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방법 논문

전체 게놈 시퀀싱 Candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의

12.1K 조회수

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DOI:

10.3791/56714

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2017년 12월 28일

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1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 Candida glabrata에 항진균 약물 저항을 부여 하는 유전자에 돌연변이의 분석을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 구현. C. glabrata 격리 저항 echinocandins, azoles 및 5-flucytosine 하는 방법론을 설명 하기 위해 시퀀싱 했다. 유전자의 특정 돌연변이 패턴의 존재 여부와 상관 하는 격리의 민감성 프로필.

초록

Candida glabrata 신속 하 게 될 약물 저항, 특히 azoles 및 echinocandins 돌연변이 수집할 수 있습니다. 유전자 변이의 식별, 필수적 이다 저항 체 외에서 수 자주와 상관 될 임상 실패 감지. 우리는 항진균 약물 저항 C. glabrata의 게놈 넓은 분석에 대 한 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)를 사용 하 여의 타당성을 검사 합니다. 목표는 torecognize enablers와 장벽을 WGS 구현에서 되었고 그 효과 측정. 이 문서는 주요 품질 관리 검사점 및 항진균 요원 민감성 감소와 관련 되었던 유전자 표시를 조사 WGS 방법론의 필수 구성 요소를 설명 합니다. 그것은 또한 데이터 분석의 정확도 테스트 시간 주위 차례 견적.

12 임상, phenotypic 민감성과 C. glabrata 의 한 ATCC 스트레인 항진균 민감도 테스트를 통해 결정 되었다. 이 포함된 3 쌍, 3 환자, 마약 최소 억제 농도 상승 개발에서 격리. 두 쌍에서 두 번째의 각 쌍 개발 저항 echinocandins 격리 합니다. 3 쌍의 두 번째 분리 5 flucytosine에 저항을 개발 했다. 나머지 구성 취약 azole 내성 격리. Echinocandin, azole 5 flucytosine 저항에 연결 하는 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)는 WGS 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 통해 저항 격리에서 확인 되었다.   FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 및 FCY2 같은 유전자 발견 했다 항진균 저항 비 동의어 Snp. 전반적으로, 약 75-fold 읽기 깊이 범위와 참조 게놈에 매핑된 C. glabrata 격리의 WGS 읽기의 98%의 평균. 처리 시간 및 비용 생어 비교 했다 순서.

결론적으로, C. glabrata 의 WGS 다중 PCR/DNA 연속 반응에 대 한 필요 없이 다른 항진균 약물 클래스에 저항에 관련 된 임상적으로 중요 한 유전자 돌연변이 공개에서 가능 했다. 이 항진균 성 부여 대체의 동시 검출에 대 한 임상 실험에서 샷건 시퀀싱 기능 설정으로 긍정적인 단계를 나타냅니다.

서론

Candida glabrata 는 azoles 뿐만 아니라 최근에, echinocandins,12,3저항을 전시 하는 종족으로 중요도 점점 발생된 병원 체 이다. 2 중 C. albicans, 달리 C. glabrata 의 단일 게놈 돌연변이 획득 하 고 보다 쉽게 다중 약물 저항을 개발 하도록 허용할 수 있습니다. 공동 저항에 두 약물 클래스 되었습니다 보고4. 따라서, 항진균 민감성의 초기 평가 및 C. glabrata 에서 약물 내성의 검출은 항균 성 저항1 의 드라이버 제한 항진균 집사의 직의 맥락에서 뿐만 아니라 정확 하 고, 타겟 치료에 대 한 중요 한 , 5 , 6. 빠르게 감지 저항 격리 바이오 마커의 저항에 연결 하는 확실 한 돌연변이의 존재는 또한 처방을 개선 하기 위해 도움이 결정 하는 효율적인 워크플로 및 임상 결과 설정.

