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방법 논문

Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

2017년 12월 26일

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

이 논문에서

요약

항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.

초록

대 식 세포는 phagocytic 타고 난 면역 세포는 병원 체에 대 한 면역 응답을 시작 하 고 치유와 조직 회복을. 대 식 세포는 선 동적인 응답을 해제에 동등 하 게 중요 하다. 우리 세포 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)와 자극된의 다량 항 염증 성 사이토카인, 인터 루 킨 10 (IL-10), 그리고 세균 lipopolysaccharides (응답에서 프로 염증 성 cytokines의 저급 생산할 수 있는 것으로 나타났습니다. LPS)입니다. IVIg는 1000 명 이상의 혈액 기증자의 플라즈마에서 풀링된 다 원자가 항 체, 면역 글로불린 Gs (IgGs), 주로. 면역 결핍증 환자에서 항 체를 보완 하기 위해 또는 면역 또는 염증 성 조건 가진 환자에 있는 면역 반응 억제에 사용 됩니다. Infliximab, 치료 항 종양 괴 사 요인 알파 (TNFα) 항 체 또한 염증 성 자극에 대 한 응답에서 IL-10를 생산 하는 세포를 활성화 하기 위해 표시 되었습니다. IVIg 및 다른 항 체 기반 생물 의약품은 대 식 세포 활성화에 미치는 영향을 확인 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 이 문서에는 파생, 자극, 및 murine 골 수 세포를 체 외에서 항 체에 의해 활성화와 murine 복 막 대 식 세포 항 체 비보와 활성화의 평가 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 항 염증 제 대 식 세포 활동 통로 신호 하는 특정 셀의 기여를 결정 하 게 더 럽 히기 서쪽의 사용을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 특정 protein(s)의 효과 결정 하 유전자 변형된 생쥐와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 biologics 세포 선 동적인 응답 비보를 감소 시키는 IL 10 생산 하는 항 염증 제 활성화 상태를 변경 하 여 행동 수 있습니다 여부를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 질병 모델 생쥐, 동안 생물 의약품의 효능에 대 식 세포 활성화의 역할에 대 한 정보를 제공 하 고 사람에서 행동의 잠재적인 새로운 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 반대로,이 수 주의 특정 항 체 기반 생물 의약품의 사용에 대 한 전염 성 질병을 치료 하 대 식 세포는 감염에 대 한 호스트 방어에 중요 한 역할을 재생 하는 경우에 특히.

서론

대 식 세포는 면역 반응에 여러 역할 감염이 나 부상에 타고 난 면역 세포. 대 식 세포는 감염이 나 조직 손상에 대 한 면역 응답을 시작, 선 동적인 응답을 중지 및 치유 응답1을 홍보 하는 일을 담당 합니다. 3 최고의 공부 대 식 세포 활성화의 예: 1) 대 식 세포 치료 인터페론 감마 (IFNγ)와 세균 lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS)는 염증 반응;을 지정 2) 대 식 세포와 인터 루 킨 4 (IL-4), M(IL-4), 자극된 치료 응답;과 관련 된 3) 면역성이 있는 복합물 (IC)와 자극된 세포와 LPS, M (IC + LPS)는 염증 반응2,3해제 하는 기능이 있다. M (IC + LPS) M(IL-4) 상처 치유, 세포에서 고 효소 arginase (Arg-1) 또는 FIZZ14를 표현 하지 않습니다. 이러한 염증 세포에 대 한 최고의 마커는 그들의 cytokine 생산5입니다. 세포 건강을 유지 하는 데 여러 역할 하지만 또한 염증 성 질환 및 암3에 기여. 이 때문에, 대 식 세포는 다양 한 질병의 치료에 대 한 주요 치료 대상. 그것은 질병에 대 한 대 식 세포 기반 치료를 개발 하기 위해 그들의 활성화 상태에 대 한 항 체의 효과 조사 해야 합니다.

