यह एसडीएस पृष्ठ जुदाई के दौरान प्रोटीन के oligomeric स्थिति के संरक्षण के लिए सक्षम बनाता है। कई पार से जोड़ने Reage रहे हैंविभिन्न लंबाई और रसायन शास्त्र प्रोटीन, आम तौर पर प्राथमिक amines, कार्बोक्जिलिक या thiol समूहों पर विभिन्न प्रतिक्रियाशील समूहों को निशाना बनाने का एनटीएस। यहाँ, हम glutaraldehyde के उपयोग का वर्णन (OHC (सीएच 2) 3 चो), एक होमोसेक्सुअल द्वि-कार्यात्मक दोनों छोर कि लाइसिन अवशेषों 19,20 में मौजूद मुक्त अमीनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया पर दो एल्डिहाइड समूहों के साथ पार linker। पार से जोड़ने की एक एकाग्रता या समय पर निर्भर ढंग अभिवर्तन गठन में जिसके परिणामस्वरूप में पीछा किया जाता है। Glutaraldehyde प्रतिक्रिया hydrazine (एच 2 NNH 2) और प्रोटीन के नमूने तो एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया और उनके oligomerization स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए 17 immunoblotting रहे हैं के साथ बंद कर दिया है। हम उस पार से जोड़ने oligomerization प्रेरित नहीं करता नोट करना चाहिए लेकिन केवल पहले से मौजूद प्रोटीन परिसरों के बीच स्थिर पुलों बनाता है। महत्वपूर्ण विचार जब पार से जोड़ने प्रयोगों से बाहर ले जाने के पार linker, अपनी एकाग्रता और प्रतिक्रिया समय 19,20 की पसंद में शामिल हैं।
प्रोटीन होमो-oligomers के गठन के एक मौलिक जैविक प्रक्रिया है कि प्रतिलेखन कारक, एंजाइमों, आयन चैनल और रिसेप्टर्स 25,26 की गतिविधि को नियंत्रित करता है। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटीन oligomerization भी neurodegeneration और arrhythmogenic हृदय रोग 4,27 सहित रोग प्रभाव पड़ता है। के तरीके में इस अनुच्छेद में उल्लिखित मध्यस्थता प्रोटीन स्वयं संघ और oligomerization डोमेन-डोमेन बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। नीचे, हम प्रत्येक प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम पर इंगित करें, और हम महत्वपूर्ण विचार, सीमाओं और निवारण पर चर्चा की।
Y2H प्रणाली संभावित इसके अपेक्षाकृत उच्च throughput प्रदर्शन की वजह से बातचीत प्रोटीन भागीदारों, उपयोग की आसानी और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए स्क्रीन करने के लिए पहली नियोजित किया जा सकता है। Y2H प्रक्रियाओं मानक (प्लेट या प्रकार के बरतन) इन्क्यूबेटरों और कमरे रोकथाम सुविधाओं के साथ एक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में किया जाता है। मंगलवार के उपयोग केजबकि β-लड़की assays में अच्छे परिणाम के लिए, हौसले खमीर कालोनियों उगाया (वर्ष 5 दिनों के लिए) (कदम 1.2.3) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए eshly तैयार सक्षम कोशिकाओं (कदम 1.1.8), उच्च दक्षता खमीर परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है। Gal4 और / या अतिरिक्त / वैकल्पिक रिपोर्टर जीन के अलावा अन्य प्रतिलेखन कारकों पर आधारित सिस्टम उपलब्ध हैं, और इसलिए चारा और शिकार plasmids उचित Y2H तनाव के साथ मिलान किया जाना चाहिए।
कुछ उपभेदों 3-अमीनो-1,2,4-triazole, HIS3 प्रोटीन की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध की उपस्थिति में सुसंस्कृत होना चाहिए, आदेश HIS3 रिपोर्टर जीन 7.8 के किसी भी विधान अभिव्यक्ति बुझाने के लिए। चारा और लक्ष्य संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति 17 immunoblotting द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए। मामले में चारा / शिकार संलयन प्रोटीन खमीर को विषाक्त कर रहे हैं, कम सहनीय प्रोटीन का स्तर अलग वैक्टर जहां चारा / शिकार अभिव्यक्ति एक अलग प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है में क्लोनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, यह टी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैटोपी चारा / शिकार संलयन प्रोटीन स्वायत्त पत्रकार जीन गतिविधि प्रदर्शित नहीं करते। स्वायत्त पत्रकार जीन सक्रियण