항진균 민감성은 일반적으로 최소 억제 농도 (MIC) 마약 없는 성장의 저것과 비교 된 미생물의 성장에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과 낮은 약물 농도로 정의 되는 측정 하 여 평가 제어 합니다. 임상 실험실 표준 협회 (CLSI)와 유럽 위원회 항균 민감성 테스트 (EUCAST)를에 마이크 결정 수 있도록 메서드를 테스트 하는 민감성 표준화 더 정확 하 고 일관 된7, 8. 그러나, 항진균 마이크의 유틸리티 남아 있다 echinocandins, 특히 제한 특히 inter-laboratory 비교에 관해서는 다양 한 방법론 및 조건 있는 사용된9. Echinocandin 처리와 WT를 구별 하는 무 능력에 대 한 응답으로 마이크의 불확 실한 상관 관계 있다 (또는 취약) FKS 돌연변이 (echinocandin 내성 변종)10,11은닉에서 격리. 확실 한 단일 유전자 PCRs 생어의 가용성에도 불구 하 고 항진균 저항 마커의 시퀀싱, 결과의 실현은 종종 지연 인해 여러 저항 마커5,12의 동시 탐지의 부족. 따라서, 전체 게놈 시퀀싱 기반 분석을 사용 하도록 설정한 게놈에서 서로 다른 위치에 저항을 부여 돌연변이의 동시 검출 현재 접근에 비해 상당한 이점을 제공 합니다.

전체 게놈 시퀀싱 (WGS)는 발생 동안 질병 전송 게놈 넓은 위험 평가 약물 저항 박테리아와 바이러스13에서 테스트에 대 한 접근 추적을 성공적으로 구현 되었습니다. 핵 산 시퀀싱 기술의 최근 발전 만들었습니다 전체 게놈 시퀀싱을 (WGS) 병원 균의 임상 실용적인 차례-주위-시간에 기술적으로 그리고 경제적으로 가능. DNA 시퀀싱 병원 체 식별 및 미생물학 실험실14,,1516에 특성의 다른 방법에 비해 중요 한 장점을 제공 합니다. 첫째, 그것은 높은 처리량, 속도와 품질 범용 솔루션을 제공합니다. 시퀀싱은 미생물에 적용 될 수 있습니다 하 고 로컬 또는 지역 연구소에서 규모의 경제를 있습니다. 둘째, 국내 및 국제 수준에서 비교 의무가 ' 미래-증거 ' 형식으로 데이터를에서 생성합니다. 마지막으로, 의학에 WGS의 잠재적인 유틸리티가 추가 임상 및 역학 메타 데이터17 를 포함 하는 해당 데이터 베이스에 연결할 수 있는 참조 게놈을 포함 하는 공용 데이터 기지의 급속 한 성장에 의해 확장 되었습니다. 18.

최근 연구는 Candida spp의 임상 격리에서 항진균 저항 마커의 식별 WGS의 유틸리티를 증명 하고있다. 10 , 19 , 20.이 높은 처리량 벤치탑 시퀀서, 설립된 생물 정보학 파이프라인 및 시퀀싱21,22의 비용 감소의 가용성 때문입니다. 생어 시퀀싱은 WGS 단일 실행에 여러 게놈의 연속을 허용을 통해 곰 팡이 WGS의 장점. 또한, Candida 게놈의 WGS 약물 목표에서 새로운 돌연변이 식별 수, 유전 진화 및 임상 관련 시퀀스 형식을20,,2223의 출현을 추적. 가장 중요 한 것은, 경우에 본질적인 multidrug 저항, WGS 치료 선택22,24이전 저항 부여 돌연변이의 조기 발견에 지원할 수 있습니다.

여기, 우리는 약물 저항 antifungal 에이전트의 다른 클래스와 관련 된 돌연변이 대 한 심사 WGS 사용의 타당성 검사. 우리는 최종 사용자와 진단 균 학 실험실 관점에서 샷건 시퀀싱의 구현에 대 한 방법론을 제시. 우리는 3 세 별도 임상 사례는 생체 외에서 echinocandins와 5 flucytosine 항진균 치료 다음과 같은 시간이 지남에 개발에서 경작 하는 쌍을 분리 하는이 분석에 포함.

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프로토콜

윤리적인 승인을이 연구를 위해 필요 했다.

1. 서브 컬쳐와 inoculum Candida glabrata 에 대 한 준비

  1. 또한 적어도 하나의 C. glabrata 미국 유형 문화 수집 (ATCC) 알려진된 민감성 패턴을 포함 해야 공부를 해야 C.glabrata 분리의 패널을 선택 합니다.
  2. Subculture 단일 식민지 만져 격리 멸 균 일회용 플라스틱 루프를 사용 하 여 및 Sabouraud의 포도 당 한 천 (SDA)에 줄무늬 접시8.
  3. 좋은 성장 분리의 순수한 문화에 대 한 35 ° C에서 24-48 h SDA 플레이트를 품 어.

