항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
항 체 항 원 바인딩 도메인 Fc 영역을 통해 바이러스 성 병원 체에 대 한 타고 난 및 적응형 면역 응답 커플링에 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리가 활성화를 측정 하는 방법에 설명 Fc의 단일 클론 항 체는 활성화 표현 유전자 조작된 Jurkat 세포 라인의 사용으로 인플루엔자 바이러스 조류를 대상으로 하 여 이펙터 기능 입력 1 Fc-FcγR. 전송 시각:이 메서드를 사용 합니다 특정 Fc-FcγR 상호 작용 면역 글로불린에 의해 수 여의 생체 외에서 분석 결과 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
서론
계절 독감 백신에서 제공 하는 면역은 전통적으로 hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과1, 대상으로 하는 조류의 수용 체 바인딩 사이트 항 체의 존재를 측정 하 여 평가 되었습니다. 이러한이 활성 항 체 살 균 면역을 부여 수 있습니다 하지만 일반적으로 인플루엔자 바이러스의 단지 선택 몇 가지 계통에 면역을 제공 하는 보호의 그들의 범위에서 좁은. 격리 및 조류 (HA)를 인식 하는 광범위 하 게 반응 단일 클론 항 체의 특성화 제안 범용 인플루엔자 백신의 개발은 도달 시간2,,34, 5 , 6 , 7 , 8. 인플루엔자 바이러스9,10,,1112 의 보존된 지역으로 강한 항 체 응답을 유도 하는 것은 보편적인 인플루엔자 백신의 주요 목표 중 하나 , 13 , 14 , 15 , 16. 이러한 보존된 epitopes, 중화 및 비 중화 항 체17,18의 인식 반응 항 체 Fc-FcγR 상호 작용에 대 한 요구를 광범위 하 게 표시 되었습니다 최적의 vivo에서 보호 하 고 하이라이트 Fc 중재 면역 인플루엔자 바이러스19,20전반적인 면역 응답에의 기여.
보호의 관계가 중요 한 감염에 면역을 평가에 있습니다. 이러한 통계 과학자와 임상 백신의 효능, 데이터의 의미와 치료 과정을 추정 하실 수 있습니다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 유일한 설립된 상관 hemagglutination 저해 분석 결과 이다. 1시 40분의 titer 질병1,21 -위험 50% 감소와 관련 이며 바인딩 사이트는 HA의 구형 머리에 있는 수용 체를 대상으로 교착을 억제 하는 항 체의 존재를 반영 한다. 그러나, 그것은 또한 주목 해야한다 T 세포 응답 노인에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 더 나은 상관 있을 수 있습니다. 흥미롭게도, 최근 보고서 응집 저해 행위 면책 독감22의 더 나은 예언자를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 다행히도, 일반적인 체 외에서 분석 실험 같은 중화 또는 응집 저해 분석 하 줄기 또는 응집 특정 항 체를 측정할 수 있습니다. 그러나 대부분 이러한 기존의 시험관에서 분석의,만 항 체의 항 원 바인딩 영역의 기능을 고려 하 고 Fc 영역의 역할을 측정 하지 않습니다. 또한, 비 중화 항 체 Fc 수용 체 참여에서 vivo에서 를 통해 보호 하는의 기여 감지17,18되지 않습니다. Fc 중재 면역 항 체 의존 세포 중재 세포 독성 (ADCC) 등을 유발 하는 항 체에 의해 여유 보호를 측정 하기 위하여 강력한 생체 외에서 시험이 필요 합니다.
아래 설명 하는 방법을 평가 수 murine 단일 클론 항 체의 Fc 중재 기능 활성화는 표현 유전자 변형된 Jurkat 세포 라인 사용 유도 murine 입력 1 FcR, FcγRIV. 항 체는 FcγR의 교전 세포내 신호 트리거 활성화 된 T 세포 중재 luciferase 활동의 핵 요인 transduces. 분석 결과 여러 장점이 격리 및 기본 효과 기 세포의 문화 및 cytometry Fc 중재 effector 기능19,23,24의 활성화를 감지를 사용 하 여 요구 하는 전통적인 기법 ,,2526. 첫째, 여기에 설명 된 프로토콜을 쉽게 통합 하는 다른 바이러스 성 대상, FcγRs, 및 다른 종 (인간과 murine)에서 항 체 적용할 수 있습니다. 둘째, 수정된 Jurkat 세포를 사용 하 여 표현 하는 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요인 아래 luciferase 취재 원 유전자와 FcγR 발광 측정 플레이트 리더를 사용 하 여 쉽게 분석할 수 있는 대형 분석 결과 대 한 수 선. 여기, 기본 효과 기 세포의 전통적인 활성화 Jurkat 세포의 표면에 FcγR의 항 체 참여 시 NFAT luciferase의 유도로 대체 됩니다. 이 96 잘 접시 형식 분석 결과 7 희석-성가신 전통적인 기술을 사용 하 여 될 수 있는 샘플 수와 triplicates에서 최대 4 개의 서로 다른 샘플의 측정에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 실험의 설계 및 데이터의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다 고려해 야 할 추가 포인트가 있다. 바이러스 성 대상 항 체 인식에 세포 표면에 표현 해야 합니다. 이 줄이기 위해 대상 항 원 (예: 내부 바이러스 성 단백질)는 격판덮개의 표면에 직접 코팅 수 수 있습니다. 그러나, 이것은 아직 엄격 하 게 테스트 되지. 또한, 수정 된 Jurkat 세포 선 및 FcγR 활성화의 한 유형을 표현 1 차 셀 라인 표현 생리 적 맥락에서 모든 수용 체 어떤 금지 FcγRs을 표현 하지 않는다.