निर्माण को संशोधित जिम्मेदार क्षेत्र को हटाने के द्वारा बचाया जा सकता है, या दो का परीक्षण किया प्रोटीन के लिए GAL4 डीएनए बी और ई fusions गमागमन द्वारा। इसके अलावा, transmembrane डोमेन बेहतर चारा / शिकार निर्माणों से छोड़े गए हैं, क्योंकि वे intracellular झिल्ली डिब्बों में misfolding या संलयन प्रोटीन की mislocalization उत्पन्न हो सकता है। दरअसल, Y2H प्रणाली के मुख्य नुकसान यह है कि चारा और लक्ष्य प्रोटीन झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक बातचीत 6-9, जिसके परिणामस्वरूप में खमीर नाभिक में स्थानीय कर रहे हैं, विशेष बाद translational संशोधनों की कमी उनके शारीरिक subcellular स्थान से दूर है और संभावित है ।
स्तनधारी heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम बेहतर रचना, बाद translational संशोधनों और subcellular स्थानीयकरण के मामले में स्तनधारी अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं।सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सेल अभिकर्मक तरीकों में से एक है, जिसका मुख्य कारण न्यूनतम उपकरणों की, कैल्शियम फास्फेट वर्षा है और अभिकर्मकों 11,15 की आवश्यकता है। वैकल्पिक तरीकों, अर्थात् electroporation, liposomes, cationic लिपिड और पॉलिमर, सेल लाइन के आधार पर उच्च अभिकर्मक दक्षता उपज और इस्तेमाल का निर्माण कर सकता है। सामान्य में, अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित करने वाले कारकों प्राथमिक प्लास्मिड डीएनए गुणवत्ता और सेल स्वास्थ्य / व्यवहार्यता हैं। सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब उच्चतम शुद्धता के (260nm / 280nm absorbance के अनुपात ~ 1.8) और सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के डीएनए का इस्तेमाल किया जाता है। 70% संगम (कदम 2.1.2), क्योंकि विदेशी डीएनए लेने की क्षमता मध्यम 11 से अवगत कराया सेल की सतह क्षेत्र से संबंधित है – कोशिकाओं इसलिए कोई 60 से अधिक पर ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अभिकर्मक (कदम 2.1.3) के दौरान संस्कृति के माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के शामिल किए जाने से वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु 15 के कारण सलाह नहीं दी है।
एफया 2x HBS समाधान (कदम 2.1.1) की विशेष रूप से, सावधान तैयारी और पीएच समायोजन (7.05 ठीक करने के लिए) में कैल्शियम फास्फेट वर्षा, और प्लास्मिड डीएनए / कैल्शियम / जोरदार मिश्रण (कदम 2.1.5) द्वारा फॉस्फेट परिसरों की उचित गठन हैं उच्च दक्षता अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण कदम। आमतौर पर, 24 के भीतर क्षणिक अभिकर्मक चोटियों से प्रोटीन अभिव्यक्ति – 72 घंटा।
एक बार कोशिकाओं काटा जाता है, बाद में प्रक्रियाओं प्रोटीज गतिविधि को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाना चाहिए, और प्रोटीज अवरोधकों के अलावा सिफारिश की है। सेल homogenization क्योंकि गुणसूत्र डीएनए समाधान चिपचिपापन बढ़ाने के लिए और बढ़ाने के गैर विशिष्ट बंधन सकता नाभिक को हटाने के लिए एक centrifugation कदम से पालन किया जाना चाहिए। इस प्रकार, एक आईएसओ आसमाटिक बफर में यांत्रिक तरीकों से homogenization पसंद किया जाता है, आम तौर पर में (0.3 एम) सुक्रोज या (150 मिमी) सोडियम क्लोराइड। सामान्य में, सूक्रोज आधारित बफ़र्स प्रोटीन स्थिरता को बढ़ाने के लिए और संभावित गैर देशी प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए जाना जाता है, लेकिन पी के कारणप्रोटीन की सतह पर referential हाइड्रेशन, इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत इष्ट हैं। इसके विपरीत, नमक आधारित बफ़र्स प्रोटीन सतह पर आरोप लगाया अमीनो एसिड पक्ष समूहों का शुद्ध प्रभारी को प्रभावित करती है, इस प्रकार अधिक हाइड्रोफोबिक के आधार पर बातचीत 28 की दिशा में एक पूर्वाग्रह कर रही है।