이 문서의 초점은 파생 murine 골 수 세포 (BMDMs) 및 선 동적인 응답 생체 외 및 생체 내에서항 체 약물의 효과 테스트 하는 복 막 대 식 세포의 사용에 있습니다. 최근, 대 식 세포 활성화6,,78에 항 체의 효과 보여주는 여러 연구 되었습니다. 대 식 세포는 항 체 항 원, 및 LPS, 일반적으로 염증 성 자극 complexed 면역 단지와 활성화 공동 항 염증 성 사이토카인, IL-10와 프로-염증 성 cytokine의 매우 낮은 레벨의 매우 높은 수준의 생산 인터 루 킨 12 (IL-12)9. 또한, infliximab, TNFα에 대하여 단일 클론 항 체에 작동 하는, 부분적으로, 그것의 조각 crystallizable (Fc) 지역7염증 세포를 유도 하 여 발견 되었습니다. 우리 보고 IVIg + LPS M (IC + LPS), 공동 자극된 세포 많은 양의 IL-10과 23 p40 (또는 소 단위 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨 12의 낮은 금액을 생산 하는 점에서 유사한 항 염증 제 대 식 세포 활성화 유도 IL-12/23p40), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 그리고 TNF8. IVIg polyclonal 항 체의 구성 하는 약 주로 IgG, 1000 명 이상의 기증자10의 혈액에서 풀링된 되는 이다. Idiopathic thrombocytopenic 혈관 등 만성 demyelinating 증, 면역 질환의 광범위 한 치료 하는 데 사용은 하지만 행동의 그것의 기계 장치는 완전히 이해11. 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물의 효과 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 평가 될 수 있다.

BMDMs 및 복 막 대 식 세포 대 식 세포 활성화에 특정 생물 의약품의 효과 테스트할 수 있습니다. 이 대 식 세포 소스를 사용 하 여 1 차 셀의 평가 허용 합니다. 예비 테스트 교양된 1 차 셀에 항 체의 적은 시간과 다른 시간이 소모 및 비싼 질병 모델 보다 통화 투자 필요 합니다. 주입 약을 건강 한 마우스에서 vivo에서, 그리고 셀을 절연 하 고 비보 전분석, 한 연구는 생물 의약품으로 치료에 영향을 미치는 질병 모델에서 대 식 세포 활성화 여부를 평가 하기 위해 보증을 확인할 수 있습니다.

대 식 세포 활성화 생체 외 및 생체 내에서 생물 학적 치료의 효과 직접 테스트 하는 몇 가지 연구, 우리의 기술을 대체 기술을 통해 이점을 제공 합니다. 현재 기술 포함 혼합된 셀 인구에서 생체 외에서주변 혈액 단 세포, 인간의 세포에는 반응 혼합된 림프 구 (미르) 또는 IVIg infliximab의 효과 같은 생물 학적 약물 효과 테스트 어디 효과 특정 세포 유형7,12에 표시 될 수 없습니다. BMDMs를 사용 하 여 복 막 대 식 세포는 유리 RAW264.7 세포, 프로-염증 성 사이토카인을 생산 하지 않습니다, 같은 셀 라인을 사용 하 여 IL-12, LPS8,13에 대 한 응답. 대 식 세포 응답 ex vivo에 는 항 체 기반 약물의 효과 테스트 cytokine 응답 대 식 세포, 직접 할당 될 수 있기 때문에 이점이 있다 보다는 혈 청 사이토카인 수준14 측정 하 여 대 식 세포 응답을 유추 . BMDMs 및 복 막 대 식 세포를 파생 하 고 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 있는 단백질의 특정 역할을 결정 하는 유전자 변형된 쥐에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 우리 Il10 결핍 사용(-/-) IVIg 유도 프로-염증 성 cytokine 생산의 감소는 IL-108에 부분적으로 의존을 설명 하는 BMDMs. 활동의 기계 장치는 약의 서 부 럽, 특정 단백질 및 신호 이벤트의 역할을 확인할 수 있습니다을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) BMDMs 또는 복 막 대 식 세포 항 체 활성화에 기인 하는 유전자 발현의 패턴을 보여주는 것에 수행할 수 있습니다. 질병 모델 생쥐에서 모델에서 항 체 기반 생물 학적 치료의 잠재적인 효 험에 염증 성 장 질환, 류 마티스 관절염과 암15,16, 같은 질병에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 17., 여기에 설명 된 기술 정보를 제공 합니다 이러한 생물 의약품의 행동의 메커니즘에 그들은 항 염증 제 대 식 세포 활동을 유도 하는 여부를 확인 하 여.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 브리티시 컬럼비아의 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 골 대 식 세포 유도 및 항 체와 활성화