2입니다. 항진균 자화 율의 결정

  1. SDA 접시에 갓 subcultured C. glabrata 에서 약 1 m m 직경의 4 ~ 5 식민지를 선택 살 균 일회용 플라스틱 루프 격리를 사용 합니다. 3 mL의 멸 균 증류수에 resuspend. 균일 한 현 탁 액을 얻기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 섞는다.
  2. 1 x 106 8농도계 사용 하 여 5 x 106 셀/mL에 0.5 맥 팔 랜드에 셀 밀도 조정 합니다.
  3. 민감성 상업 분석 결과 사용 하 여 테스트 수행 (테이블의 재료 및 시 약 참조) 모든 C. glabrata 에 제조업체의 지침에 따라 분리. CLSI 지침에 따라 항진균 약물의 결과 마이크에 따라 격리의 민감도 해석 하 고 보고서 (표 1)8.

3. 시퀀싱에 대 한 게놈 DNA 추출

  1. 1.5 mL 튜브에 50 mM EDTA의 300 µ L에서 갓 자란된 SDA 접시에서 식민지의 loopful를 resuspend.
  2. Zymolyase (10 mg/mL)의 40 µ L를 추가 정지, 그리고 부드럽게 피펫으로 5 번까지 현 탁 액이 균일 합니다.
  3. 세포 벽을 소화 하기 위해 1-2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어. 5 분 동안 실내 온도에 냉각 하십시오.
  4. 원심 2 분 14000 × g 에서 정지 하 고 신중 하 게는 상쾌한 제거.
  5. DNA 추출 키트 지침 (재료의 표 참조)에 따라 genomic DNA를 추출 합니다.
  6. Resuspend 50 µ L 10 mM Tris 버퍼 (pH 7.5-8.5)는 키트에 제공 된 차입 버퍼 대신의 펠 릿 DNA를 추출.
  7. 260/280 nm25에 광학 밀도 (O.D) 측정 하 여 DNA의 순도 확인 하십시오.

4. 게놈 DNA 정량화

  1. 트리 스 EDTA (테) 버퍼 형광 분석 결과 대 한 제조업체의 지침에 따라 분석 결과 키트에 제공 된 x 1을 준비 (재료의 표 참조).
  2. 테 분석 결과 버퍼 (100 µ L, 희석 비율 1시 50분의 최종 볼륨) 일회용 96 잘 접시에서 x 1의 98 µ L를 2 µ L을 추가 하 여 DNA 샘플을 희석. 또한 수동으로 사용 하 여 멀티 채널 피 펫이 희석 단계를 수행할 수 있습니다 또는 워크스테이션을 처리 하는 자동화 된 액체에 의해.
  3. 람다 DNA를 diluting 하 여 표준의 범위를 준비 (100 µ g/mL) 형광 분석 결과 키트 (표 2)에서 제공 하 고 측정 샘플 함께 포함.
  4. 100 µ L 100 µ L 형광 염료의 희석 DNA 샘플과 반응에 대 한 기준을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  5. 제조업체의 지침에 따라 모든 샘플의 형광을 측정 합니다.
  6. 형광 신호를 사용 하 여 표준 곡선을 플롯 하 고 DNA 샘플의 원래 농도 계산.
  7. DNA 농도 0.2 ng / µ L를 조정에 추가 될 DNA와 10 mM Tris 버퍼 (pH 8)의 볼륨을 결정 합니다.
  8. 워크스테이션을 처리 하는 자동화 된 액체를 사용 하 여 DNA 희석을 수행 합니다. 이 단계는 또한 수동으로 pipetting으로 얻을 수 있습니다.

5. DNA 라이브러리 준비

참고: 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 프로토콜 및 회사 (그림 1A)에 의해 제공 된 지침에 따라 수행 했다 (재료의 표 참조).