सह-आईपी विशेष रूप से देशी ऊतकों से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का आकलन करने के लिए सबसे अधिक कार्यरत जैव रासायनिक परख है। इसके मुख्य दोष आईपी में इस्तेमाल करते हैं और 10,16,18 immunoblotting के लिए मान्य अति विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए आवश्यकता है। इस प्रकार, पुनः संयोजक प्रोटीन अक्सर एक पेप्टाइड मिलान के साथ टैग कर रहे हैं, उदाहरण के लिए।, इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (YPYDVPDYA) या मानव cMyc (EQKLISEEDL), जिसके लिए उच्च आत्मीयता विशिष्ट एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। अगर वांछित, immunoprecipitating एंटीबॉडी रासायनिक प्रोटीन एक राल पर संयुग्मित किया जा सकता immunoblotting चरण के दौरान अपने क्षालन और पता लगाने के अस्पष्ट हो सकता है कि सह उपजी जनसंपर्क से बचने के लिएotein 16; इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हम सफलतापूर्वक रासायनिक पार linker 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate), 24 का इस्तेमाल किया है। यह जरूरी है कि एक उचित डिटर्जेंट आईपी बफर में शामिल है और homogenized कोशिकाओं के अघुलनशील सामग्री गैर विशिष्ट बंधन (कदम 3.1.3) को कम से कम करने के लिए centrifugation द्वारा हटा दिया जाता है। चुनाव और डिटर्जेंट की एकाग्रता महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं: मजबूत डिटर्जेंट और / या उच्च सांद्रता काफी बाध्यकारी गैर विशिष्ट कम हो जाएगा, लेकिन यह भी समाप्त हो सकती है x: y प्रोटीन बातचीत, कम सांद्रता या मामूली डिटर्जेंट की अनुमति हो सकती है, जबकि एक कमजोर बातचीत मनाया जा सकता है, लेकिन अत्यधिक गैर विशिष्ट बंधन में परिणाम। इंटरमीडिएट ताकत डिटर्जेंट पसंद कर रहे हैं, जैसे, ट्राइटन X-100 0.5 पर -। 1% एकाग्रता। आगे गैर विशिष्ट बंधन, एक तटस्थ प्रोटीन को कम करने के लिए (जैसे, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में गोजातीय सीरम albumin) आईपी बफर में शामिल किया जा सकता है, और / या सेल lysate पूर्व Cleare जा सकती हैअकेले प्रोटीन एक राल के साथ पहले ऊष्मायन के साथ घ। washes की संख्या एक्स के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए: वाई जोड़ी का परीक्षण किया, आईपी बफर (कदम 3.1.9) के साथ आम तौर पर तीन 10 मिनट washes। किसी भी मामले में, immunoprecipitating एंटीबॉडी के रूप में गैर प्रतिरक्षा आईजीजी के साथ एक सह-आईपी नमूना हमेशा समानांतर में संसाधित किया जाना चाहिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण (कदम 3.1.6) सेवा के लिए।
रासायनिक पार से जोड़ने का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रोटीन होमो-oligomer की stoichiometric संरचना पर बताते है। Glutaraldehyde आमतौर पर इस्तेमाल किया पार linker क्योंकि यह कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और यह बातचीत प्रोटीन 19,20 के बीच thermally और रासायनिक स्थिर पार लिंक उत्पन्न करता है। मुक्त अमीनो समूहों के साथ यौगिकों परख बफ़र्स (कदम 3.2.1) से छोड़े गए किया जाना चाहिए, क्योंकि वे रासायनिक प्रतिक्रिया बुझाना होगा। Glutaraldehyde एकाग्रता और प्रतिक्रिया समय (कदम 3.2.4) ब्याज की oligomeric प्रोटीन परिसर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस तकनीक, especi के मुख्य दोषसहयोगी जब पूरे सेल की तैयारियों पर प्रदर्शन किया, रासायनिक प्रतिक्रिया है कि कृत्रिम प्रोटीन समुच्चय है कि जैविक महत्व की कमी उपज सकता है की गैर विशिष्टता है।