  1. CO2 질을 사용 하 여 안락사를 수행 합니다.
    1. 유도 챔버에 장소 마우스입니다. 때까지 움직이지 하 고 호흡은 깊고 느린 60-90 s 5 %isoflurane 마 취와 함께 마우스를 안락사 하 고
    2. Isoflurane 마 취를 끄고 마우스 호흡 중지 될 때까지 6-8 L/분 CO2 의 관리. 두고 마우스 CO2 에 적어도 또 다른 5 분 확인을 위해 거기는 더 이상 심장 박동 또는 호흡. 죽음을 보장 하기 위해 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
      참고: 8-12 주 오래 된 마우스 대 식 세포의 가장 높은 수익률을 제공합니다.
  2. 70% 에탄올, 마우스 다리를 스프레이 하 고 무기와 폼 보드 위에 부정사 위치에 밖으로 기지개 하는 다리와 그들을 핀. 가 위, 집게는 피부를 피부와 모피 뒷 다리의 각각의 표면에서 제거 하 얕은 절단 (0.2 cm)를 확인 합니다.
    참고:이 절차 및 모든 조직 문화의 조작 살 균 후드에서 수행 합니다.
  3. Tibias와 화관을 볼 수 있도록 근육을 잘라. Tibias와 화관, 뼈와 근육 고관절 바로 아래와 발목 이상 절단 하 여 제거 합니다. 가능한 많은 근육 정돈 한다.
  4. 70% 에탄올으로 뼈를 살포 하 고 증발, 다음 뼈 플러시 매체 (Iscove의 Dulbecco의 매체 (IMDM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 수정)의 6 잘 플레이트에 넣어 그것을 위해 1 분을 기다립니다.
  5. 0.1 cm 발목, 대 퇴 골의 상단 뼈의 뼈 구멍 노출 되도록 절단 하 여 뼈의 끝을 잘라. 골 수는 보이는 26 게이지 바늘 뼈 구멍에 놓일 수 있습니다 확인 합니다.
  6. 뼈와 근육 tibias와 무릎 관절에서 화관을 잘라. 캐비티에 10 mL 주사기에 부착 된 26 게이지 바늘을 삽입 합니다. 플러시 중간 뼈의 5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 골을 플러시. 각 50 mL 튜브에 두 tibias와 하나의 마우스에서 2 개의 화관을 플러시.
  7. 여러 번 또는 소용돌이 위아래 플라스틱 덩어리를 부드럽게 분산을 느린 속도로 골 수 있습니다. 골 수의 골 수의 작은 (0.5 m m 미만 함) 부스러기로 깨진 해야 합니다. 플러시 중간 뼈로 50 ml 원뿔 튜브를 채우십시오. 피 펫 내용은 75 cm2 조직 문화에 원뿔 튜브의 플라스 크, 취급 하 고 37 ° C, 5% CO2 1 h에서 품 어.
    참고: 성숙 세포와 중간 엽 세포 될 것입니다 플라스 크를 부착 하 고 원하는 조 혈 창시자에에서 유지 하는 동안 삭제 됩니다.
  8. 50 mL 원뿔 관으로 조 혈 창시자와 매체를 플라스틱. 원심 5 분 삭제에 대 한 상 온에서 300 x g에 튜브는 상쾌한 고 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (MCSF) 문화 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (IMDM, 10 %FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL 페니실린/스, 및 150 μ M monothioglycerol (MTG))입니다.
  9. Hemocytometer18를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 106 셀/mL, 107 셀/플라스 크 매체, 30 mL에 x 1.5 x 0.5의 농도에 세포 resuspend를 위아래로 부드럽게 플라스틱을 매체를 추가 합니다. 새로운 75 cm2 취급 하는 조직 배양 플라스 크에 현 탁 액 30 mL를 플라스틱.