  1. Tagmentation 및 PCR 증폭
    1. 새로운 96-잘 단단한 얇은 벽 플레이트를 레이블을 지정 합니다.
    2. 0.2 ng / µ L에서 정량된 입력 DNA의 5 µ L를 추가 (1 총에서 ng) 접시의 각 샘플을.
    3. 각 잘 포함 dna tagmentation 버퍼의 10 µ L 및 증폭 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 플라스틱. 접착성 판 도장 접시를 봉인.
    4. 열 cycler에 접시를 놓고 다음 PCR 프로그램 실행: 5 분, 그리고 10 ° c.에 보류에 대 한 55 ° C 샘플 10 ° C를 도달 하는 때, 즉시 중화를 진행 합니다.
    5. Amplicon 반응, 중화를 접시에 중화 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 플라스틱. 접시를 봉인 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
    6. 샘플을 PCR mastermix 인덱싱의 15 µ L를 추가 합니다.
    7. 96 잘 접시 형식 설정 사용할 수 있는 인덱스 뇌관 튜브의 상자를 사용 하 여 각 샘플 인덱스 템플릿 (표 3)에 따라 인덱스의 독특한 조합을 가져옵니다 있도록.
    8. 인덱스 뇌관 튜브 인덱스 플레이트 랙 (그림 1B)에서 표 3에 서식 파일에서 제공 하는 순서를 사용 하 여 정렬 하 고 서식 파일에서 인덱스의 위치를 기록 합니다.
    9. 순서로 인덱스 튜브와 인덱스 플레이트 선반에 추가 PCR mastermix로 tagmentation 접시를 놓습니다.
    10. 인덱스 선반에 수평 배열에서 수직 배열에서 인덱스 뇌관 1 튜브 및 인덱스 뇌관 2 튜브를 넣어. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 추가할 인덱스 뇌관의 5 µ L 각 샘플.
    11. 인덱스 사이 상호 오염을 피하기 위해 새로운 모자에 인덱스 튜브의 오래 된 모자를 바꿉니다.
    12. 분명 96 잘 접시 포경을 사용 하 여 접시를 밀봉 하 고 다음과 같이 두 번째 PCR을 수행: 95 ° C 30에 대 한 s, 10 95 ° C의 12 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s와 5 분 동안 72 ° C.
  2. PCR 정리
    1. 깊은 잘 격판덮개 tagmentation 판에서 PCR-정리, PCR 제품을 전송 (재료의 표 참조).
    2. 소용돌이 상업 자석 구슬 솔루션 (재료의 표 참조) 제조업체의 지침에 따라 하 고 깊은 잘 격판덮개에 각 PCR 제품을 구슬의 30 µ L를 추가 합니다.
    3. 2 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어 하 고 5 분 동안 흔들어 하지 않고 실 온에서 품 어.
    4. 상쾌한이 맑게 될 때까지 2 분 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다.
    5. 마그네틱 스탠드에 여전히 접시와 함께 신중 하 게 상쾌한을 삭제 합니다.
    6. 마그네틱 스탠드에는 접시와 함께 갓된 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.
    7. 30 대 한 마그네틱 스탠드에 접시를 품 어 s 신중 하 게 제거 하 고 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.
    8. 세척 단계를 다시 반복 하 고 구슬 있는 경우 15 분 제거 초과 에탄올에 대 한 건조를 허용 합니다.
    9. 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 구슬에 물의 resuspension 버퍼의 52.5 µ L를 추가 합니다.
    10. 2 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어 하 고 동요 하지 않고 2 분 동안 실 온에서 품 어.
    11. 마그네틱 스탠드에 접시를 놓고 취소 상쾌한 허용 합니다.
    12. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 전송 50 µ L는 상쾌한의 정리 판에서 새로운 단단한 격판덮개.
  3. 라이브러리 정규화
    1. (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에 따라 라이브러리 정규화 시 약 녹여
    2. 정리 판에서 새로운 깊은 잘 격판덮개는 상쾌한의 20 µ L를 전송.
