안정적인 만성 설치류 전기 생리학에 대 한 주사기-주 사용 메쉬 전자

요약

메쉬 전자 프로브는 완벽 하 게 통합 하 고 뇌 내에서 기록 하는 안정, 장기, 단일 신경 수준 제공 합니다. 이 프로토콜 메쉬 전자를 사용 하 여 실험에 대 한 vivo에서 , 바늘, stereotaxic 주입, 입/출력 인터페이스, 녹음 실험, 및 조직의 메쉬를 포함 하는 조직학에 로드 메쉬 제품의 제조와 관련 된 조사 합니다.

초록

삽입형 뇌 생리학 프로브는 얕 고 깊은 뇌 영역에서 spatiotemporal 고해상도 신경 활동을 기록 하 신경 그들의 능력 때문에 귀중 한 도구입니다. 그러나 그들의 사용을 방해,, 기계 및 구조 조사와 뇌 사이 불일치에 의해 조직 그 일반적으로 이어질 micromotion 및 결과와 gliosis 신호 만성 기록 실험에서 불안정. 반면, ultraflexible 메쉬 전자의 주입 주사기 주입을 통해 다음 메시 조사 양식 gliosis 원활한는 인터페이스 주위 뇌 조직 적어도 1 년에 개별 뉴런의 안정적인 추적을 가능 하 게 날짜 표시줄입니다. 주사기-주 사용을 사용 하 여 일반적인 마우스 신경 기록 실험의 주요 단계 메쉬 메쉬 전자 제품의 제조를 포함 하 여 표준 사진 평판 기반 프로세스에서 가능한 로드 많은 대학에서 전자,이 프로토콜 세부 정보 전자 표준 모 세관 바늘, stereotaxic 주입 비보, 입/출력 표준 장비 인터페이스, 제 지 또는 녹음 세션, 자유롭게 이동 하 고 뇌의 단면 조직학 메시의 연결 망 전자 메쉬 조직 포함. 대표적인 신경 녹음 및 조직학 데이터 표시 됩니다. 수 사관이이 프로토콜에 잘 알고 그들의 자신의 실험에 메쉬 제품을 통합 하 고 노화 연구 등 장기 안정적인 신경 인터페이스에서 제공 하는 독특한 기회를 활용 하는 데 필요한 지식을 것 이다 프로세스, 두뇌 개발 및 뇌 질환의 병 인

서론

단일 신경 해상도 뇌 매핑 수 있는 도구 개발 신경 과학 및 신경과에 중앙 중요성의 이다. Electroencephalography (뇌 파), magnetoencephalography (멕), 기능적 자기 공명 영상 (fMRI) 등 신경 연구에 대 한 비 침범 성 기술을 인간^{1, 동작 두뇌 활동을 상호 연결에 대 한 귀중 한 증명 2}, 하지만 그들은 구조를 공부 하 고 그들의 기본적인 마이크로미터 및 밀리초에 신경 네트워크의 확장, 각각^3,4대 한 필요한 spatiotemporal 해상도 부족. 특정 electrocorticography (ECoG) 프로브 및 광학 이미징 방법 전압에 민감한 염료를 사용 하 여 단일 단위 급격히 활동 vivo에서^5,6, 기록에 성공 하지만 그들은 일반적으로 근처에 효과가 있는 뇌 표면, 얕은 뇌 영역의 연구에 적용을 제한. 반면, 이식 전기 프로브 자유롭게 형광 라벨에 대 한 필요 없이 거의 모든 두뇌 지역에서 동물을 이동에 단일 신경 생리학을 측정할 수 있도록 필수적인 시스템 수준 신경 과학, 특히 반도체 산업에서 제작 기술을 밀 었 다로 채널 수백 및 수천^3,7,,89으로 계산 합니다. 이러한 기능 덕택으로 이식 전기 프로브 많은 중요 한 기여를를 만들었습니다 신경 과학, 신경학, 정보 처리 시각 시스템¹⁰, 신경 치료의 근본적인 연구를 포함 하 여 파 킨 슨 병¹¹및 뇌-기계 인터페이스 (BMIs) 고급 보 철^12,13의 데모 등 장애.

그럼에도 불구 하 고, 스파이크 진폭 및 개월^14,15 주 날짜 표시줄에 불안정 한 신호 감소로 각 성 하는 장기적인 불안정 삽입형 프로브 상대적으로 단기간의 연구에의 적용을 제한 했다 현상, 뇌 노화 및 개발 크게 답이 같은 질문을 떠난다. 장기적인 불안정 한계는 기존의 프로브 및 크기, 역학, 그리고 토폴로지^{14,15,,1617,18}에 뇌 조직 사이 불일치의 결과. 크기, 측면에서 신경 시 냅 스 및 somata 약 수십 나노미터 직경¹⁹, 마이크로미터에 각각, 전통적인 프로브는 종종 실리콘 microelectrode 배열 경우 상당히 큰 > 4 번 하나의 신경 세포 체^7,8의 크기입니다. 이러한 프로브의 비교적 큰 크기 자연 구조 및 조밀한 신경 조직, 따라서 만성 면역 반응에 기여 하 고 perturbing 공부 되 고 신경 회로의 연결 중단 될 수 있습니다. 기계적 특성 측면에서 전통적인 프로브는 크게 있는 그들은 이식 되; 매우 부드러운 신경 조직 보다 엄격한 심지어 "유연한" 프로브 폴의 10-20 µ m 두꺼운 시트에서 만든 적어도 100000 번 뇌 조직^20,21보다 엄격한 있습니다. 굽 힘 강성이이 불일치 하면 신뢰할 수 없는 단일-단위 확장된 녹음 하는 동안 추적 하 고 이식 사이트에서 만성 gliosis 유도로 이어지는 프로브 및 뇌 조직 사이 상대 기울이기 모션. 마지막으로, 기존의 뇌 프로브 토폴로지 구조 반드시 조직의 단단한 볼륨을 제외합니다. 토폴로지 같은 불일치 신경 회로의 연결을 방해, 신경, 폐해 셀 및 뇌 조직²², 내 혈관의 자연 3 차원 (3D) interpenetrated 배포 하는 걸로 고의 3D 전송 방해 신호 분자²³. 함께, 기존의 프로브의 이러한 단점 단일 신경 수준에서 경도 신경 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 모색 장기 호환성 부족 그들을 만들었습니다.

이러한 단점을 극복 하기 위해 우리는 "조직 같은" 신경 프로브 나 메쉬 전자^16,,2124의 새로운 패러다임을 개발 하 여 신경 및 전자 시스템 사이의 라인을 흐리게 하고자 결정 했다. 메쉬 전자 신경 조직, 마이크로미터 크기 규모 같은 나노미터의 뇌 조직, 그리고 (3) 3D의 그들과 유사 하 (2) 기계적 성질 (1) 구조 기능을 통합 하 여 크기, 역학, 그리고 토폴로지에 위의 일치 문제를 해결 macroporous 토폴로지 > 90% 공간 열고 따라서 신경 세포와 extracellular 환경을 통해 분자의 확산에 의해 상호를 수용 한다. 메쉬 전자 프로브는 주사기와 바늘, 깊은 두뇌 지역^21,25에 이식 하는 동안 최소한의 심각한 피해를 일으키는 통해 특정 뇌 영역에 정확 하 게 전달 수 있습니다. 신경 소마와 축 삭을 보여왔다 주 후 사출, 전자 기록 및 주변 뇌 조직²¹ 사이의 원활한 gliosis 무료 인터페이스 만드는 내 오픈 3D 메쉬 전자 프로브 구조를 상호 침투 ^{, 26 , 27}. 이러한 독특한 기능은 안정적으로 적어도 1 년 날짜 표시줄²⁷이상 같은 개별 뉴런에서 급격히 활동을 추적 하는 메쉬 전자 프로브 사용. 또한, 포토 리소 그래피 (PL)에 따라 메쉬 전자 제작 포함 될 수 있습니다, 시연된 채널 조사 간단한 연락처 마스크 리소 그래피를 사용 하 여 조사 당 최대 128 개의 전극을 전극의 수의 높은 확장성을 제공 합니다. ²⁸ 그리고²⁹전문된 장비 없이 주변 전자에 빠른 전기 연결을 허용 하는 플러그 앤 플레이 입/출력 (I/O) 디자인.