विवो में वैकल्पिक (जैसे।, प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण, द्वि-आणविक प्रतिदीप्ति या luminescence पूरक) और इन विट्रो तकनीक में (जैसे।, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, विश्लेषणात्मक ultracentrifugation, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति) प्रोटीन स्वयं संघ और मूल्यांकन के लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध हैं oligomerization stoichiometry 29,30 की। प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान है, और यह एक विशेष प्रोटीन प्रोटीन शुद्धि / स्थिरता और उपकरण / अभिकर्मक उपलब्धता पर निर्भर करता है के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। तीन पूरक विस्तार, अर्थात् Y2H, सह आईपी और पार से जोड़ने में यहाँ वर्णित विधियों, संयोजन में इस्तेमाल किया गया है RyR2 होमो-oligome के लिए मजबूर सबूत प्रदान करने के लिएअलगाव में और एक जीवित कोशिका के भीतर आर गठन।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के SZ (एफएस / 08/063 और FS / 15/30 / +३१,४९४) को ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया।
1. PART 1 yeast two-hybrid | |||
Plate incubator | Hereaus | B6120 | Used at 30°C |
Orbital shaker incubator | New Brunswick Scientific | INNOVA 4300 | Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm |
Spectrophotometer | Perkin Elmer | Lambda Bio+ | To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay |
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit | Takara Clontech | K1604-1 | Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2 and yeast strain Y190 |
Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y0626 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan | Sigma-Aldrich | Y0750 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine | Sigma-Aldrich | Y2001 | To prepare minimal SD growh medium |
Herring testes carrier DNA | Takara Clontech | 630440 | For yeast transformation |
Whatman filter paper Grade 5 | Sigma-Aldrich | WHA1005070 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | B4252 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | N1127 | for use in liquid b-Gal assay |
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line | |||
HEK293 cell line | ATCC | ATCC® CRL-1573™ | |
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) | SANYO | MCO-18AIC | To culture mammalian cells |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) | Invitrogen (ThermoFisher) | 41966 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (ThermoFisher) | 10500 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Glass beads | Sigma-Aldrich | G8772 | To homogenise cells |
Needle 23G (0.6 x 30mm) | BD Microlance | 300700 | To homogenise cells |
Protease inhibitor cocktail (Complete) | Roche | 11873508001 | To prevent proteolysis |
PART 3. In vitro biochemical methods | |||
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) | Bio-Rad | 1658000EDU | For polyacrylamide gel electrophoresis |
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) | Bio-Rad | 1703940 | For electrophoretic transfer |
Compact X-ray film processor | Xograph | X4 | For use in immunoblotting |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | For use in chemical cross-linking |
Protein-A sepharose beads | GE Healthcare Life Sciences | 17-5280-01 | For use in co-IP assay |
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | For use in co-IP assay |
Non-immune rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | For use in co-IP assay |
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | For use in immunoblotting |
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) | Covance | MMS-101P | For use in immunoblotting |
Anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | For use in immunoblotting |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare Life Sciences | 28906836 | For use in immunoblotting |
ECL Western Blotting Substrate | Pierce (ThermoFisher) | 32106 | For use in immunoblotting |