    3. 마그네틱 비드 현 탁 액의 45 µ L을 추가 하 고 접시 마감재와 접시를 봉인.
    4. 30 분 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어. 이 보육 시간 중요 한 이며 초과할 수 없습니다.
    5. 2 분 동안 마그네틱 스탠드에 접시를 놓고 확인 하는 상쾌한 (그림 1B)를 허가 했다.
    6. 제거 하 고 상쾌한 마그네틱 스탠드에 여전히 접시와 함께 적절 한 유해 폐기물 용기에 폐기.
    7. 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 세척 45 µ L 워시 버퍼와 구슬.
    8. 5 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 워시 버퍼와 플레이트를 흔들어.
    9. 분명 때 2 분 및 폐기 상쾌한 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다.
    10. 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 다시 워시 버퍼와 세척을 반복.
    11. 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 0.1 N NaOH의 30 µ L를 추가 합니다.
    12. 5 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 0.1 N NaOH와 플레이트를 흔들어 하 고 마그네틱 스탠드 2 분 또는 때까지 액체 분명 하다에 접시를 놓습니다.
    13. 새로운 96-잘 단단한 얇은 벽 최종 정규화 된 라이브러리 플레이트의 각 우물에 차입 버퍼의 30 µ L를 추가 합니다.
    14. 마지막 볼륨 60 µ L을 최종 정규화 된 라이브러리 접시에 정규화 접시에서 상쾌한의 30 µ L를 전송. 라이브러리 이제 시퀀싱 할 준비가 되어 있습니다.
  4. 정량에 의해 DNA 도서관 농도의 결정
    1. 녹여 mastermix, 뇌관 및 표준 (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에 따라 정량 키트에 제공 된.
    2. PCR 시 약 mastermix와 제조업체의 지침에 따라 정량 키트에 제공 된 뇌관 결합 하 고 aliquots는-20 ° c.에 저장 될 수 있다
    3. DNA 라이브러리 농도 확인 하려면 1:80 희석 (2 µ L 1: 100에서 158 µ L Tris 버퍼에) 다음 1: 100 희석 (1.5 µ L DNA 라이브러리 148.5 µ L Tris 버퍼)를 수행 하 여 10 mM Tris 버퍼 (pH 8)를 사용 하 여 DNA 라이브러리의 1/8000 희석을 확인 합니다.
    4. 적어도 1 분 동안 700 rpm에서 희석 플레이트를 흔들어 하 고 1 분 동안 14000 × g 에서 원심.
    5. 희석된 DNA 라이브러리 또는 DNA 표준의 4 µ L mastermix의 16 µ L를 혼합 하 여 최종 PCR 반응의 20 µ L를 준비 합니다.
    6. 다음 제조 업체의 설정을 thermocycler에서 PCR을 수행: 5 분, 95의 35 주기 동안 95 ° C 45 s, 및 마지막 65 ° C ~ + 95 ° C 용융 곡선 분석을 위한 30 s 및 60 ° C에 ° C.
    7. 정량 Pcr thermocycler에서 샘플 DNA 라이브러리 및 표준의 Ct 값을 가져옵니다.
    8. (그림 2) 표준의 Ct 값에서 표준 곡선을 생성 합니다. 3 주기 평균에서 ± 하 여 상위 및 하위 QC 범위를 정의 합니다. 예를 들어 평균 Ct 값은 13 주기 하는 경우 다음 QC 범위는 16과 10 주기 사이.
    9. 표준 곡선 및 Ct 값에서 개인 및 평균 라이브러리 농도 (ALC)을 결정 합니다.
    10. 대상 라이브러리 농도 사이 1.4-8 오후 1 고려 최종 시퀀싱에 대 한 아래에 주어진 계산을 기반으로 총 풀링된 라이브러리 (PAL) 사용할 수의 볼륨을 결정 합니다.
      참고: 라이브러리 농도 정량에서 얻은 평균 ALC; = 총 풀링된 라이브러리 (PAL) ALC = / 2; PAL (DAL) 변성 PAL = * 0.666
      버퍼와 혼합 되어 달의 볼륨에 따라 흐름 셀에 추가할 라이브러리의 농도가 이다. 예를 들어 라이브러리의 65 µ L 버퍼의 835 µ L에 추가 됩니다, 다음이 희석 (Dil 1) 195에서에서 추가 됩니다 1300 µ L의 총 볼륨: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = 최종 농도 (사이 1.4-8 오후 1 이어야 함)