  10. 하루 4 일 7 단계 1.9에서에서 초기 문화 후에 세포가 부착 하 고 약간 분기는 반전된 단계 대조 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 확인 합니다. 비 부착 한 세포를 포함 하는 매체를 버리십시오. 씻어 IMDM 셀 한 번 하 고 MCSF 문화 매체의 30 mL를 추가 합니다.
  11. 하루 10 세포가 성숙 때 (> F4/80 및 Mac-1에 대 한 긍정적인 95%), 셀은 다시 확인 점착 및 약간.
  12. 에 셀 stimulations 접시, 플라스 크에서 문화 매체를 제거 하 고 효소, EDTA 기반 셀 분리 버퍼 (자료 테이블)의 8 mL을 추가. 37 ° C, 5% CO2에서 5 분에 대 한 셀을 품 어.
  13. 작은 양의 압력, 멸 균 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 부드럽게, 다쳤어요. 세포를 플라스 크 표면에서 분리 된 현미경에서 확인 합니다. 50 mL 원뿔 튜브로 피 펫 해리 셀. 3 번 IMDM의 5 mL로 플라스 크를 헹 구 고 수확 했다 셀 린스 솔루션 수영장. 5 분 동안 실 온에서 300 x g에서 셀 원심
  14. 3 ml 50 mL 원뿔 튜브 당 MCSF 문화 매체의 셀 펠 릿을 resuspend. Hemocytometer18를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 1 x 106 셀/mL 및 플레이트 100 μ 셀 서 스 펜 션 (1 x 105 셀/잘)의 농도에서 세포 당 96 잘 조직 문화 취급, 평면 바닥판의 resuspend.
    참고: 한 마우스에서 뼈 100 웰 스에 대 한 충분 한 세포를 생성 합니다. 원하는 경우, 셀의 1 mL 6 잘 플레이트 (조직 문화 취급, 평면 하단)에 도금 수 있습니다. 셀 (1 x 106 셀)의 많은 수는 서쪽 오 점 분석에 유용할 수 있습니다.
  15. 일단 부착, 중복 자극 또는 3 중 각각 10 ng/mL IMDM, IVIg, 또는 IVIg + LPS의 30 mg/mL에서에서 LPS의 우물. LPS 또는 IVIg의 복용량 응답을 최적화 하기 위해 적정 될 수 있습니다. Unstimulated 컨트롤으로 중복 되거나 triplicate 우물을 둡니다. 24 시간 (37 ° C, 5% CO2)에 대 한 그들을 품 어.
    참고: 다시 도금된 세포 조직 문화 웰 스 1 시간 이내에 준수 해야 합니다.
  16. 개별 1.7 mL microcentrifuge 튜브 각 우물에서 셀 supernatants를 수집 하 고 5 분 동안 10000 x g에서 회전 하 여 어떤 미 립 자 물질을 제거.
  17. 표면에 뜨는 셀을 제거 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않도록. 명확히 셀 메 마른 microcentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 장소.
    참고: 셀 supernatants cytokines, IL-10, 및 cytokine 소 단위, 일리노이-12/23 p 40, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 즉시에 의해 분석 하거나 장기-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. 상용 장비 (자료 테이블)에서 ELISA 프로토콜을 따릅니다. 다른 프로 염증 성 cytokines 수 수 분석, 일리노이-6와 TNF, 그들은 또한 공동 치료 IVIg에 의해 감소 된다 + LPS 자극에 비해 서 혼자 LPS 자극. 자극, 후 부착 세포 부 럽 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR) 19,20같은 기법에 대 한 준비 될 수 있습니다.