연구의 광범위 한 범위 측정 프로토콜 메쉬 전자 통합에서 혜택을 받을 수 있습니다. 대부분 intracortical 기록 실험 주사기 주입, 주입, 다음 대폭 감소 된 면역 반응을 통해 메쉬 전자의 최소 침 습 이식 절차에서 혜택을 수 있는 그리고 떠날 수 망에서 전자는 연속적인 조직학 및 각 기록 사이트를 둘러싼 생물 환경의 정확한 분석을 위한 immunostaining 조직. 특히 만성 기록 실험 메쉬 전자의 독특한 능력을 년 달에 대 한 개별 뉴런의 많은 수를 추적 하에서 가치를 파생 것입니다. 이 기능은 단일 신경 해상도 신경 회로의 경도 노화 연구, 조사 개발 두뇌, 및의 병 인에 문의 이전 실용적 되지 않은 연구에 대 한 기회를 만듭니다. encephalopathies¹⁶.

이 프로토콜에서 우리는 키 주사기-주 사용 메쉬 전자 ( 그림 1참조)를 사용 하 여 일반적인 마우스 신경 기록 실험에서 단계를 모두 설명 합니다. 설명 된 단계 로드 메쉬 전자 표준 모 세관 바늘, stereotaxic 주입 메쉬 전자에서 vivo에서,의 연결의 많은 대학에서 표준 PL 기반 프로세스 가능한 메쉬 전자 제품의 제조를 포함는 I/O를 표준 계측 인터페이스, 제 지 또는 자유롭게 이동 녹음 세션, 메쉬 전자를 포함 하는 뇌 조직의 조직학 단면 메쉬. 조직학 연구에만 메쉬 전자를 사용 하 여 일부 연구 자들은 전기 인터페이스 하 고 녹음 하 고, 어떤 경우에 그들은 그 단계를 건너뛸 수 있습니다 필요 하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에 대해 스스로, 후 수 사관 메쉬 전자 그들의 자신의 실험에 사용 하는 데 필요한 모든 지식이 있어야 합니다.

프로토콜

척 추가 있는 동물 주제에 수행 하는 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 하버드 대학에 의해 승인 되었다.

1입니다. 메쉬 전자 제품의 제조

참고:이 섹션에 설명 된 절차는 센터에 대 한 나노 스케일 시스템 (CNS) 하버드 대학에서 같은 표준 대학 클린 룸 시설 내 사용에 대 한 것입니다. 이 시설 뿐만 아니라 유사한 시설 예의 국가 나노기술 인프라 네트워크 (NNIN) 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 지원 일환으로 미국의 주위에 외부 사용자가 액세스할 수 있습니다. 이러한 시설에 많은 도구, 장비, 및이 섹션에서 설명 하는 자료의 클린 룸 시설을 제공 하 고 별도 구매 필요로 하지 것 이다.

주의: 메쉬 전자 제품의 제조에 사용 되는 화학 물질의 대부분은 위험한, 저항, 등 CD-26, 리무버 PG, 수 8 개발자, Ni 솔루션을 에칭. 사용 하기 전에 이러한 화학 물질에 대 한 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오 및 구현 하 고 항상 적절 한 안전 조치를 따르십시오.

