애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

요약

여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.

초록

야생 제브라 피쉬는 ZZ / ZW 성 결정 시스템을 가지고 있지만, 길 들여진 제브라 피쉬는 성 염색체를 잃었다. 그들은 게놈가 공동으로 개별 물고기의 성 정체성을 결정 전반에 걸쳐 여러 유전자가 분산 polygenic 성 결정 시스템을 활용합니다. 현재 유전자는 생식소의 발달을 조절에 관여하고 작동 방법이 어려운 남아있다. 일반적으로, 성선 조직을 분리하는 것은 성 발달 과정을 조사하기위한 첫 번째 단계입니다. 여기서 우리는 zebrafish의 유충 DPF (17) DPF (일 포스트 수정) 25에서 성선 조직을 분리하는 방법을 제시한다. 분리 된 성선 조직은 연속적 형태 및 유전자 발현 프로파일 링에 의해 조사 할 수있다.

서론

야생 제브라 피쉬 염색체 4의 주요 여성 성 결정은 ¹ (즉, 일반적인 실험실 균주)를 분실하거나 들여진 제브라 피쉬에서 수정됩니다. 대신, 그들은 온도, 저산소증, 식품 가용성 및 인구 밀도 등 환경 요인에 의해 동행 polygenic 성 결정 시스템을 가지고있다. 제브라 피쉬 성 개발의 상세한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 일차 성 판정 신호 (들) / 무엇 이러한 제브라 성 결정이 발생한 경우 등의 근본적인 문제가 있으며, 유전자 생식선 변환의 제 1 ^{단계는, (3) 2} 답변 남아 조절한다.

제브라 피쉬 성 개발의 과정에서 몇 가지 중요한 단계로 인식되고있다. 개발의 초기 단계에서, 4 HPF (시간 포스트 수정) 원시 생식 세포 (PGC와) 사양을 받아야에서 시작 생식기 능선 마이그레이션 및분아 증식. PGC 번호와 생식 세포와 체세포 사이의 상호 작용은 생식선 차별화 ⁴ 중요하다. 13 DPF (일 포스트 수정)에서, 생식선은 미분화 단계에 있습니다. 17 DPF으로 생식선 미래의 여성과 남성 모두에서 양방향 가능성이 ....

프로토콜

Zebrafish의 실험은 복단 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. Zebrafish의 표준 절차 ^(20)에 따라 상승과 사육되었다.

1. 준비

1. 애벌레 zebrafish의 DPF (17) DPF 25 육성
   1. 교차 전날 늦은 오후에 건너 탱크로 전송이 남성과 두 여성 성인 제브라 피쉬 (건강, 기존 3 개월에서 6 개월, 실험실 앱 스트레인). 장벽으로 남성과 여성을 분리합니다. 다음 날 아침, 탱크의 물을 새로하고 그들이 짝짓기를 할 수 있도록 장벽을 제거합니다. 100mm 배양 접시 수정 후 1 ~ 2 시간에서 계란을 수집합니다.
   2. 초기 개발 시간 (4 일) 동안 285 ° C에서 40 mL의 배아 매체 (EM)가 100mm의 접시에 약 40 배아를 유지하고 하루 두번 EM을 새로. 1 L 탱크 (300 mL의 시스템 물 (40) 유충)에 유충을 전송하고 5 DPF 후 라이브 로티퍼 (전체 공급, 하루에 두 번)로 공급.10 DPF 후 대신 로티퍼 다이어트의 라이브 소금물 새우 피드. ²¹ DPF (14)에 다시 물 순환 시스템에 물고기를 전송합니다.
   3. DPF (1....

결과

생식기의 해부는 앱 스트레인 애벌레 제브라 피쉬에서 수행되었다. 도 1은 DPF (17)와 DPF (25)에서 유충 지브라 피쉬의 전형적인 생식선의 조직을 보여준다. 첫째, 피부와 복부의 한 쪽의 근육은 내부 장기를 노출 절단한다. 내부 장기의 질량을 제거한 후, 함께 생식소와 부레 트렁크에 남아 있습니다. 생식선은 ( '도 1b에 화살표) 부레의 복부 측면에 부착 하였다. DPF (17)에서, 생식선은 양방향 전위 난소 스테이지였다. 분리 된 생식선은 좌우 생식선을 포함하고 (그림 1C) 반투명했다. 대부분의 경우에서, 상피 조직과 protonephridium (도 1c의 화살표)로 둘러싸여 있었다. 생식선 DPF (2.......

토론

제브라 피쉬는 강력한 모델이되었다 광범위하게 개발 및 질병 관련 연구에 사용됩니다. 뇌, 심장, 생식선, 신장 등의 성인 제브라 피쉬에서 기관의 분리를위한 방법은,도 ^{23, 24, 25를} 기록하고있다. 때문에 작은 크기와 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직의 역동적 인 리모델링에, 성선 조직의 분리가 어려운 작업입니다. 애벌레 생식선 ^(26)을 조사 EGFP를 기반으로 셀 정렬 및 레이저 미세 절제 : 이전의 연구는 전체 해부 트렁크 조직이나 형질 전환 바사을 사용했다. 순화 동안 4 번 염색체의 변형은 결정 성 들여진 지브라 피쉬의 비밀을 만든다. 여기에 설명 된 우리의 방법은 성 결정 MECH을 탐구하는 것이 도움이 될 수있는 추가적인 형태 학적 및 분자 시험을 상대적으로 깨끗하고 초기 생식선 준비를 제공 할 수 있습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 접시 100 mm	Corning	430167	배아 배양
20x EM			1 L 필요: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl 및 2.9 g CaCl· 추가; 2H2O; 그런 다음 0.41g KH2PO4, 0.412g Na2HPO4 무수 및 4.9g MgSO4·을 추가합니다. 7H2O.
1x EM			증류수에 20x EM 희석
AGAROSE G-10	유전자	121985	2 % 한천 플레이트 제조
용 Trizol 시약	Invitrogen	15596-026	RNA 분리
용 미터 유리	Shen Bo	250 ml	2 % 한천 플레이트 준비
용 전자 레인지	Midea M1-211A	한천
가열 용Tweezer DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissectionmicroscope
	Motic	SMZ168	For dispiration
Pure water equipment	Millipore
Ringer' s 용액			L가 필요한 경우 : 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2< / sub> 및 1.19 g Hepes를 추가합니다. 그런 다음 1 L로 채 웁니다. pH를 7.2로 조정합니다. 여과에 의해 살균하고 오토클레이브 처리된 투명한 폴리카보네이트 용기에 보관하십시오.
트랜스퍼 피펫	Samco	202, 204
메탈 배스	QiLinbeier		모델 GL-150
현미경	Leica	M205 FA	현미경 사진용
원심분리기	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	생식선 조직에서 RNA 분리용
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	RNA 용액의 DNA 분해용
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	first-strand cDNA 합성용
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	cDNA 용액의 잔류 RNA를 분해하는 데 사용됩니다.
SYBR Green Realtime PCR 마스터 믹스	TOYOBO	QPK-201	이 제품은 Real-Time PCR을 위한 Taq DNA 중합효소 기반 2x 마스터 믹스이며, SYBR Green I을 사용한 삽입 분석에 적용 가능합니다.
분광 광도계	Ne Drop	OD-2000+	전체 RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	유전자 발현 프로파일링

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