마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.
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이 논문에서
요약
초록
파라핀 내장 조직 섹션은 조직 조직학 및 조직 병리학을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 3 차원 조직 형태가 그런 절에서 무엇인지 결정하는 것은 어렵습니다. 또한 검사 된 조직의 섹션에는 진행중인 연구의 목적에 필요한 조직 내의 영역이 포함되지 않을 수 있습니다. 이러한 후자의 제한은 혈관 병변이 집중된 방식으로 발달하기 때문에 혈관의 조직 병리학 적 연구를 방해한다. 이것은 우리가 혈관 벽의 넓은 영역을 표면에서 더 깊은 영역까지 조사 할 수있게하는 방법을 필요로합니다. 혈관의 전면적 인 준비가이 요구 사항을 충족시킵니다. 이 기사에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 안면 조영 및 공 촛점 현미경 및 형광 기반 이미징의 다른 유형을 면역 형광으로 조제하는 방법을 보여줍니다.
서론
광학 현미경에 의한 조직 병리학 적 연구를 위해, 파라핀 매입 (paraffin embedment) 및 절편 화 및 염색을 위해 생물학적 조직의 3 차원 조각을 통상적으로 처리한다. 파라핀이 묻혀있는 조직 샘플은 3 차원 모두 수 밀리미터가 될 수 있습니다. 그러나, 광학 현미경 검사의 목적을 위해, 빛이 통과 할 수 있도록 먼저 절단되어야하며, 따라서 얇은 부분이 이미징을 위해 충분한 대비를 생성하도록 염색되어야합니다. 절편 된 시편은 일반적으로 두께가 5-10 μm이기 때문에 한 번에 2 차원으로 전체 시편의 매우 작은 부분 만 볼 수 있습니다. 순차적 섹션을 수집하고 각 섹션을 개별적으로 이미징 한 후에 3D 이미지의 컴퓨터를 이용한 재구성을 수행 할 수는 있지만 실제로 지루한 작업입니다. 혈관의 조직 병리학, 특히 죽상 동맥 경화증의 병인 생리를 연구하는 데는 독특한 문제가 있습니다. 죽상 동맥 경화증은 발병하는 집중 질환입니다.혈류가 방해받는 곳에서 국부적으로 또한, 질병은 내막, 큰 동맥의 내피 세포와 세포 외 매트릭스의 단일 층으로 구성된 얇은 조직 내에서 시작됩니다. 이러한 이유 때문에 절개 된 혈관을 사용하여 초기 병변을 찾고 연구하는 것이 쉽지 않기 때문에 병변을 절개하지 못할 수 있습니다. 절에 병이있는 부분이 포함되어 있어도 배지 및 외막에 내피 세포와 기타 혈관벽 세....
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프로토콜
안면 면역 염색을위한 마우스 부분 경동맥 결찰 및 마우스 대동맥 및 경동맥의 분리에 대한 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IBT 2014-9231)의 승인을 받았습니다.
1. 좌 경부 동맥 결찰술
- 테이블에 12 인치 x 14 인치의 가열 패드를 놓고 외과 공간을 준비하고 패드와 테이블 위에 큰 깨끗한 수술 용 드레이프를 덮으십시오. 실체 현미경의 시야가 가열 패드의 가운데 부분에 오도록 붐 스탠드의 암을 조정하십시오.
- 테이블의 히팅 패드를 켜고 3 단계 조절 다이얼을 중간 열 수준으로 설정합니다. 이 온도 설정에서 수술 보드 표면 (1.6.1 참조)은 38-40 ° C가됩니다.
- 다른 가열 패드 위에 깨끗한 케이지를 놓습니다. 위와 같이 가열 패드를 켜십시오. 이 케이지는 수술 후 회복 (1.16 참조)과 주거에 사용됩니다.
- 수술 테이블 위에 홍채 가위 (1 쌍), 조직 집게 (1 쌍), 수퍼 그립 집게 (2 쌍), 스프링 가위 (1 쌍), 둔기 견인기 (1 쌍, 2.5mm 폭)가있는 고압 가압 멸균 주머니를 넣고, , 라운드 처리 바늘 홀더 (1), 살균 6-0 실크 봉합사, 면화 팁 응용 프로그램, 미니 면....