1. 열 증발 100 깨끗 한 Si 웨이퍼에 Ni의 nm.
   참고: 일반적인 증 착 매개 변수는 5 x 10^-7 T의 기본 압력 및 1-2 Å/s의 속도. Ni 박막 웨이퍼에서 메쉬 전자 출시 해산 나중 것 이다 희생 계층 역할을 합니다.
2. 첫 번째 PL 마스크 (PL 마스크-1)를 사용 하 여 하단의 레이어 메쉬 전자 수-8 부정적인 감광 (그림 2A)의 청 정의.
   참고: PL (UV) 자외선 감광 기판 위에 개최 마스크에 닦지는 표준 제작 기술입니다. 빛 하나 게 불용 성 (부정적인 저항) 또는 성 (긍정적인 저항) 기판에 노출 된 지역. 마스크는 컴퓨터 원조 설계 (CAD) 소프트웨어에서 그려지고 일반적으로 공급 업체 로부터 주문. 마스크 aligner 마스크를 기판에 기존 패턴을 정렬 하 고 자외선에 노출 하는 데 사용 됩니다. 메쉬 전자 제품의 제조는 4 개의 다른 마스크를 (마스크-4 PL PL 마스크-1) 필요합니다. 우리의 마스크 디자인 요청 또는 리소스 사이트에서 사용할 수 있습니다 meshelectronics.org.
   1. 스핀 코트 수 8 2000.5 부정적인 감광 제 4000 rpm 400-500 nm의 대략적인 수 8 두께 웨이퍼에.
   2. 부드러운 빵 95 ° c.에 1 분 뒤에 65 ° C에서 1 분 열판에 웨이퍼
   3. PL 마스크-1 해당 하단 메쉬 수-8 레이어 하 수-8 노출 마스크 aligner에 웨이퍼를 로드 합니다. 100 mJ/cm²의 i 선 (365 nm 파장) 복용량에 노출.
   4. 게시물 65 ° c에서 95 ° c.에 1 분 뒤 1 분 열판에 웨이퍼를 구워
   5. 수-8 개발자의 쟁반에 웨이퍼를 담가. 부드럽게 교 반 하십시오 2 분에 대 한 솔루션 수-8에서 메쉬 패턴은 완전히 개발 되었습니다 때까지. 1 분 및 타격 건조 이소프로필 알코올의 쟁반에 린스.
   6. 열심히 구워 1 시간 동안 180 ° C에서 열판에 웨이퍼.
      참고: 수-8 구은 150 ° C와 개발에 따라 250 ° C 사이 일반적으로 하드는. 하드 빵 anneals 기계적 안정성을 보장 하기 위해 수 8 개발 및 추가 crosslinks 형성 수 있습니다 어떤 표면 균열. 수-8 레이어 및 상단에 대 한 190 ° C 180 ° C에서 열심히 베이킹 수-8 레이어 메쉬 전자에 대 한 좋은 결과 생성합니다.
3. PL 사용 하 여 마스크 2 금속 정의 인터커넥트 및 I/O 패드 (그림 2B).
   1. 300의 대략적인 간격에 대 한 4000 rpm에서 웨이퍼에 스핀 코트 LOR3A nm.
      참고: LOR3A polydimethylglutarimide 기반 저항 후속 금속 절차 동안 undercutting는 속도 이다.
   2. 5 분 동안 180 ° C에서 열판에 웨이퍼를 구워.
   3. 500의 대략적인 간격에 대 한 4000 rpm 스핀 코트 S1805 긍정적인 감광 nm.
   4. 1 분 동안 115 ° C에서 열판에 웨이퍼를 구워.
   5. 폭로 PL 마스크-2에 해당 하는 금속 S1805 인터커넥트 및 I/O 패드 마스크 aligner에 웨이퍼를 로드 합니다. 40 mJ/cm²의 h-라인 (405 nm 파장) 복용량에 노출.
   6. CD-26 감광 개발자의 쟁반에 웨이퍼를 담가. 부드럽게 교 반 하십시오 솔루션 금속 패턴을 상호 연결 될 때까지 1 분 되어 완전히 개발. 이온된 수 (DI)의 쟁반에 1 분 및 타격 건조 린스.
   7. 3 열 증발 Cr의 nm 뒤 80 nm Au의.
      참고: 최대 5 x 10^-7 T의 기본 압력 및 1 Å/s의 증 착 속도 일반적으로 최고의 영화 품질 양보.
   8. 금속은 완전히 약화 원하는 인터커넥트 및 메쉬 전자의 I/O 패드 영역에만 금속을 떠날 때까지 약 3 h 리무버 PG의 평면 비 커에 웨이퍼를 담가. 이소프로필 알코올에 타격 건조 린스.
4. PL 마스크-3를 사용 하 여 정의 Pt 전극 (그림 2C).
   1. 1.3.1 1.3.4 통해 단계를 반복 합니다.
   2. 웨이퍼는 S1805 PL 마스크-3 Pt 전극에 해당 노출 마스크 aligner 로드. 40 mJ/cm²의 h 라인 복용량에 노출.
   3. CD-26 감광 개발자의 쟁반에 웨이퍼를 담가. 부드럽게 교 반 하십시오 1 분 솔루션 Pt 전극 패턴을 완벽 하 게 개발 되었습니다 때까지. 1 분 및 타격 건조 디의 쟁반에 린스.
   4. 보증금 3 전자 빔 증발을 사용 하 여 Cr의 nm 뒤 50 nm의 Pt.
      참고: 일반적인 증 착 매개 변수는 5 x 10^-7 T의 기본 압력 및 속도 2 Å / s.
   5. 금속은 완전히 약화 메쉬 전자의 원하는 전극 사이트에만 Pt를 떠날 때까지 약 3 h 리무버 PG의 평면 비 커에 웨이퍼를 담가. 이소프로필 알코올에 타격 건조 린스.
5. PL 마스크-4를 사용 하 여 상위 계층 메쉬 전자 수-8 부정적인 감광 (그림 2D)의 청 정의.
   1. 1.2.5, 통해 1.2.1 PL 마스크-4 수 8의 상단 청 메쉬 레이어를 해당 노출 제외 하 고 단계 반복 합니다.
   2. 열심히 구워 190 ° C 1 h에서 열판에 웨이퍼.
      참고:이 온도 10 ° C 이상 수-8 (단계 1.2.6) 아래쪽의 하드 빵에 대 한. 이 온도 약간 아래쪽 수-8, 최고 수-8 레이어와 병합 하 고 따라서 단일, 연속 수 8 구조를 형성 하 리플로우됩니다.
6. 메쉬 전자는 이제 완전 한 (그림 2E 및 그림 3); Ni 희생 층을 용 해 하 여 Si 웨이퍼에서 그들을 해제.
   1. 50 W 1 분에 산소 플라즈마와 웨이퍼를 처리 합니다. 이 산화 수-8 표면을, 그것은 친수성 고 메시 수성 솔루션에 쉽게 중단 될 수 있도록 한다.
   2. 평면 비 커에 결합 하 여 염 산, 염화 제 2 철, 그리고 디 1: 1의 부피 비에: 20, 각각, Ni etchant의 솔루션.
   3. 메쉬 전자 완전히 Si 웨이퍼에서 릴리스 되었습니다 때까지 약 3 h에 대 한 Ni 현상 솔루션의 평면 비 커에 웨이퍼를 담가.
   4. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 Ni 현상에서 디의 100 mL 비 커 전자 프로브 출시 된 메쉬를 전송. 전송 망 전자 디의 신선한 비 커를 3 번 이상 rinsing 되도록.
   5. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 살 균, 70% / 30% 에탄올/물 솔루션을 메쉬 전자 전송 다음 rinsing에 대 한 살 균 물 망 전자 전송 피펫으로 사용.
      참고: 살 균, 후 메쉬 전자 기능화에 대 한 다른 솔루션을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 세포 접착 증진, 메쉬 전자 폴 리-D-lysine (1 mg/mL) 24 h의 수성 해결책을 전송할 수 있습니다.
   6. 메쉬 전자 전송 파스퇴르 피 펫 멸 균 1 x 인산 100 mL 비 커에 프로브를 사용 하 여 주입 비보전에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 합니다.

2. 바늘에 메쉬 전자 로드

1. 으로 구입한 피 펫 홀더 양쪽 끝에 흐름에 열려 있다. 주사 (그림 4A) 동안 누설 이므로 에폭시, 원형 나사 패스너 반대 끝 인감. 계속 하기 전에 강화 에폭시를 하자.
2. 유리 모 세관 바늘 피 펫 홀더에 삽입 합니다. 원형 강화 나사와 콘 세탁기 (그림 4B)를 사용 하 여 장소에 그것을 고정. 400 µ m 내부 직경 (650 µ m 외부 직경) 유리 모 세관 바늘이이 프로토콜에 대 한 사용 되었다. 다른 모 세관 바늘 재료 (예., 금속)와 직경 사용 될 수 있지만 injectability 되도록 메쉬 제품의 디자인을 변경 해야 할 수도 있습니다.
   참고: 모 세관 바늘 150 µ m에서 1.17 m m 내경 (1.5 m m 외부 직경 250 µ m)에 이르기까지 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 작은 바늘을 통해 주입 가로 및 세로 수 8 메쉬 요소 간에 더 심각한 교회법의 각, 수 8 메쉬 요소의 폭 감소, 얇은 스-8를 사용 하 여 만들고는 낮은 사용 하 여 추진 될 수 있습니다 (즉,., 큰 단위 셀) 메쉬 구조. 작은 모 세관 바늘 요청 또는 리소스 사이트에서 사용할 수 있습니다 설계 된 메시에 대 한 포토 meshelectronics.org. 400 µ m의 내경 및 외경 550 µ m의 유리 모 세관 바늘 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 400 µ m 내부 직경을 필요로 메쉬과 호환성을 유지 하지만 그들은 여기에서 설명 하는 연구를 위해 사용 되지 않은 동안 주입으로 인 한 심각한 조직 손상을 줄일.
3. 1 mL 주사기 모 세관 튜브의 2-4 cm 길이 사용 하 여 피 펫 소유자의 쪽 콘센트에 연결 합니다.
4. 메쉬 전자를 포함 하는 PBS의 100 mL 비 커에 유리 모 세관 바늘을 삽입 합니다. 전자 프로브 및 수동으로 메쉬 전자 프로브 (그림 5 및 보조 비디오 1) 바늘으로 그리는 주사기를 철회 메시의 I/O 패드 근처 바늘의 끝을 놓습니다.
   참고: I/O 패드 줄기 상호 연결 지역, 있으며 메쉬 장치 지역 육안으로 쉽게 식별할 수 때 메시 전자 프로브 솔루션에서 중단 된다. 올바른 방향으로 바늘에 메쉬 전자의 명확한 로딩 수 있습니다.
5. 푸시/당겨 바늘 내 메쉬 전자의 위치를 조정 하려면 주사기 플런저 여전히 식 염 수에 몰입 하는 동안.
   참고: 가능한 바늘의 끝 가까이 ultraflexible 메쉬 장치 지역으로 이상적인 위치. 이 구성은 보장 장치 지역 먼저 주입 하 고 I/O 패드는 동안 두뇌에 마지막 주입 될 것입니다 액체의 볼륨을 최소화 합니다.
6. 조심 스럽게 피 펫 소유자의 측 출구에서 모 세관 튜브를 분리 합니다. 바늘 이내 메쉬 전자의 위치를 변경할 수 있는 흡입 힘을 만드는 피하기 위해 천천히 그것을 분리 합니다.