우리가 이전 polyclonal 컨텍스트에서 epitope 특이성 Fc 중재 effector 기능 조절에 중요 한 역할을 담당 하며 그 항 체-종속 셀 중재 응답의 최적 활성화의 두 가지 포인트를 설명 하기 위해이 분석 결과 사용 27,28문의. 여기, 우리가 참여 하 고 FcγRIV를 활성화 murine 활성화 줄기 특정 단일 클론 항 체의 능력을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 예외29,30비록 광범위 하 게 반응 항 체의 많은 수는 조류의 antigenically 보존된 스토킹 지역 대상 고 따라서 범용 인플루엔자의 개발에 중요 한 역 백신입니다.
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프로토콜
이 원고에서 preformed 실험 윤리 및 규정의 다음 아이 칸의 학부의 기관 코드를 완료 했다.
1. 인플루엔자 바이러스 조류 Transfection 또는 감염의 표현
Transfection:
- 플레이트 인간 미 발달 신장 (HEK 293T) 셀 셀/잘 백색 조직 문화에서에서 2 x 104 의 밀도에서 96 잘 접시를 처리 하 고 (와 함께 5% CO2) 37 °C 배양 기에서 4 h 동안 앉아 보자.
- 100 셀 transfect DNA 바이러스 조류 및 50 μ의 전체 볼륨에 잘 당 transfection 시 약 0.2 μ에 대 한 코딩의 ng.
참고: 모두 Opti-최소 필수 미디어 (MEM) 감소 된 혈 청 매체 x 1에 플라스 미드 그리고 transfectant 시 약 희석 하. - 플레이트 18 h 5% CO2 와 37 °C 배양 기에서 배양 후 transfection 미디어를 제거 합니다.
2입니다. 감염
- 플레이트 A549 또는 Madin 다 비 개 신장 세포 세포/잘 백색 조직 문화에서에서 2 x 104 의 밀도에서 96 잘 접시를 처리 하 고 5% CO2와 37 °C 배양 기에 18 h 이상에 대 한 성장.
- 1에서 희석 바이러스 MEM x 3, 1, 또는 5% CO2와 37 °C 배양 기에서 1 h 0.33의 감염의 다양성에서 세포를 감염 하 고. 총 볼륨 100 μ 동일 해야 합니다.
참고: 10 x 메모리 위에서 언급 한 바이러스 희석에 대 한 메모리 작업 재고 x 1을 물으로 희석. - 감염 후는 inoculum을 제거 하 고 추가 1의 100 μ trypsin의 부재에서 접시에 MEM x.
- 5% CO2와 37 °C 배양 기에서 18 ~ 24 h에 대 한 감염 된 세포를 성장 한다.
3. FcRg/NFAT 중재 활성화 단일 클론 항 체 또는 세라 Luciferase 활동의 평가
- 첫째, 25 µ L 분석 결과 미디어 (1 x RPMI 1640 4% (vol/vol) 보충 낮은 IgG 태아 소 세라)의 transfected 또는 감염 된 세포의 성장 미디어를 바꿉니다.
- 별도 96 잘 접시에 분석 결과 미디어를 사용 하 여 30 μ g/mL에서 시작 하는 관심사의 항 체가의 4 배 희석을 수행 합니다. Triplicates에 희석을 수행 하 고 예제 플레이트 레이아웃은 그림 1A에 나타나. 배경 컨트롤 (혼자 분석 결과 버퍼) 뿐만 아니라 항 체 (항 체 제어)을 제외 하는 컨트롤을 포함 해야 합니다.
참고 사항: 모두 '아무 항 체'에 대 한 컨트롤 배경, 25 µ L 대신에 항 체 분석 결과 버퍼의 추가. - Transfected 세포 또는 감염 된 세포의 접시에 단계 3.2 해당 우물을 연속적으로 희석된 한 항 체의 25 μ 전송.
