이 연구는 Candida glabrata에 항진균 약물 저항을 부여 하는 유전자에 돌연변이의 분석을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 구현. C. glabrata 격리 저항 echinocandins, azoles 및 5-flucytosine 하는 방법론을 설명 하기 위해 시퀀싱 했다. 유전자의 특정 돌연변이 패턴의 존재 여부와 상관 하는 격리의 민감성 프로필.
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방법 논문
전체 게놈 시퀀싱 Candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Candida glabrata 신속 하 게 될 약물 저항, 특히 azoles 및 echinocandins 돌연변이 수집할 수 있습니다. 유전자 변이의 식별, 필수적 이다 저항 체 외에서 수 자주와 상관 될 임상 실패 감지. 우리는 항진균 약물 저항 C. glabrata의 게놈 넓은 분석에 대 한 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)를 사용 하 여의 타당성을 검사 합니다. 목표는 torecognize enablers와 장벽을 WGS 구현에서 되었고 그 효과 측정. 이 문서는 주요 품질 관리 검사점 및 항진균 요원 민감성 감소와 관련 되었던 유전자 표시를 조사 WGS 방법론의 필수 구성 요소를 설명 합니다. 그것은 또한 데이터 분석의 정확도 테스트 시간 주위 차례 견적.
12 임상, phenotypic 민감성과 C. glabrata 의 한 ATCC 스트레인 항진균 민감도 테스트를 통해 결정 되었다. 이 포함된 3 쌍, 3 환자, 마약 최소 억제 농도 상승 개발에서 격리. 두 쌍에서 두 번째의 각 쌍 개발 저항 echinocandins 격리 합니다. 3 쌍의 두 번째 분리 5 flucytosine에 저항을 개발 했다. 나머지 구성 취약 azole 내성 격리. Echinocandin, azole 5 flucytosine 저항에 연결 하는 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)는 WGS 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 통해 저항 격리에서 확인 되었다. FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 및 FCY2 같은 유전자 발견 했다 항진균 저항 비 동의어 Snp. 전반적으로, 약 75-fold 읽기 깊이 범위와 참조 게놈에 매핑된 C. glabrata 격리의 WGS 읽기의 98%의 평균. 처리 시간 및 비용 생어 비교 했다 순서.
결론적으로, C. glabrata 의 WGS 다중 PCR/DNA 연속 반응에 대 한 필요 없이 다른 항진균 약물 클래스에 저항에 관련 된 임상적으로 중요 한 유전자 돌연변이 공개에서 가능 했다. 이 항진균 성 부여 대체의 동시 검출에 대 한 임상 실험에서 샷건 시퀀싱 기능 설정으로 긍정적인 단계를 나타냅니다.
서론
Candida glabrata 는 azoles 뿐만 아니라 최근에, echinocandins,12,3저항을 전시 하는 종족으로 중요도 점점 발생된 병원 체 이다. 2 중 C. albicans, 달리 C. glabrata 의 단일 게놈 돌연변이 획득 하 고 보다 쉽게 다중 약물 저항을 개발 하도록 허용할 수 있습니다. 공동 저항에 두 약물 클래스 되었습니다 보고4. 따라서, 항진균 민감성의 초기 평가 및 C. glabrata 에서 약물 내성의 검출은 항균 성 저항1 의 드라이버 제한 항진균 집사의 직의 맥락에서 뿐만 아니라 정확 하 고, 타겟 치료에 대 한 중요 한 , 5 , 6. 빠르게 감지 저항 격리 바이오 마커의 저항에 연결 하는 확실 한 돌연변이의 존재는 또한 처방을 개선 하기 위해 도움이 결정 하는 효율적인 워크플로 및 임상 결과 설정.
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프로토콜
윤리적인 승인을이 연구를 위해 필요 했다.
1. 서브 컬쳐와 inoculum Candida glabrata 에 대 한 준비
- 또한 적어도 하나의 C. glabrata 미국 유형 문화 수집 (ATCC) 알려진된 민감성 패턴을 포함 해야 공부를 해야 C.glabrata 분리의 패널을 선택 합니다.
- Subculture 단일 식민지 만져 격리 멸 균 일회용 플라스틱 루프를 사용 하 여 및 Sabouraud의 포도 당 한 천 (SDA)에 줄무늬 접시8.
- 좋은 성장 분리의 순수한 문화에 대 한 35 ° C에서 24-48 h SDA 플레이트를 품 어.
2입니다. 항진균 자화 율의 결정
- SDA 접시에 갓 subcultured C. glabrata 에서 약 1 m m 직경의 4 ~ 5 식민지를 선택 살 균 일회용 플라스틱 루프 격리를 사용 합니다. 3 mL의 멸 균 증류수에 resuspend. 균일 한 현 탁 액을 얻기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 섞는다.
- 1 x 106
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결과
C. glabrata (CMRL12에 CMRL1 격리) 임상 균 학 참조 실험실에서 C. glabrata ATCC 90030 및 12 격리 구성, 웨스트 미드 병원, 시드니 공부 했다 13 (표 1). 이러한 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 CMRL-5/CMRL-6 얻은 그들 사이의 역학 링크와 항진균 치료 전후 격리의 3 개 쌍을 포함 24 (표 1).