3. 살아있는 쥐의 뇌에 메쉬 전자 stereotaxic 주입

참고: 마우스 했다 75 mg/kg 케 타 민 1 mg/kg dexdomitor의 혼합물으로 복 주입으로 마 취 마 취의 정도 수술 전에 발가락 핀치 방법으로 확인 했습니다. 마 취에서 37 ° C homeothermic 담요 위에 마우스를 배치 하 여 체온 유지 되었다. 적절 한 무 균 기술은 포함 압력가 마로 소독 하 되이 국한 되지 않음 사용 전에 h 1에 대 한 모든 금속 수술 기구, 멸 균된 장갑을 사용 하 여, 수술, 불 임 분야의 유지 보수를 통해 뜨거운 비드 소독 기를 사용 하 여 수술에 대 한 구현 수술 사이트, 70% 에탄올, 플라스틱 악기의 소독 및 depilated 두 피 주위 피부 절 개 전에 iodophor 함께 준비 했다. 생존 수술, 수술의 결론 후에 대 한 antiobiotic 연 고는 상처 주위에 적용 했다 그리고 마우스 패드를가 열 하는 37 ° C를 갖춘 케이지를 반환 했다. 마우스 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 했다 그들이 때까지 무인 남아 있었다. 마우스 최대 72 h는 수술에 대 한 0.05 mg/kg 몸 무게 마다 12 h의 복용량에 복 주입을 통해 무 통 buprenorphine를 부여 했다. 마우스 수술 후 다른 동물에서 분리 했다입니다. 마우스는 pentobarbital 270 mg/kg 몸 무게의 복용량의 복 중 주입 또는 transcardial 관류를 통해 안락사 했다 (단계 6.1 참조). 수 사관이, 외. 을 참조할 수 있습니다. ³⁰, 커비, 외. ³¹및 게이지, 외 알. ³² 설치류 stereotaxic 수술에 대 한 자세한 내용은.

1. 마우스를 anesthetize 하 고 stereotaxic 프레임에 그것을 해결.
2. 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 마우스의 눈에 눈 윤 활 유를 적용 합니다.
3. 치과 드릴 및 stereotaxic 프레임 사용 하 여 두개골에 원하는 좌표에서 craniotomy를 엽니다. 스테인레스 스틸 접지 나사 나 와이어의 삽입에 대 한 주사 사이트에서 두 번째 craniotomy를 엽니다.
4. 두개골에 클램핑 기판 치과 시멘트로 수정. 절차의 뒷부분에 나오는 접는 단계의 신뢰성을 개선 하기 위해 기판에는 약 1 m m 넓은 간격을 잘라.
   참고: 유연한 플랫 케이블 (FFC) 잘라는 "L" 모양 잘 작동 (그림 7A), 있지만 많은 물자 것으로 그들은 32 개 채널에 대 한 정확한 두께의 제로 삽입 강제 (ZIF) 커넥터 (0.18 ± 0.05 m m 두꺼운 케이블에 대 한 설계).
5. 메쉬 전자 stereotaxic 프레임 (그림 4C 와 그림 6A) 직각 끝 클램프를 사용 하 여 포함 된 바늘으로 피 펫 홀더를 탑재 합니다.
6. 5 mL 주사기를 사용 하 여 주사기 펌프 (그림 6D) 고정 피 펫 소유자의 측면 콘센트를 연결할는 약 0.5-1 m 모 세관 튜브의 길이.
   참고: 피 펫 소유자에 게 그것을 연결 하기 전에 모 세관 배관에 있는 아무 거품을 확인 합니다. 거품이 흐름 주입을 중단 하 고 메쉬 전자의 매끄러운, 통제 배달 되지 않도록 수 있습니다.
7. Stereotaxic 프레임을 사용 하 여 뇌 내에서 원하는 시작 위치에서 바늘의 팁의 위치.
   참고: 여기에 사용 된 메쉬 전자 감지기는 기록 전극의 ca. 길이 걸쳐 설계 되었습니다 2 m m 및 첫 번째 전극 위치. 메쉬 전자 ( 그림 3A에서맨 왼쪽 가장자리)의 시작 가장자리에서 0.5 m m. 이러한 이유로, 시작 위치는 깊은 관심의 두뇌 지역 보다 0.5 m m 되도록 stereotaxic 좌표를 선택 합니다. 확산 및 메쉬 전자 내 기록 전극의 위치 마스크 디자인 과정에서 자유롭게 선택할 수 있습니다 하 고 그래서 그들은 그들의 stereotaxic 따라 주입으로 기록 전극 관심의 두뇌 지구에 걸쳐 선정 한다 궤적입니다.
8. 카메라 (그림 6B) 유리 바늘 내 메쉬 전자 프로브 상단의 표시를 배치 합니다. 일부 소프트웨어를 사용 하면 메시 전자의 원래 위치를 표시 하는 화면에 선을 그릴 수 있습니다.
9. 주사기 펌프는 낮은 속도를 설정 하 고 시작을 누르면 여는 흐름을 시작 합니다. 10 mL/h 400 µ m 내부 직경 모 세관 바늘에 대 한 일반적인 시작 흐름 속도입니다. 메쉬 전자 프로브 바늘에 내에서 이동 하지 않으면 천천히 흐름 속도를 높입니다.
   참고:이 주사 사이트 주변 조직에 손상을 수 뇌에 주입 하는 액체의 볼륨을 최소화 하기 위해 중요 하다. 최상의 결과 얻을 수 있습니다 사출 볼륨 미만 25 µ L의 주입된 메쉬 길이 1 mm 당. 이상적인 값은 절반이 볼륨; 우리의 실험실에서 우리는 일반적으로 10-50 µ L 4mm 주입 메쉬 길이 당 주사.
10. 메쉬 전자 프로브 바늘 내 이동 시작, stereotaxic 프레임을 사용 하 여 철회는 메쉬 전자 프로브는 주입 되 고, 가이드로 메쉬 전자의 표시 된 원래 위치를 사용 하 여 동일한 비율로 바늘.
    참고: 시야 (FoV) 주입 방법²⁵, 불린다이 절차 crumpling 나 탈 구 없이 하는 타겟된 두뇌 지역에 메쉬 전자의 정확한 배달에 대 한 수 있습니다. 종종 메쉬 전자 프로브 바늘에 내에서 이동 시작 되 면 흐름 속도 줄일 수 있습니다. 우리의 실험실에서 20-30 mL/h의 유량 종종 메쉬 및 모 세관 바늘 벽 사이의 정적 마찰을 극복 하는 데 필요한 있지만 속도 수 있습니다 다음 줄어들 10 mL/h 주입 과정이 시작 되 면. 흐름 속도 주입 볼륨 작은 직경 모 세관 바늘에 대 한 일반적으로 작은 수 있습니다.
11. 계속 흐르는 식 염 수 및 바늘 두개골 종료 때까지 바늘을 축소 합니다. 주사기 펌프에서 흐름을 중지 합니다.