- 15 분 동안 (와 함께 5% CO2) 37 °C 배양 기에서 접시를 품 어.
- Murine FcgRIV 또는 인간 FcgRIIIa (셀/잘 75000) 표현 적절 한 수정된 이펙터 Jurkat 세포의 25 μ를 추가 합니다. 각각에 대 한 총 볼륨 잘 75 µ L 고 항 체의 시작 최종 농도 10 µ g/mL (그림 1B)에 이다.
참고: 배경 컨트롤에 대 한 분석 결과 버퍼 이펙터 셀 대신의 25 µ L 추가 합니다. 항 체 의존 세포 중재 먹어서 검사, 인간 FcgRIIa 표현 수정된 Jurkat 세포를 사용할 수 있습니다. - 플레이트 6 h 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 해 동 하 고 사용 하기 전에 약 1 h는 37 °C 물에 따뜻한 luciferase 기판 버퍼.
참고: luciferase 기판 버퍼를 만들기 위해 제공 하는 분석 결과 버퍼에서 동결 건조 된 luciferase 분석 결과 기판 다시 구성. 재구성 된 기판 버퍼 최대 6 주 동안-30 °C ~-10 °C에 저장할 수 있습니다. - 배경 컨트롤을 제외한 모든 우물에 75 μ/우물 luciferase 기판 버퍼를 추가 합니다.
- 읽기는 루미 노에.
- 배 유도 다음 방정식으로 계산: 유도 배 = (유도 값-배경 값) / (mAb 값-배경 값 없음).
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결과
우리는 시연 스토킹 전용 mAb, 6F12, 하지만 하지 머리 전용 머리 전용 mAb, PY102, upregulating CD107a 및 인터페론 γ19에 의해 기본 자연 킬러 세포를 활성화할 수 있었습니다. 모델링 기본 인간 NK 세포를 활성화 하는 스토킹 특정 항 체의 능력, 우리 스토킹 관련 mAb, 6F12, 튼튼하게 의해 murine FcγRIV 표현 수정된 Jurkat 세포를 활성화할 수 있습니다 보여 ~ 14-fold. 다른 한편으로, 머리 전용 mAb, PY102 및 제어 IgG (그림 2)28하지 않습니다.
X31 (reassortant 인플루엔자 바이러스는 조류와 응집의 A/Hong 홍콩/1/68 (H3N2)와 MDCK 세포 감염 우리 조사 감염 (MOI)의 다양성 murine FcγRIV 표현 Jurkat 세포의 유도 영...
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토론
여기에 설명 된 메서드를 사용 하면 murine FcγRIV 참여 하 특정 단일 클론 항 체의 능력을 측정 하 수 있습니다. 대상 항 인플루엔자 바이러스 조류 바이러스 또는 플라스 미드 DNA의 transfection 감염 후 세포의 표면에 표현 된다. 분석 결과 (인간 또는 murine) 다른 FcγRs와 함께에서 다른 표면 표현 바이러스 성 단백질을 사용 하 여 의무가 더 이다. 또한, 우리는 세라 샘플 사용 Fc effector 기능 (데이터 표시 되지 않음), 유도 컨텍스트를 polyclonal 항 체의 능력을 평가 하기 위해 감염에 의해 유도 된 적합 한 면역 반응 공부 때 보다 관련성이 높은 정보를 제공할 수 있습니다 또는 예방 접종입니다. 우리는 또한 직접 수용 성 단백질으로 플레이트를 코팅 하 여 내부 바이러스 성 단백질을 인식 하는 항 체의 유도 측정 하는 분석 결과 수정할 수 있습니다 추측 하고있다. 그러나,이 방법론은 엄격 하 게 테스트 되지.
유도의 항 체 ...
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공개 사항
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
감사의 글
이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A549 셀 | ATCC | CCL-185 | 선암성 인간 폐포 기저 상피 세포 |
| HEK 293T 세포 | ATCC | CRL-3216 | 인간 배아 신장 세포 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection 시약 |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| 백색 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트 | Corning, Inc. | 3917 | 분석 플레이트 |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 쥐를 발현하는 Jurkat 세포 FcgRIV | Promega | M1201 | 키트는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청 |
| Jurkat 세포를 제공합니다. 인간 FcgRIIIa | Promega | G7010 | 키트는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청 |
| 을 제공합니다.인간 FcgRIIa | Promega | G9901 | 에는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈 |
| 광도계 | BioTek | Synergy H1 다중 모드 리더 | 발광 플레이트 리더 |
| Bio-Glo Luciferase 분석 시스템 | Promega | G7940 | luciferase 분석 버퍼와 luciferase 분석 기질 |
| Madin Darby 송곳니 세포 | .ATCC | CCL-34 | 개 신장 세포 |
참고문헌
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