2. 마우스에 도전 비보에 IVIg와 복 막 대 식 세포를 수확

  1. 각 마우스 무게.
IVIg (100mg/mL 재고 농도) 각 마우스에 대 한 몸 무게 2.5 g/kg의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다.
참고: 예를 들어 20 g 마우스 IVIg의 500 µ L이 필요 합니다.
  • 살 균 1 mL 주사기에 IVIg의 필요한 양을 살 균 26 장착 그리기 게이지 바늘. 컨트롤 마우스 IVIg에는 영향을 받지 것입니다에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS), pH 7.4 IVIg 대신의 등가 선 량 볼륨을 관리 합니다.
  • 엄지와 검지 손가락으로 목 뒤쪽의 피부를 잡아와 그것의 꼬리와 나머지 손가락으로 뒷 다리를 들고 한 손으로 마우스 아저씨. 그것의 몸을 바닥 쪽으로 기울기.
  • 바늘 낮은 오른쪽 사분면에서 마우스의 복 부를 기준으로 30-40 ° 각도에서 베벨 놓고 바늘의 1.5 c m를 삽입 합니다. Intraperitoneally IVIg 또는 PBS를 주입. 1 시간을 기다립니다.
  • 6-8 L/분 CO2 질 식에 의해 다음 5 %isoflurane 마 취와 함께 마우스를 안락사 (단계 1.1.1-1.1.2를 참조), 또는 기관의 윤리 지침에 따라.
  • 핀 마우스 사지와 폼 보드를 밖으로 퍼졌다. 부품 70% 에탄올 스프레이.
    참고: 살 균 후드에는 절차를 수행 합니다.
  • 복 막 구멍을 절단 하지 않도록 하는 마우스의 중간 선 따라가 위로 (0.2 cm) 피부에 얕은 상처를 확인 합니다. 그대로 복 벽의 안 대기는 볼 수 있도록 집게를 사용 하 여 마우스의 배꼽에서 복 부 피부를 당겨.
  • 살 균 PBS (pH 7.4)의 5 mL로 5 mL 주사기를 채우십시오. 한 25 삽입 또는 27 게이지 바늘의 경사와 마우스의 중심 방향으로 오른쪽 또는 왼쪽에서 구멍의 상단에 바늘을.
    참고: 장소 바늘 신중 하 게 마우스에 있도록 기관, 그러나 오히려, 복 막 공간으로 PBS 주사 하지 않습니다.
  • 복 막 구멍으로 액체를 밀어. 구멍에 바늘을 꺼내와 마사지 10 복 셀을 꺼내 려 s. 구멍의 상단에 바늘을 삽입 하 고 장기를 피하십시오. 수집 하 고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브로 게 유체를 놓습니다.
    참고: 모든 5 Ml 주입 액체의, 약 3.75 mL 복구할 것 이다.
  • 주입 및 복구 (2.8-2.9 단계)를 반복 하 여 총에 게 액체의 15 mL를 복구 (20 mL의 총 주입 량), 번 더 3. 별도 15 mL 원뿔 튜브로 각 마우스에서 게를 수집 합니다.
    참고: 마지막 주사 후 수 있습니다 액체 축적은 마우스의 멀리 왼쪽 및 오른쪽 측면에서 액체를 추출 하기 쉬운. 장기는 바늘이 위치에 더 적은 방해를 일으킬 것입니다.
  • 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 Resuspend 도금 매체의 500 μ 셀 (IMDM, 10 %FBS, 및 100 U/mL 페니실린/스) 마우스 플러시 당. 실행 가능한 세포 hemocytometer18를 사용 하 여 계산 합니다.
    참고: 대 식 세포는 다른 복 셀 보다 약간 더 큰 것입니다. 전형적인 수확량은 5 x 105 -1 x 106 세포/야생 타입 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 마우스입니다.
    옵션: 큰 붉은 혈액 세포의 셀 펠 릿에 있으면 제조업체의 지침에 따라 1 x 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여 그들을 제거 하는 세포 단계를 수행 합니다.
  • 셀 1 x 106 세포/mL에서 중간 도금에 resuspend 그리고 96 잘 플랫 바닥 처리 하는 조직 문화 접시에 잘 당 100 μ 접시.
    참고: 그것은 필요할 지도 모른다 풀을 사용 하는 경우 실험에 대 한 하나 이상의 마우스에서 셀 triplicate 우물 이나 넣는 자극. 예를 들어 한 마우스 했다 5 x 105 대 식 세포, 도금 매체의 500 μ 필요한 것입니다. 5 웰 스, 또는 중복 한 LPS 복용량 1 실험에 대 한 충분 한 셀 것입니다.
  • 37 ° c, 5% CO2 세포 될 수 있도록 1 h에 대 한 셀을 품 어 부착. 부착 세포가 복 막 대 식 세포. 셀 supernatants 및 비 부착 한 세포를 제거 합니다. 200 μ IMDM (37 ° C에 미리 예 열)로 두 번 웰 스 린스, 10 기다릴 s 접시를 천천히 기울기. 도금 매체를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 자극 전에 30 분 동안에 세포를 품 어.
  • IMDM에서 LPS의 10 ng/mL로 세포를 자극 하거나 unstimulated 제어로 둡니다. 24 h incubate, 수집 하 고 명확히 IL-10 cytokine ELISA 분석에 대 한 셀 supernatants (1.16-1.17 단계 참조). 상용 장비 (자료 테이블)에서 ELISA 프로토콜을 따릅니다.
    참고: 자극, 후 부착 세포는 서쪽 오 점 또는 PCR 등 기술에 대 한 준비 될 수 있습니다.