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결과
endothelium의 전형적인 얼굴 면역 형광 이미지가 그림 3 에 나와 있습니다. 이 이미지는 늑간 동맥 (큰 어두운 달걀 모양의 영역)의 개통 근처에서 찍은 마우스 대동맥의 단일 광학 섹션을 보여줍니다. 대동맥은 항 -VE- 카데 린 (녹색) 및 항 -VCAM-1 (혈관 세포 접착 분자 -1) (적색)으로 이중 염색되었다. 각 내피 세포는 adherens junction에서 녹색 선형 염색으로 윤곽이 그려져 있습니다. 시편의 미세한 불균일 때문에 일부 광학 접합점은이 광학 섹션 외부에 있습니다. 항문-VCAM-1 염색은 방해받는 혈류가 발생하는 것으로 알려진 늑간 동맥이 열릴 때 더 강합니다. 도 4는 항 -VE- 카데 린 (녹색), 항 -BCAM-1 (적색), 및 DAPI (보라색)를 갖는 경동맥의 엉성한 염색을 도시한다. 좌 경동맥 (LCA)은 부분적으로 결찰되었고 오른쪽 경동맥 (RCA)은 손상되지.......
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토론
마우스 혈관을 취급 할 때, 내피가 부서지기 쉽고 과도한 기계적 힘이 내피 세포를 손상 시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 혈관이 수동으로 주사기를 사용하여 관류 될 때 쉽게 발생할 수있는 혈관이 너무 강하게 관류되는 경우 혈관벽에서 내피 세포가 깨지거나 분리됩니다.
일정한 관류 압력을 얻기 위해 우리는 120 cm의 수증기압을 갖는 중력 관류 시스템을 사용합니다. 변형에 따라 다른 마우스의 평균 동맥압은 130 ~ 170 cm H 2 O 14의 범위에 이르는 것으로보고되었습니다. 따라서 우리가 사용하는 관류 압력은 측정 된 동맥압보다 약간 낮습니다. 우리가 재관류 고정 쥐 대동맥, 90cm H 2 O 칼럼 압력이 사용되었습니다.
원위치 내피 세포는 수확 중에 배가 늘어나도 손상됩니다, 청소, 세로 분리, 면역 염색 및 장착........
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감사의 글
저자의 연구 활동은 국립 보건원 (National Institute of Health)의 Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551)의 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 염화나트륨 주입 용액 USP 500 mL 봉지 | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-웰 플레이트 | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 코팅 비크릴 봉합사 | Ethicon | J833G | |
| AF488 염소 항쥐 IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 염소 안티-토끼 IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) 토끼 다클론 IgG | Santa Cruze 생명공학 | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| 오토클레이브 랩. 24 인치 x 24 인치 | Cardinal Health | 4024 | |
| 블런트 리트랙터, 2.5 mm 넓이 | 의 Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| 클로르헥시딘 스크럽, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity 거즈 스폰지 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| 전기 가열 패드, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| 마이크로 커버 유리 22mm x 50mm | VWR | 48393059 | |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| 일반 염소 혈청 | Equitech-Bio | GS05 | |
| 파라포름알데히드 용액 PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| 페트리 접시 100mm x 15mm | Fisher 과학적인 | FB0875713 | |
| DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| 청교도 코르톤 면봉 | VWR | 10806-005 | |
| 청교도 미니 코튼 팁 애플리케이터 | VWR | 82004-050 | |
| 원형 핸들 바늘 홀더 | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| 실크 봉합사 6/0 | Fine Science 도구 | 18020-60 | |
| 스프링 가위 | ROBOZ | RS-5601 | |
| 사시 가위 | 정밀 과학 도구 | 14075-09 | |
| 슈퍼 그립 겸자 | 정밀 과학 도구 | 00649-11 | |
| 투명 드레싱 | 추기경 건강 | TD-26C | |
| 트리톤 X-1000 | 피셔 사이언티픽 | AC327371000 |
참고문헌
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
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