4. 입/출력 인터페이스

참고:이 시점에서, 메쉬 전자 프로브는 되었습니다 주입 선택한 궤적을 따라 뇌 내에서 원하는 시작 지점에서. 바늘 철회 되 고는 바로 위에 전자 인터커넥트 메쉬 craniotomy 스패닝 두뇌에서 바늘을 I/O (그림 7B) 바늘 안에 아직도 패드. 이 섹션에서는 사용 하 여 인쇄 회로 기판 (PCB; 그림 7, 그림 8) 메쉬 전자 프로브를 인터페이스를. PCB 신경 기록 실험 머리 단 되는 절연 기판 통해 32 채널 표준 앰프 커넥터에 ZIF 커넥터를 연결 합니다. PCB는 다양 한 머리 무대 구성에 맞게 customizable 이다. 우리의 디자인 파일 요청에 의해 또는 리소스 웹사이트, meshelectronics.org, 그리고 수에서 사용할 수 있는 Pcb를 PCB 제조 및 어셈블리 서비스의 공급 업체에서 저렴 하 게 구입 하는 데 사용할.

1. Stereotaxic 프레임을 사용 하 여 신중 하 게 바늘 FFC 기판 클램핑에 안내 하 고, 격차에 걸쳐 메쉬 전자에 여유를 생성 하기 위해 주사기 펌프 솔루션을 흐르는 (그림 ℃)을 상호 연결.
2. 일단 바늘은 클램핑 기판 위 간격에 걸쳐, 메쉬 전자 클램핑 기판 (그림 7D)에 I/O 패드를 꺼낼 빠른 속도로 흐름을 다시 시작 합니다.
3. Using 족집게와 디의 피 펫, I/O 패드 가능한 첫 번째 I/O 패드 가까운 ca. 90 ° 각으로 구 부.
   참고: 굽 힘은 후속 단계에서 기판에 ZIF 커넥터에 삽입 하려면 패드를 허용 해야 합니다. ZIF 커넥터 메쉬 전자 프로브의 32 I/O 패드는 불완전 한 90 ° 굴곡, 또는 하지 발생 하는 첫 번째 I/O 패드 앞 굽이 발생 I/O 패드 ( 그림 7E의 가장 왼쪽 패드)를 차단 하는 데에 정확 하 게 동일한 폭입니다.
4. I/O 패드 정렬 됩니다 일단 펼친, 그리고 드라이 메쉬 줄기에 90 ° 각도로 부드럽게 흐르는 장소에 압축 공기.
   참고: 메쉬 전자 미만 32 채널 프로브 수 수 인터페이싱에 동일한 32 채널 인터페이스 보드와 함께. 예를 들어 우리의 실험실 일반적으로 32 채널 PCBs와 16-채널 메쉬 전자 프로브를 사용 합니다. ZIF 커넥터, 인터페이스는 쉽게 내 여분의 공간을 제공 하는이 고 추가 uncontacted 채널 임피던스 세션을 녹음 하는 동안 테스트를 통해 오픈 회로로 쉽게 식별 됩니다.
5. 직선 가장자리 약 0.5-1 mm에서 I/O 패드의 가장자리에 클램핑 기판 절단. 또한 PCB 실장 32 채널 ZIF 커넥터 (그림 7 층)에 삽입을 방해 죄 기판의 외부 부분을 잘라.
6. 기판에 ZIF 커넥터에 I/O 패드를 삽입 하 고 (그림 7G) 래치를 닫습니다. 채널과 성공적인 확인 접지 나사 사이의 임피던스를 측정 하기 위해 사용 측정 전자 인터페이스. 임피던스 값이 너무 높은, ZIF 커넥터를 분리, 삽입, 조정 하 고 연결 확인 될 때까지 다시 테스트.
7. ZIF 커넥터를 커버 하 고 보호를 위해 치과 시멘트로 노출된 메쉬 전자 인터커넥트. PCB 기판에 간격에 대칭 이동 하 고 마우스 두개골 (그림 7 H)에 시멘트와 PCB를 수정.
   주: 격차에 FFC를 절곡 때로는 전자 상호 연결 망을 벗어날 수 있는 기계적인 긴장을 감소 시킨다.
8. 허용을 강화, 시멘트 견고 하 고 컴팩트한 헤드-무대 기록 세션 (그림 7I) 인터페이스에 대 한 PCB를 선회.

5. 신경 기록 실험

1. tailveiner 또는 다른 restrainer³³에 마우스를 놓습니다. 표준 앰프 커넥터 머리 단계 PCB에 프리 앰프 PCB를 삽입 합니다. 별도 케이블을 사용 하 여 접지 참조 나사.
2. 절제 된 레코딩에 대 한 마우스는 restrainer 둡니다. (그림 8A) 원하는 시간 동안 데이터 수집 시스템을 사용 하 여 데이터를 기록 합니다.
3. 자유롭게 이동 하는 녹음, 프리 앰프 PCB를 삽입 하 고 접지 참조 나사 후는 restrainer에서 마우스를 놓습니다. 시간 마우스 자유롭게 작동 하는 동안 데이터 수집 시스템을 사용 하 여 (그림 8B)의 원하는 길이 대 한 레코드입니다.
4. 기록 세션의 끝에, 마우스 다시 넣어 restrainer, 필요한 경우. 접지 와이어 및 프리 앰프, 제거 다음 그것의 감 금에 다시 마우스를 해제 하 고 녹음 세션 때까지 동물 시설에 반환.