    • 3. 마우스에 도전 비보에 IVIg + LPS 및 복 막 대 식 세포를 수확

    1. 각 마우스 무게. IVIg (100mg/mL 재고 농도) 몸 무게 2.5 g/kg의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다. LPS (IMDM에 재고 100 μ g/mL 농도) 0.2 μ g/g 몸 무게의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 금액을 계산 합니다.
      참고: 예를 들어 20 g 마우스 IVIg 재고 솔루션의 500 µ L와 LPS의 100 μ g/mL 해결책의 40 μ가 필요 합니다.
    2. IVIg의 필요한 금액을 인출 하 고 살 균 26으로 살 균 1 mL 주사기로 LPS 게이지 바늘. 컨트롤 마우스 IVIg에는 영향을 받지 것입니다에 대 한 살 균 PBS ph 7.4 IVIg의 해당 볼륨을 교체 합니다.
    3. 엄지와 검지 손가락으로 목 뒤쪽의 피부를 잡아와 그것의 꼬리와 나머지 손가락으로 뒷 다리를 들고 한 손으로 마우스 아저씨. 그것의 몸을 바닥 쪽으로 기울기.
    4. 장소 바늘 낮은 오른쪽 사분면에서 마우스의 복 부를 기준으로 30-40 ° 각도, 경사 및 1.5 cm. 넣기는 IVIg + LPS, 또는 PBS + LPS를 삽입, 2.4 단계에서 intraperitoneally.
    5. 1 시간 후 2.5-2.10 단계를 수행 하 여 복 막 대 식 세포를 수확.
    6. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 복구 된 게 액체의 1 mL를 제거 및 IL-10과 IL-12/23 p 40 여 ELISA 분석에 대 한 제조업체의 지침에 따라 사용 또는 미래의 분석-80 ℃에서 동결.
      참고: 정확한 비교 게 유체 cytokine 분석에 대 한 치료를 보장 하기 위해 수행 복 막 구멍의 5 mL flushs 4 번 15 mL의 최종 볼륨에 대 한. 모든 액체는 각 플러시에서 복구할 수 있습니다.
    7. 2.11 단계에서 resuspend 및 실행 가능한 세포.
      참고: 대 식 세포는 다른 복 셀 보다 약간 더 큰 것입니다.
    전형적인 수확량은 5 x 105 -1 x 106 세포/야생 타입 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 마우스입니다.
    옵션: 큰 붉은 혈액 세포의 셀 펠 릿에 있으면 세포 단계 단계 2.11에서 그들을 제거 하려면 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
  • 2.12 단계에서 다시 셀 중간 도금을 일시 중단 합니다.
    참고: 그것은 실험에 대 한 하나 이상의 마우스에서 수영장 셀에 필요할 수 있습니다. 예를 들어 한 마우스 했다 5 x 105 대 식 세포, 도금 매체의 500 μ 필요한 것입니다.
  • 2.13에서 허용 되는 세포를 37 ° C 5% CO2 에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어 부착.
  • 수집 하 고 모든 복 막 세포에서 1.14-1.15, 단계 당 조절된 매체를 명확히.
    참고: 샘플 수 있습니다 즉시 사용 또는 동결 되며 ELISA cytokine 분석-80 ° C에 저장.
  • 2.11, 단계를 수행 하지만 24 h unstimulated에 대 한 셀을 품 어. 수집 하 고 단계 1.16-1.17, cytokine ELISA 분석에 의하여 셀 supernatants 명확히.
    참고: 셀 단계 1.16-1.17, 2.14 서쪽 오 점 또는 PCR, 같은 기술에 대 한 준비 될 수 있습니다.