6. 도서관 풀링 및 벤치탑 시퀀서에서 Initiating 시퀀싱

  1. 해 동 시 약 카트리지 제조 업체의 지침에 따라입니다. 4 ° C 저장소에서 패키지에서 새로운 흐름 세포 밖으로가 고 실 온 이어야 시퀀싱 전에 30 분을. 버퍼 카트리지 및 prechill 시퀀싱 버퍼 사용 하기 전에 밖으로 데리고 (재료의 표 참조).
  2. 컨트롤 라이브러리 라이브러리의 5 µ L를 혼합 하 여 준비 (1 nM)와 0.2 N NaOH의 5 µ L. 짧게 소용돌이 컨트롤 라이브러리를 단일 가닥으로 변성을 실 온에서 5 분 동안 품 어 고.
  3. 200 mM Tris HCl, pH 7 및 소용돌이의 5 µ L를 추가 합니다. 235 µ L prechilled 시퀀싱 버퍼를 추가 하 고 부드럽게 혼합. 총 볼륨은 컨트롤 라이브러리 최종 농도 20 250 µ L 오후.
  4. 각 샘플 라이브러리 단일 낮은 바인딩 1.5 mL 튜브에 최종 표준된 라이브러리 접시에서 시퀀스의 5 µ L를 전송 하 여 풀 DNA 라이브러리.
  5. 30 µ L의 풀링된 라이브러리 및 라이브러리 다른 낮은 바인딩 튜브에 변성을 0.2 N NaOH의 30 µ L를 추가 합니다.
  6. 소용돌이 낮은 바인딩 튜브 및 단일 가닥으로 라이브러리를 변성을 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  7. 200 mM Tris HCl, 중화 반응에 변성된 라이브러리와 튜브를 pH 7의 30 µ L를 추가 합니다.
  8. 중화 변성된 라이브러리 현 탁 액의 65 µ L 미리 냉장된 시퀀싱 버퍼와 잘 혼합 하는 소용돌이의 835 µ L를 추가 합니다.
  9. 최종 낮은 바인딩 튜브에서 다음 결합: 중화 변성된 라이브러리, 컨트롤 라이브러리 및 시퀀싱 버퍼의 1103.70 µ L의 1.30 µ L에서 195 µ L. 제대로 믹스.
  10. 시 약 카트리지에 지정 된 장소로 최종 라이브러리 믹스 (1300 µ L)를 로드 합니다.
  11. 시퀀싱 Sequencer에서 프로젝트 및 샘플 세부 정보를 입력 하 여 실행 설정 지정 지침에 따라 웹사이트.
  12. 시작 시퀀스 지침입니다. 흐름 세포, 라이브러리와 시 약 카트리지 및 벤치탑 시퀀서에서 버퍼 카트리지를 로드.
  13. 모든 시 약 키트 및 시퀀싱에 사용 되는 카트리지 일괄 처리 번호를 기록 합니다.

7. 데이터 시퀀싱 웹사이트에서 다운로드

  1. 웹사이트에서 제공 하는 제조업체의 지침에 따라 FASTQ 파일을 다운로드 합니다.
  2. 좋은 품질 검사 실행에 대 한 170-280 K/m m2 와 사이 Q30 비율 ≥ 75%와 클러스터 밀도 200-210 K/m m2 (표 4)에 최적.

8. 시퀀싱 데이터 분석

  1. 데이터 분석 통합된 소프트웨어 패키지로 시퀀스 샘플의 FASTQ 파일 가져오기 (재료의 표 참조).
  2. 참조 (선택 참조 게놈) 매핑, 지방 재배치와 변형 분석그림 3(A) 설정을 사용 하 여 표 5에 나열 된, 즉 트리밍 목록에서 기능을 추가 하 여 소프트웨어에서 시퀀싱 워크플로 만듭니다.
  3. 한 샘플 또는 샘플 FASTQ 파일의 배치를 선택 하 여 워크플로 실행 하 고 지정 된 샘플 폴더에서 출력 파일을 저장 합니다.
  4. 게놈 (그림 3B)에 시퀀스 범위 깊이, 매핑된 영역 및 구조 이체의 목록에 대 한 보고서를 생성 합니다.
  5. 목록 구조 이체의를 사용 하 여 동의어 아닌 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 유전자 부여 저항 및 독성에에서 대 한 검색.
  6. SNP 위치, 유전자, 및 저항 또는 취약 격리 (표 6)의 수를 나열 하 여 보고서를 준비 합니다.

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결과

C. glabrata (CMRL12에 CMRL1 격리) 임상 균 학 참조 실험실에서 C. glabrata ATCC 90030 및 12 격리 구성, 웨스트 미드 병원, 시드니 공부 했다 13 (표 1). 이러한 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 CMRL-5/CMRL-6 얻은 그들 사이의 역학 링크와 항진균 치료 전후 격리의 3 개 쌍을 포함 24 (표 1).

마이크 CLSI 해석 중단점을 사용 하 여 9 항진균 요원 즉, 암포 (AMB), Anidulafungin (애니), Micafungin (MIF)에 대 한 결정 했다 Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), Itra...

