Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

요약

인간의 망막 fovea, 흑점, 그리고 주변 망막을 포함 하 여 기능 및 분자로 별개 영역 구성 됩니다. 여기, 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 사용 하 여 부하 다운스트림 proteomic 분석이 고유한 망막 영역을 수집 하는 방법을 설명 합니다.

초록

인간의 망막 혈관 맥락 막 층을 단단히 complexed은 감각 neuroretina 및 근본적인 망막 안료 상피 (RPE)의 구성 됩니다. 망막의 다른 영역은 해부학 및 분자로 독특한, 독특한 기능을 촉진 하 고 질병에 차동 민감성을 보여주는입니다. 각 이러한 영역 및 레이어 Proteomic 분석 연령 황 반 변성 (AMD), 녹 내장, 당뇨병, 등 많은 질병의 분자 과정에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나, 망막 지역과 계층의 분리 정량 proteomic 분석을 수행할 수 있습니다 전에 필수적 이다. 여기, 해 부 및 컬렉션의 시야, 황 반, 및 주변 망막 영역 및 근본적인 RPE 맥락 막 복잡 한, 지역 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 등 다운스트림 proteomic 분석 뿐만 아니라 1 차원 SDS 페이지 사용할 수 있습니다 각 해 부 망막 층에 단백질을 식별 하기 위해 망막 질환에 대 한 분자 biomarkers를 공개.

서론

망막, RPE, 및 맥락 막 단백질 표정, 생리 적 기능 및 병 적인 감정^1,2에서 중요 한 지역 차이 보여 주는 복잡 한 조직이 있습니다. 예를 들어 등 의학 황 반 변성 (AMD), 망막 화, 중심 장 액 망막 질환 각 질병 특성 지역화 fovea, 흑점, 또는 망막 주변^{1,3, 설명 4,6}. 여기, 우리가 어떻게 다른 망막 영역 수 수 독립적으로 샘플링 하지를 보여주는 방법 제시. 이 방법의 전반적인 목표 proteomic 분석에 대 한 인간의 망막 및 RPE 맥락 막 시야, 황 반, 및 주변 지역에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한 신뢰할 수 있는 가이드를 제공 하는 것입니다. 개발 및이 기술의 사용에 대 한 근거는 이러한 특정 망막 지역, 중요 한 분자 통찰력이이 지역의 생리 및 병 태 생리 기능에 기록 될 수 있습니다의 proteomic 분석을 통해.

이 접근에는 상대 지역 질병 감정, proteomic....

프로토콜

이 연구는 아이오와의 대학에 의해 승인 되었다 ' s 기관 검토 위원회와 헬싱키의 선언에 명시 된 신조에 고착.

1. Foveal 및 황 반 생 검 펀치

오픈 및 나비 인간의 눈, 그것은 조직의 4 별도 플랩의 이전 게시에 설명 된 대로 구성 되어 그런
1. . ⁵
2. butterflied 육안 페 트리 접시에 배치와 함께 시작, 4 m m 펀치 생 검 도구는 fovea에 센터, 누르고는 fovea 주위 절 개를 만든 때까지 부드럽게 롤.
3. 다음, 중심 및 망막의 아케이드 내 8 m m 피부 펀치 생 검 도구를 누르고, 부드러운 압력을 적용 및 압 연 하 여 황 반 주위 절 개를 생성 합니다. 이 조직 둘러싼 첫 번째의 두 번째, 외부 반지를 생산할 예정 이다.

2. 주변 망막 생 검 펀치

아케이드 밖에 주변 망막에서 펀치의 시리즈를 만들기 위하여

1. 사용 4 mm 피부 펀치 생 검 도구. 여기, 각 사분면 플랩에 대 한 두 개의 펀치를 확인.
   참고: 모든 펀치 만들어집니다, 눈 fovea 및 망막, 대표 센터, 2 개의 동심 펀치를 가질 것이 고 두 각 플랩....

결과

망막 및 맥락 막의 RPE 조직 개별 조사에 맞게 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 수령 후, 연구원 망막 및 RPE 맥락 막 시야 지역, 외부 망막 및 주변 망막 (그림 1)에서 조직 샘플을가지고 것입니다. 특히, 시야 지역 펀치는 fovea, parafovea, 및 인접 한 perifovea의 작은 금액을 포함 됩니다. 황 반 펀치 perifoveal 지역 뿐만 아니라 인접 한 근처 주변 지역의 작은 금액 나머지 포함 됩니다. 마지막으로, 주변 펀치 샘플 중간 주변 멀리 주변 지역. 대표적인 실험에서 조직 샘플 트립 신 소화 했다 고 단백질 함량 (그림 2A)을 시각화 하기 위해 1 차원 SDS 페이지를 사용 하 여 분석. 이 분석의 결과 것 망막의 여러 지역 중에서 독특한 단백질을 좋습니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)

토론

조직 후 컬렉션, 샘플 처리 및 치료입니다 중요 한 고려 사항¹⁴. 액체 질소에 보존은 선호 화학 기정에 후자 손상 될 수 있습니다 다운스트림 분석을 기울일 수 있는 단백질 구조. 또한, 액체 질소 보존 샘플의 포함 하지 않는 방법을 선호입니다. 특히, 페 러 외. 4 ° C 또는 0 ° C¹⁵에 저장에 비해 상 온에서 보존 하는 뇌 샘플 사이 단백질 수준에서 큰 차이가 나타났다. 또한, 그것은 어는 단백질 수준 및 포스트 번역 상 수정^16,17를 변경 하기 전에 특정 화학 및 물리 치료로 샘플을 처리할 때 주의 해야 하는 것이 중요. 이 샘플의 의도 다운스트림 분석 고려의 중요성을 강조. 별도로, 사후 타이밍 수확 하는 조직 수준 및 특정 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요인은 이다. 저하는 시간 사후 및 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-mm 스킨 펀치 생검 도구	Miltex	REF 33-34
8-mm 스킨 펀치 생검 도구	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
액체 질소	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]