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    결과

    Murine 뼈 골 수 유래 세포 aspirates 골 수에서에서 조 혈 세포 선구자에서 경작 될 수 있습니다. 일반적으로 화관과 tibias 한 C57BL/6 마우스의 풀링 골 aspirates 항복 107 파생 된 골 수 세포, 그들에 게 실험에 대 한 대 식 세포의 편리한 소스를 만들기. BMDMs 항 체 기반 약물 응답은 염증 성 자극에 체 외에도전 하는 경우 테스트에 사용할 수 있습니다. 그림 1 에서는 그 IVIg 브랜드 Gammunex (GX) + LPS 항 염증 성 사이토카인의 생산을 증가 하는 IL-10, 7-fold LPS 자극 혼자 (그림 1A)에 비해과 생산의 IL-12/23 p 40 (그림 1 감소 B

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    토론

    대 식 세포 활성화 상태 두 조직의 항상성 및 질병22에 중요 한 역할을 한다. 대 식 세포 활성화 상태, 그들의 microenvironment3에서 신호에 따라 중복 뿐만 아니라 고유 할 수 있습니다. 그들은 염증 반응의 모든 단계에 있는 명백한 역할: 병원 체에 대 한 방어, 상처 치유 및 조직 회복, 그리고 또한 염증 반응2 해제에 대 한 중요 한 다른 항 염증 제 활성화 상태 . 항 염증 제 대 식 세포 활성화 항 염증 성 사이토카인, IL-10, IL-1223같은 프로 염증 성 cytokines의 낮은 금액의 높은 금액을 생산 하는 세포에 대 한 두 개의 외부 자극을 필요 합니다. 하나의 신호 항 체 Fc 감마 수용 체를 통해 행동에서 유래 하 고 두 번째 신호는 LPS 또는 IFNγ와 같은 프로-염증 성 자극24

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    공개 사항

    저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

    감사의 글

    L.K.는 브리티시 컬럼비아의 대학 4 년 친교 (4YF) 대학원 재학 상 받는 사람입니다. L.M.S.은 위장의 캐나다 협회의 받는 사람 / 크 론 및 Colitis 캐나다 CIHR 새로운 탐정 급여 수상 / 건강 연구를 위한 마이클 스미스 재단의 생물 의학 학자입니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (# CIHR2016-LS 부여)와 공동으로 캐나다 혈액 서비스에서 프로젝트 교부 금에 의해 지원 되었다.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    이스코브 s 수정된 Dulbecco' s 배지 (IMDM)생명 기술12440053
    소 태아 혈청 (FBS)생명 기술12483-020
    재조합 쥐 대식 세포 식민지 자극 인자 (MCSF)줄기 세포 기술78059
    페니실린-스트렙토 마이신생명 기술15140148
    모노 티오 글리세롤 (MTG)시그마88640
    1X 적혈구 용해 완충액eBioscience
    세포 해리 완충액생명 기술13150016Enzyme-Free, Hanks's based, EDTA
    Lipopolysaccharide (LPS)Sigma aldrichL 4516From E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)GrifolsBC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    에서 수령IVIg (Gammagard liquid)Baxter Healthcare CorporationBC 아동 병원에서 입고, 수혈 의학
    IVIg (Octagam)OctapharmaBC 아동 병원에서 수령, 수혈 의학
    인산염 완충 식염수(PBS) (멸균), pH 7.4마우스
    555252
    마우스 IL-12/23p40 ELISABD biosciences555165
    anti-Erk1/2 항체세포 신호 기술9101
    anti-pp38 항체세포 신호 기술9211
    anti-GAPDH 항체Fitzgerald industries10R-G109A
    26g 바늘BD 생명과학305110
    1mL 주사기BD biosciences309659
    10mL 주사기BD biosciences309604
    15mL 원뿔형 튜브BD biosciences352096
    50mL 원뿔형 튜브BD biosciences352070
    마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL)DiamedSPE155-N
    75cm2 조직 배양 처리 플라스크BD biosciences353136
    세포 스크래퍼BD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386세밀한 팁, 해부 
    가위VWR82027-582Delicate, 4 1/2"
    Brightfield microscopeMoticAE31Inverted phase contrast
    Scale 메틀러 PE 3000
    IL-10 ELISA BD biosciences 10010023 생명 기술

    참고문헌

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

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