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인간의 배아 줄기 (hES) 세포 유도에 사용되는 냉동 인간 배아는 하버드 대학에서 인간 과목의 사용에위원회와 배아 줄기 세포 연구 감독위원회 모두의 검토와 승인되었습니다 연구 프로토콜에 따라 적절한 정보를 동의를 다음과 같은 연구를 위해 기증했다 .
아래 서면 프로토콜 카원 외 의해 보고된 출판 매개 변수를 기반으로합니다. 2004 년 약간의 수정.
배아 문화
개발까지 확장 blastocyst 단계에 15 % Plasmanate로 보충 글로벌 매체의 방울로 퀸의 장점 해동 키트와 문화를 사용하여 인간 배아를 해동.
내부 세포 질량 Immunosurgery 기반 격리
준비 :
- 10cm 플레이트의 각 솔루션의 방울을 설정하여 조나 pellucida 및 immunosurgery의 제거 (아래 참조) 접시를 준비합니다. 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일과 중첩. 파생위한 배아마다 하나의 행을 준비합니다.
- EmbryoMax 산성 Tyrodes는 그대로 사용합니다.
- hES 세포 유도 매체 : 75 % KO - DMEM 10 % KO - 세럼 교체, 10 % Plasmanate, 2.5 % ES 세포 검사 태아 소 혈청 (FBS), 2mM Glutamax - I, 1 %가 아닌 필수 아미노산, 50 대 / ML 페니실린, 스트렙토 마이신의 50μg/ml, 0.055mM B - 메르 캅 토 에탄올, 5ng/ml bFGF.
- 토끼 안티 - 인간의 적혈구 세포 일차 항체는 hES 세포 유도 매체와 1시 10분에 희석 제조 업체의 제안에 따라 재구성.
- 기니 돼지 보완 혈청, hES 세포 유도 매체와 1시 10분에 희석 제조 업체의 제안에 따라 재구성.
- ° C 조직 문화 인큐베이터에서 사용하기 전에 37 모든 번호판을 평형.
- 전송 배아에 사용하기 위해 50μl - 100μl 모세관 pipettes (VWR)을 당기세요. 다이아몬드 펜과 0.2μm 필터를 갖춘 입 피펫 튜브와 함께 사용 끝을 잘라.
Immunosurgery 절차 :
참고 :
- 이 절차에서는 trophectoderm의 세포는 보완 활동과 협력하여 인간의 세포에 대한 감독 항체에 대한 간단한 노출에 의해 파괴됩니다. blastocyst만을 구조적 무결성 또한 면역 반응에 민감한되는 ICM을 방지 등 따라서, 프로토콜, 손상 trophectoderm와 함께 고품질의 배아와 함께 잘 작동됩니다.
- 모든 절차가 열띤 무대를 갖춘 절개 범위를 사용하여 수행했습니다.
단계 :
- 고집에서 배아를 방지하기 위해 FBS와 배아 전송을 위해 사용할 수 입 피펫을 씻어.
- 문화 접시에서 요리 AT의 hES 개최 드롭에 blastocyst을 전송.
- 방울 AT 시리즈를 통해 hES 드롭에서 blastocyst를 전송하여 절차를 시작합니다. 셋째 드롭, 조나 pellucida (보통 5~30초)의 해산에 대한 감시. 아니여 - 치료 또는 배아 무결성에주의하는 것은 위험 수 있습니다.
- hES 세포 유도 매체의 시리즈를 통해 전송 blastocyst은 하차 린스로 방울. 미디어와 Preloading 피펫은 즉시 반응 AT 무력화하는 것이 좋습니다. 모두 - 처리 AT 때까지 Blastocysts 여기 개최 수 있습니다.
- 37 부화 30 분 제 3 드롭 ° 조직 문화 인큐베이터에서 C에두고, 기본 항체 방울의 시리즈를 통해 blastocyst을 전송합니다.
- hES 세포 유도 매체의 시리즈를 통해 전송 blastocyst은 기본을 린스로 방울.
- trophectoderm 세포의 용해를 위해 볼 셋째 드롭 떠나, 보수 방울의 시리즈를 통해 blastocyst을 전송합니다. 그들이 lyse로 trophectoderm 세포의 "버블링"에 대한 무대에서 처음으로 30 초 동안 blastocyst을 관찰. 용해이 기간 내에 관찰되면 완료 때까지 반응을 모니터하기 위해 현미경의 무대에서 요리를 계속. 더 버블링이 최초 30 초 동안 관찰하지 않으면 trophectoderm 대부분 lysed 때까지 5 분마다 확인, 인큐베이터으로 돌아갑니다. 이 5~15분 소요될 수 있습니다. 반응 시간과 내부 세포 덩어리 잠재적인 피해를 최소화하기 위해 밀접하게 반응을 모니터링합니다.
- hES 세포 유도 매체의 시리즈를 통해 전송 blastocyst은 보완 작업을 씻어 방울.
- blastocyst (10μl VWR 모세관 튜브에서 나온)보다 약간 작은 직경 유리 피펫을 사용하여 lysed trophectoderm의 대부분을 벗겨 아래로 blastocyst을 그려합니다.
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- 플레이트 ICM은 mitotically inactivated 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 피더 세포로 분리. MEFs는 파생 전날을 준비과 hES 세포 유도 미디어 하루에 전환해야합니다. 4 잘 NUNC 요리 유도의 초기 단계를 잘 작동합니다.
- 첫째 1~2일에 대한 번호판을 방해하지 마십시오. 이후 배아 줄기 세포 식민지 (보통 명백한 1~2주 이내)의 가지에 대해 매일 확인합니다. 미디어는 3 일에있는 모든 다른 하루를 시작 이분의 일 볼륨에서 변경해야합니다.
ES 세포 파생물 및 passaging
hES 세포 가지가 약 0.5mm 이상에 도달하면 기계 수확하여 확장 준비가되었습니다.
- 기계식 가지의 절반을 분산 신선한 피더를 포함하는 새로운 접시에 전송할 수 있습니다. 배아의 줄기 세포 대단히 짧은 시간은 약 30-50 전지 각각해야합니다. 백업 최초의 통로 (P1)에 같은 가지의 다른 절반을 둡니다. 이 확장을 계속하고 같이 파생물 (p0)이 여러 번 포착에서하실 수 있습니다.
- 보조 식민지는 마찬가지로 분산하고 새로운 세포 라인이 효소 트립신과 passaging 적응 수있는 시간 구절 3-5 때까지 큰 문화 요리에 걸쳐 확장하실 수 있습니다. 문화 미디어의 혈청 내용도 점차 ES 세포 차별을 최소화하기 위해 이러한 초기 구절 중에 1퍼센트 0 %로 감소한다.
- 모든 기존 배아 줄기 세포 라인은 향후 확장을위한 초기 구절의 일부를 냉동하여 틀었해야합니다.
- 또한, 각각의 세포 라인은 핵형 분석에 의해 특징이어야하며 체외 및 생체내에 pluripotency와 분화 연구에 의해 확인되었습니다.