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토론

이 연구는 타당성, 대략적인 일정 및 C. glabrata에서 약물 저항의 WGS 기반 검출의 정밀도 결정 했다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 처리 시간 (TAT) 4 일 되었고 분석된 결과 1-2 일의 보고. 이것은 적어도 비슷한 금액으로 문신 문화 접시와 Sanger에서 민감도 분석에 대 한 비교 시퀀싱 샘플의 상당히 높은 수. 약 30-90 C. glabrata 게놈 시퀀싱 흐름 셀 용량, 80-100% 연속 범위에 따라 시퀀싱 할 수 있습니다. 이 연구의 비용/리소스 요구 사항을 생어의 현재 비용을 해당 되었다 있기 때문에 시퀀싱 사내 WGS 실험실 설치에서 수행 되었다, 시퀀싱 및 프로브 기반 분석 샘플 당 AUD 80-100의 예상 비용. 모든 격리의 감수 성은 시각적으로 읽기 미러를 사용 하 여 읽어온 상업 시험 키트에 의해 결정 되었다. 문화 성장 변화 블루 색도계 성장 표시기에 의해 표시 되었다 분홍색. 마이크 읽 었는 데 잘 첫 블루로 핑크 (성장)의 시리즈 즉, 우물 후...

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공개 사항

저자 있고 아무 경쟁 금융 관심사 없이 상충 공개.

감사의 글

이 작품 전염병 및 미생물학, 보건 센터에 의해 지원 되었다. 저자는 어떤 다른 자금 조달이 연구에 대 한 받지. 저자는 그들의 전문가 조언 및 지원 전체 게놈 시퀀싱 실험에 대 한 Drs 엘리샤 Arnott, 네이 선 Bachmann 및 Ranjeeta Menon을 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DensiCHECK 플러스BioMé rieux IncK083536McFarland 판독에 사용되는 농도계,
Sensititre YeastOneTREK 진단 시스템, Thermo ScientificYO10표준 항진균제를 사용한 상업용 감수성 분석 플레이트.
Fisherbrand 일회용 접종 루프 및 바늘Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605일회용 플라스틱 루프는 패키지에서 직접 사용할 수 있습니다. 화염이 필요하지 않습니다.
Eppendorf Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브Sigma Aldrich, MerckT2795     용량 2.0 mL, 천연
 
MP Biomedicals, LLC의 ZYMOLYASE 20T8320921진균 분리 전
DNA 추출
마법사 게놈 DNA 정제 키트의프로메가 A1120100개의 DNA 추출을 수행합니다
. Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트Thermo Fisher ScientificP7589  프로토콜에서 형광 염료라고 하는 Picogreen 시약
분석을 위한 Lambda DNA 표준 및 피코그린 시약을 포함합니다.
Nextera XT DNA 샘플 준비 키트IlluminaFC-131-1096포함 박스 1 및 박스 2  96개 샘플용 시약
Nextera XT 인덱스 키트 v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		인덱스 세트 A
인덱스 세트 B
인덱스 세트 C
인덱스 세트 D
NextSeq 500/550 고출력 키트 v2 IlluminaFC-404-2004300 사이클, 키트당 250개 이상의 샘플
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 사이클, 키트당 130개 이상의 샘플
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001Index 키트에서 인덱스를 정렬하려면
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005  2개의 조명기구
KAPA 라이브러리 수량화 키트
차세대 시퀀싱용		KAPA BiosystemsKK4824사전 제작된 표준, 프라이머 및 MasterMix
Janus NGS Express 액체 처리 시스템 포함 PerkinElmerYJS4NGS염기서열 분석 중 DNA 희석에 사용됩니다
  0.8 mL 저장 플레이트Thermo ScientificAB0765BMIDI 플레이트 DNA 라이브러리 정리 및
정규화
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881  라이브러리 정제를 위한 용액에 있는 자석
비드 Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027자석 비드 기반 DNA 정제에 사용되는
OrbiShaker MP 벤치 마크 사이언티픽BT150296 웰 플레이트 쉐이커 4 플랫폼
하드 쉘 PCR 플레이트BioRadHSP9601얇은 벽, 96
웰 LightCycler 480 기기 II 로슈 501527800196 웰 플레이트
Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학 바이오라드  MSB1001투명 96웰 플레이트 실러,
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLICBio소프트웨어, 버전 8
NextSeq500 기기Illumina 일루미나 차세대 염기서열분석에 사용되는 벤치탑 시퀀서
, , Arthrobacter luteus 세포벽 용해에 사용됩니다.은 , , 데이터 분석을 위한

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