6. 조직학 단면, 얼룩, 및 이미징

1. 원하는 시간 후 주입 될 때까지 기다립니다, 그리고 다음 마우스를 anesthetize 및 transcardially 포름알데히드와 perfuse. 제거, 동결, 그리고 cryosection 10 µ m 두꺼운 조각으로 두뇌. Immunohistochemistry 및 설치류 뇌 조직의 cryosectioning 자세한 프로토콜 Evilsizor에서 찾을 수 있습니다 외. ³⁴.
   참고: 메쉬 전자를 포함 하는 뇌 조직 고정 및 모니터링 전자 안으로 남아 있다 하더라도 일반적으로 구분 될 수 있습니다. 이것은 구분 하기 전에 제거 해야 합니다 및 따라서 수정 하거나 수 있습니다 조직 어렵게 프로브-조직 인터페이스를 분석 하는 기존의 신경 프로브에 비해 독특한 기능 이다.
2. 1 x PBS에 3 번 고정된 뇌 조직 섹션 린스.
3. 0.3% 트라이 톤 X-100 및 5% 염소 혈 청의 1 x PBS에 솔루션에서 섹션을 차단 합니다. 실 온에서 1 시간 동안 앉아 보자.
4. 1 차 항 체의 솔루션 섹션을 품 어. 여기에 사용 되는 기본 항 체 솔루션 토끼 안티-NeuN (1: 200 희석), 마우스 방지 Neurofilament (1:400 희석), 및 쥐 안티-GFAP (1: 500 희석) 0.3% 트라이 톤 X-100 3% 염소 혈 청을 했다. 4 ° c.에서 밤새 품 어
5. 1 x PBS 가진 40 분의 총에 대 한 9 번 섹션 린스.
6. 이차 항 체의 솔루션 뇌 섹션을 품 어. 여기에 사용 되는 이차 항 체 솔루션 되었고 알 렉 사 Fluor 488 염소 안티 토끼 (1: 200 희석), 알 렉 사 Fluor 568 염소 반대로 마우스 (1: 200 희석), 알 렉 사 Fluor 647 염소 반대로 쥐 (희석 1: 200). 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 품 어.
7. 1 x PBS와 함께 30 분의 총에 대 한 9 번 섹션 린스.
8. Coverslips antifade mountant 사용으로 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 이미징 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 어둠 속에서 슬라이드를 둡니다.
9. Confocal 현미경 488를 사용 하 여 슬라이드 이미지, 561 nm, 그리고 알 렉 사 Fluor 488 위한 여기 소스로 633 nm 레이저, 알 렉 사 Fluor 568, 및 알 렉 사 Fluor 647, 각각. 메쉬 전자 이미지를 차동 간섭 콘트라스트 (DIC)을 사용 하 여 이미지 및 분석의 후속 오버레이 대 한 동일한 현미경에.

결과

결과 연구 대상된 뇌 영역, 주입 이후 경과 시간, 주입, 그리고 I/O 인터페이스 절차, 다른 요인 중에서 성공 하는 동안 급성 피해 금액에 동물 종에 따라 달라 집니다. 단일 단위 급격히 활동 1 주 후 주입 및 스파이크 진폭 최대 4-6 주 동안 다를 수 있습니다 (150 µ m 내부 직경 바늘)의 경우 1 일 때까지 표시 되지 않을 수 있습니다. 그림 9 는 해 마와 성인 남성 C57BL/6J 마우스의 기본 somatosensory 피 질에 주입 하는 32-채널 메쉬 전자 프로브에서 대표적인 electrophysiological 데이터를 보여줍니다. 약 300 µ V 진폭 로컬 필드 전위 (LFPs) 모든 32 채널에 기록 되었다 고 단일 단위 급격히 활동 26 채널에 기록 했다. LFPs 및 격리 된 스파이크 사이 2, 4 개월,이 확장 된 시간 동안 녹음 전자와 뉴런 간의 매우 안정적인 인터페이스 제안 유사한 남아 있었다. 그림 10 조직학 단면 대표 결과 뇌 조직의 메쉬 전자 주입 후 1 년을 포함 하는 immunostaining를 보여 줍니다. 얼룩 NeuN, 신경 somata, neurofilament, 신경 축 삭에 대 한 표식에 대 한 표식에 대 한 암시 하는 메쉬 전자와 뇌 조직 간의 원활한 인터페이스 주사 사이트에서 조직 밀도의 손실을 거의 보여준다. GFAP (이다에 대 한 표식)에 대 한 추가 얼룩 입지 약간 만성 면역 응답을 elicits 나타내는 메쉬 전자 주위 이다의 근처-배경 수준을 보여준다.