마이크 CLSI 해석 중단점을 사용 하 여 9 항진균 요원 즉, 암포 (AMB), Anidulafungin (애니), Micafungin (MIF)에 대 한 결정 했다 Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), Itra.......
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토론
이 연구는 타당성, 대략적인 일정 및 C. glabrata에서 약물 저항의 WGS 기반 검출의 정밀도 결정 했다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 처리 시간 (TAT) 4 일 되었고 분석된 결과 1-2 일의 보고. 이것은 적어도 비슷한 금액으로 문신 문화 접시와 Sanger에서 민감도 분석에 대 한 비교 시퀀싱 샘플의 상당히 높은 수. 약 30-90 C. glabrata 게놈 시퀀싱 흐름 셀 용량, 80-100% 연속 범위에 따라 시퀀싱 할 수 있습니다. 이 연구의 비용/리소스 요구 사항을 생어의 현재 비용을 해당 되었다 있기 때문에 시퀀싱 사내 WGS 실험실 설치에서 수행 되었다, 시퀀싱 및 프로브 기반 분석 샘플 당 AUD 80-100의 예상 비용. 모든 격리의 감수 성은 시각적으로 읽기 미러를 사용 하 여 읽어온 상업 시험 키트에 의해 결정 되었다. 문화 성장 변화 블루 색도계 성장 표시기에 의해 표시 되었다 분홍색. 마이크 읽 었는 데 잘 첫 블루로 핑크 (성장)의 시리즈 즉, 우물 후.......
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공개 사항
저자 있고 아무 경쟁 금융 관심사 없이 상충 공개.
감사의 글
이 작품 전염병 및 미생물학, 보건 센터에 의해 지원 되었다. 저자는 어떤 다른 자금 조달이 연구에 대 한 받지. 저자는 그들의 전문가 조언 및 지원 전체 게놈 시퀀싱 실험에 대 한 Drs 엘리샤 Arnott, 네이 선 Bachmann 및 Ranjeeta Menon을 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DensiCHECK 플러스 | BioMé rieux Inc | K083536 | McFarland 판독에 사용되는 농도계, |
| Sensititre YeastOne | TREK 진단 시스템, Thermo Scientific | YO10 | 표준 항진균제를 사용한 상업용 감수성 분석 플레이트. |
| Fisherbrand 일회용 접종 루프 및 바늘 | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | 일회용 플라스틱 루프는 패키지에서 직접 사용할 수 있습니다. 화염이 필요하지 않습니다. |
| Eppendorf Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브 | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | 용량 2.0 mL, 천연 |
| MP Biomedicals, LLC | 의 ZYMOLYASE 20T | 8320921 | 진균 분리 전 DNA 추출 |
| 마법사 게놈 DNA 정제 키트의 | 프로메가 | A1120 | 100개의 DNA 추출을 수행합니다 |
| . Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트 | Thermo Fisher Scientific | P7589 | 프로토콜에서 형광 염료라고 하는 Picogreen 시약 분석을 위한 Lambda DNA 표준 및 피코그린 시약을 포함합니다. |
| Nextera XT DNA 샘플 준비 키트 | Illumina | FC-131-1096 | 포함 박스 1 및 박스 2 96개 샘플용 시약 |
| Nextera XT 인덱스 키트 v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | 인덱스 세트 A 인덱스 세트 B 인덱스 세트 C 인덱스 세트 D |
| NextSeq 500/550 고출력 키트 v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 사이클, 키트당 250개 이상의 샘플 |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 사이클, 키트당 130개 이상의 샘플 |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | Index 키트에서 인덱스를 정렬하려면 |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2개의 조명기구 | |
| KAPA 라이브러리 수량화 키트 차세대 시퀀싱용 | KAPA Biosystems | KK4824 | 사전 제작된 표준, 프라이머 및 MasterMix |
| Janus NGS Express 액체 처리 시스템 포함 | PerkinElmer | YJS4NGS | 염기서열 분석 중 DNA 희석에 사용됩니다 |
| 0.8 mL 저장 플레이트 | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI 플레이트 DNA 라이브러리 정리 및 정규화 |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | 라이브러리 정제를 위한 용액에 있는 자석 |
| 비드 Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 자석 비드 기반 DNA 정제에 사용되는 |
| OrbiShaker MP | 벤치 마크 사이언티픽 | BT1502 | 96 웰 플레이트 쉐이커 4 플랫폼 |
| 하드 쉘 PCR 플레이트 | BioRad | HSP9601 | 얇은 벽, 96 |
| 웰 LightCycler 480 기기 II | 로슈 | 5015278001 | 96 웰 플레이트 |
| Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학 | 바이오라드 | MSB1001 | 투명 96웰 플레이트 실러, |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLICBio | 소프트웨어, 버전 8 |
| NextSeq500 기기 | Illumina | 일루미나 | 차세대 염기서열분석에 사용되는 벤치탑 시퀀서 |
참고문헌
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al.
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