그림 1: 주 사용 주사기의에서 단계 메쉬 전자 실험. 이 프로토콜 메쉬 전자를 사용 하 여 일반적인 설치류 신경 기록 실험의 모든 주요 단계를 설명 합니다. 실험 보통 수반, 구현, 메쉬 전자 제품의 제조 (1), (2) 모 세관 바늘에 메쉬 전자 로드의 순서에서 (3) stereotaxic 주입 메쉬 전자 두뇌, 메쉬를 인터페이스 (4) 전기 I/O 전자, (5) 구속 또는 자유롭게 이동 녹음, 그리고 (6) 메쉬/조직 단면 및 조직학에 대 한 얼룩. 일부 연구에서 조직학 데이터만 수 있습니다 수 원하는, 단계 (4) 및 (5) 어떤 경우에 생략 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 회로도 ultraflexible 장치 지역 (맨 윗줄)에서 플러그 앤 플레이 메쉬 전자 제조 절차를 묘사, 줄기 인터커넥트 (중간 행), 영역과 I/O 영역 (아래쪽 행). (A) 수-8 부정적인 감광 (레드) PL 마스크-1 청 각 플러그 앤 플레이 메쉬 전자 프로브의 레이어 아래 정의를 모방. PL 마스크 2, 열 증발 및 금속 이륙 (B) 패턴 정의 Au 인터커넥트 및 I/O 패드 (금). (C) PL 마스크-3, 전자 빔 증발, 및 금속 이륙 패턴화 Pt 전극 (블루) 정의 합니다. (D) 수-8 부정적인 감광 (레드) PL 마스크-4 최고의 청 레이어를 정의 하 꽃무늬. 수-8에서 구멍 각 Pt 전극 및 I/O 패드에 남아 있습니다. (E) A 완료 점선 박스 상단, 중간, 아래쪽 행에 확대 하는 위치를 나타내는 전자 프로브 메쉬. 포토 마스크 디자인 파일 요청 저자 또는 리소스 사이트에서 사용할 수 있는 meshelectronics.org. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 사진 및 플러그 앤 플레이의 광학 현미경 이미지 망 전자. (A) 플러그 앤 플레이 I/O와 주사기-주 사용 메쉬 전자 프로브의 광학 현미경 이미지를 바둑판식으로 배열. 제작 완료 단계 그림 2 에서 그러나 Ni 코팅 기판에서 릴리스 이전 후 몇 군데는 조사 했다. 점선된 상자 왼쪽에서 오른쪽 ultraflexible 장치, 줄기, 영역과 I/O 영역 각각 C, D, 및 E, 확대의 섹션에 해당 합니다. 눈금 막대 = 1 m m. (B) 20 완료를 포함 하는 3 인치 Si 웨이퍼의 사진 메쉬 전자 프로브. 눈금 막대 = 20 m m. (C) ultraflexible 장치 지역에서 20 µ m 직경 Pt 기록 전극의 광학 현미경 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. (D) 고밀도 Au의 광학 현미경 이미지 줄기 지역에서 상호 연결. 각 Au 상호 전기적으로 절연 이며 단일 I/O 패드에 연결 하는 단일 Pt 전극. 눈금 막대 = 100 µ m. (E) 광학 현미경 이미지 I/O 패드의. 축소 가능한 메쉬 지역 및 줄기에 있는 지속적인 박막 지역 각 패드에 의하여 이루어져 있다. 수-8 리본 비 실시 정렬을 유지 수 있도록 함께 패드의 메쉬 부분을 연결 합니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 주입 중 모 세관 바늘을 들고 대의 조립. 기구의 구성 요소 (A) 사진. 구성 요소 (1) 유리 모 세관 바늘, 피 펫 홀더 (2), (3) 원형 나사 패스너 피펫은 홀더, 및 (4) 피 펫 홀더에 대 한 원뿔 와셔 포함. 항목 (2) (4) 피 펫 소지자의 구입에 포함 되어 있습니다. 화살표는 에폭시와 붙어 있이 필요가 있는 피 펫 소유자의 콘센트를 표시 합니다. (B) 피 펫 홀더 어셈블리 및 유리 모 세관 바늘의 삽입 후의 사진. 추가 에폭시 (화살표로 표시) 피 펫 소유자의 최고 콘센트에서 표시 이며 (표시 되지 않음) 주사기에 피펫으로 홀더를 연결 하는 모 세관 배관. (C) 피 펫 보유자와 직각 끝 클램프와 stereotaxic 프레임에 부착 후 모 세관 바늘의 사진. 스케일 바는 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 유리 바늘에 메쉬 전자 로드. (A) 플러그 앤 플레이 메쉬 전자 선적 절차의 개요 그림. 솔루션에서 정지 하는 동안 유리 바늘 메쉬 전자 프로브의 I/O 끝 가까이 배치 됩니다. 다음 주사기 플런저 메쉬 전자 프로브를 수동으로 제거 됩니다. 이상적인 위치는 바늘의 끝 안쪽 ultraflexible 장치 지역 이다. (B) 사진 (a) 해당 유리 바늘에 메쉬 전자 프로브. 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: stereotaxic 수술 역의 도식. 연결 된 피 펫 소유자와 동력된 stereotaxic 프레임 (A)는 원하는 두뇌 지역에 바늘을 위치 하는 데 사용 됩니다. 바늘과 로드 메쉬 전자의 위치 목표 렌즈 모니터링 카메라 (B)를 연결 하 고 컴퓨터 (C)에 표시 됩니다. 주사기 펌프 (D) 원하는 두뇌 지역에 메쉬 전자의 정확 하 고, 제어 주입 수 바늘을 통해 식 염 수의 정확한 볼륨을 흐른다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7: 플러그 앤 플레이 I/O 인터페이스 절차. (A)는 FFC 기판 클램핑 치과 시멘트는 craniotomy에 인접 한 확보. (B) 플러그 앤 플레이 메쉬 전자는 stereotaxically FoV 메서드를 사용 하 여 원하는 뇌 영역에 주입. (C)는 메시의 I/O 패드와 바늘 전자 여전히 내부 조사, FFC 기판 클램핑에 위치. (D) 흐름 FFC 기판 클램핑에 I/O 패드를 꺼낼 바늘을 통해 재개 됩니다. (E) I/O 패드는 줄기, 전도 면 펼쳐 졌 하 고 장소에서 건조 기준으로 구부러진된 90 °. (F)는 FFC 기판 I/O 패드의 가장자리에서 직선 ca. 0.5 m m가 위로 잘립니다. 초과 기판 절단 떨어져 32 채널 ZIF 커넥터에 삽입을 허용 하도록. (G)는 I/O 패드는 사용자 정의 PCB에 장착 된 32 채널 ZIF 커넥터에 삽입 됩니다. ZIF 커넥터 수 있도록 폐쇄 래치는 I/O 패드와 접촉. (H) 래치 이루어 PCB는 두개골에 대칭 이동 하 고는, 그리고 PCB 치과 시멘트와 장소에 고정 되어. (나)는 PCB 세션을 녹음 하는 동안 쉽게 인터페이스 표준 앰프 커넥터와 함께 소형 headstage를 형성 한다. 스케일 바 = 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 8: 자제하 고 자유롭게 이동 녹음. 기록 세션 동안 restrainer에서 남성 C57BL/6J 마우스의 (A) 사진. 32 개 채널 프리 앰프 PCB 표준 앰프 커넥터에 삽입 되었습니다. (B)는 자유롭게 이동 기록 실험 중 32 채널 프리 앰프 PCB와 같은 마우스의 사진. 스케일 바 = 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 9: 대표 신경 녹음 결과. (A) 대표 LFP 32 개 채널에서 열 지도 메쉬 전자 프로브 마우스 해 마와 피 somatosensory 질에 주입. 데이터는 마우스 자유롭게 2 개월 (위)와 4 개월 (아래) 후 주입에서 그것의 감 금 소를 탐험 하는 동안 기록 되었다. LFP 진폭은 오른쪽에 있는 색상 막대에 따라 색으로 구분. 하이 패스 필터링 된 추적 (블랙) 스파이크 활동을 보여주는 32 개 채널의 각는 스펙트로그램에 중첩 됩니다. (B) 스파이크 (A)에 그릴 데이터를 정렬 한 후 절연. 단일 단위 급격히 활동 32 개 채널 모두 2 개월 후 주입 (위)와 4 개월 후 주입 (아래)의 26에 발견 되었다. 스파이크의 각 클러스터 위에 숫자 (A)에 채널 번호에 해당합니다. 이 그림에서 Fu는, 외. 수정 되었습니다. ²⁸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 10: 대표 조직학 결과. 메쉬 전자 수평 (중간 패널) 내에서 방향을 설명 하는 (A) 회로도 및 화살 (하단 패널) 뇌 조각. (B) 형광 현미경 이미지 10 µ m 두꺼운 피 질 뇌 조각 16-채널 메쉬 전자 probe의 주사 후 1 년의. 조각은 NeuN (녹색)에 대 한 immunostained 되었습니다. (C) 같은 뇌 조각 neurofilament (빨간색)에 대 한 immunostained. (D) 같은 뇌 조각 immunostained GFAP (시안)에 대 한. (E) A 합성 이미지 (B)의 (D)를 통해 보여주는 메시 전자/조직 레이블이 NeuN neurofilament (빨간색), GFAP (녹청), (녹색), 인터페이스 그리고 전자 (파란색)을 메쉬. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림에서 푸 외 수정 되었습니다. ²⁷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 비디오 1: 로드 및 솔루션으로 메쉬 전자의 주입을 반복. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

제조 및 메쉬 제품의 사용에서 모든 단계는 중요 하다, 하지만 몇 가지 특히 중요 하다. 그들의 웨이퍼에서 메쉬 전자를 방출 하기 전에 쉽게 수성 해결책 (단계 1.6.1)에 정지 하는 메시를 만들기 위해 표면 산화에 필수적 이다. 큰 볼륨을 요구 하는 경우이 단계를 생략, 메시 일반적으로 물, 바늘에 로드 하기 어렵게 그들의 표면에 부동 만약 그들이 로드할 수 있습니다, 그들은 종종 유리 바늘의 측면에 충실, (> 100 µ L) 주입을 위해. 릴리스, 그러므로, 일반적으로 의미는 메시를 사용할 수 없습니다 하기 전에 표면 산화를 실패 하 고 제조는 처음부터 다시 수행 해야 합니다. 또 다른 중요 한 단계는 구 부리는 메쉬 전자 "줄기" (단계 4.3) 인터페이스 I/O 동안 ~ 90 °. 각도가 90 ° 보다 작은 경우 다음 모든 32 I/O 패드 맞지 않습니다 ZIF 커넥터; 일부 삽입, 연결 된 전극의 수를 줄일 수 있도록 끝을 잘라 수 있을 것 이다. 프로세스 속보에서 줄기를 방지 하기 위해 부드럽게 또한 수행 합니다.

메쉬 기기 설계는 포토를 수정 하 고 그림 2에 설명 된 동일한 제조 절차를 사용 하 여 다양 한 응용 프로그램에 대 한 사용자 지정할 수 수 있습니다. 예를 들어 그림 9 에 데이터를 기록 하는 데 사용 하는 메쉬 전자 프로브 32 기록 전극을 마우스 해 마 및 기본 somatosensory 피 질 해야 하도록 설계 되었습니다, ultraflexible 메시 내에서 전극 배치 될 수 있습니다. 거의 모든 두뇌 지구를 대상으로 선택 또는 자극에 대 한 더 큰 전극 통합된²⁷일 수 있다. 동일한 기본 메쉬 구조 및 제작 절차를 유지 하지만 전극 배치 및 디자인 연구의 요구에 맞게 조정 됩니다. 그러나 수 사관 주의 한다,, 그리고 항상 테스트 수정된 디자인 의도 바늘을 통해 쉽게 주입 수는. 메쉬 전자의 벤딩 기계에 작은 변화는 injectability에 상당한 효과 가질 수 있습니다. 1 개의 그런 보기는 가로 및 세로 수-8 리본 사이의 45 ° 각도 손 쉽 세 주입 수 메쉬 전자 프로브를 하지만 90 ° 각도 crumples 바늘²¹를 나 막 신을 한 결과입니다.

기록 전극의 임피던스를 측정 하는 것은 문제 해결에 유용 합니다. 20 µ m 직경 원형 Pt 전극 근처 PBS²⁹x 1에서 또는 vivo에서 1 kHz의 주파수에서 1 m ω 임피던스 크기가 있어야 합니다. 이것 보다 훨씬 더 큰 임피던스 전극 노출 되지, 감광 제 잔여물과 오염 된 경우 발생할 수 있습니다 또는 하지 전기적 연결을 의미 합니다. 후자의 경우, 예를 들어 먼지 사진 마스크에 Au에서 분리에 결과 인터커넥트, PL 동안 또는 메쉬 I/O 패드 중 I/O 인터페이스 중 ZIF 커넥터 핀 접촉 하지는 발생할 수 있습니다. 임피던스 크기 절반 예상 값 채널 서로 병렬로 두 전극 임피던스의 회로 만드는 인접 한 누전 될 수 있습니다 제안 합니다. 측정 된 임피던스 값 가이드로 문제 해결; 하는 동안 동작 메쉬 전자 프로브 광학 현미경과 결합, 문제의 원인을 수 있습니다 일반적으로 식별 및 적절 하 게 수정 다음 제조 실행 또는 I/O 인터페이스 시도.

급성 연구 주사기-주 사용 메쉬 전자를 사용 하 여 제한 됩니다 단일 단위 급격히 활동 일반적으로 하지 1 주 포스트 주입²⁷까지 관찰에 비록 최근 작품 (미 발표)이이 문제는 쉽게 극복 하기 보여줍니다. 메쉬는 급상승 활동 보고 하는 데 필요한 시간의 주요 결정 요인 디자인,이 기간 동안 조직 손상의 정도 영향을 미칠 메쉬 전자, 함께 두뇌와 주입, 사용 하는 바늘의 직경에 주입 액체의 볼륨 있는 주입 하 고 치유의 속도입니다. 대형 주입 볼륨 메시 전자 방출 이전에 Ni 현상;에서 산소 플라즈마로 처리 되지 않습니다 경우 필요할 수 있습니다. 메쉬 친수성 인 경우 즉, 그것은 유리 바늘을 준수 수 있습니다. 때때로, 메시 어려울 삽입 하는 기계를 절곡 이어질 결함이 있다. 메쉬 전자 로드 하는 동안 그것은 그 메쉬는 쉽고 원활 하 게 내에서 이동 바늘 ( 보충 비디오 1에서 같이) 확인 하는 것이 중요. 그렇지 않으면, 다른 메쉬 전자 프로브를 사용 해야 합니다. 원활한 신경 인터페이스에 대 한 최상의 결과 주입된 메쉬 길이 4 m m 당 10-50 µ L의 이상적인 주입 볼륨 달성 될 것입니다. 최근 결과 미세한 메쉬 전자 프로브를 주입 또는 주입 (급성 측정) 후 급상승 하는 단일 단위에서 관찰 될 수 있다 작은 직경 모 세관 바늘 (150 µ m 내부 직경, 250 µ m 외부 직경 작은) 표시 통해 더 긴 시간. 마스크 디자인 파일 이러한 미세한 메쉬 구조에 대 한 요청에 의해 또는 리소스 웹 사이트에서 사용할 수 있는 meshelectronics.org. 우리가 우리의 vivo에서 메쉬 주입 절차의 수익률은 150 µ m 내부 직경 (250 µ m 외부 직경 더 최근 작업에 대 한 80-90%에 가까운 약 70%, 수 400 µ m 내부 직경 (650 µ m 외부 직경) 바늘을 사용 하 여 전체 수익률 추정 ) 바늘. 실패에 대 한 가장 일반적인 이유는 (1) 메시 부드럽게, 주사 하지 않는다 두뇌, 필요한 수동 조작 하는 동안 (2) 메쉬 파손에 예기치 않게 큰 주입 볼륨에서 뇌 부 종 인 i/o 인터페이스 절차, 그리고 (3) 주입 하는 동안 손상 된 혈관에서 출혈이. 주입 하는 동안 혈관을 손상 하는 것은 드문 (실패의 10% 미만 원인) 감소 될 수 있는 이미지 유도 수술을 사용 하 여 추가. 우리는 또한 혈관의 손상 transfection 바이러스 성 입자의 주입, 딱딱한 뇌 프로브, 주입 및 메쉬 전자의 주입을 포함 하 여 뇌 조직의 침투를 포함 하는 모든 절차의 일반적인 한계는 참고.

메쉬 전자 프로브 에서처럼 그림 9 와 그림 10, 각각 수 안정적으로에서 기록 추적 같은 개별 뉴런에 적어도 개월 1 년 계획을 하 고 거의 만성 면역 반응을 보여주고 있습니다. 이 대회 깊이 전극, 일반적으로 스파이크 진폭, 불안정 한 신호, 및 만성 염증을 감소 하는 장기 실험^14, 기록의 과정에서 고통에 비해 상당한 우위를 나타냅니다. ¹⁵. 또한, 메쉬 전자 그들은 남아 있을 수 있습니다 조직에서 조직학 단면 중 얼룩, 이미징, 기존의 프로브, 달리는 너무 경직 된 장점 있고 따라서 조직학 전에 제거 해야 합니다 분석입니다. 따라서, 메쉬 전자 immunohistochemical 분석을 사용 하 여 정확 하 게 각 녹음 사이트를 둘러싼 세포 환경 공부를 독특한 능력에 대 한 수 있습니다.

제시 하는 프로토콜 여기 열립니다-최대 신경 과학에서 새로운 기회를 흥미로운. 최소한 침략 적 전달 방법 및 메쉬 전자 뇌 조직으로의 완벽 한 통합 신경 회로 중단을 최소화 고 대부분 만성 신경 기록 실험의 종류 혜택을 수 있는 만성 면역 응답을 피 한다. 기록 하 고 오랜 기간 특히 노화, 같은 달-1 년 동안 프로세스에 연관 밀리초 규모 급격히 활동 하고자 하는 수 사관에 게 관심이 될 것입니다 동일한 단일 뉴런을 추적할 메쉬 전자의 능력은 뇌 질환, 또는 두뇌 개발^16,18의 병 인. 또한, 거기 존재 확장 단계로 PCB 머리-디지털 멀티플렉싱^8,35, 같은 기능을 구현 하도록 활성 전자를 추가 하는 등이 프로토콜을 사용자 지정 하는 상당한 기회 무선 통신^35,,3637, 그리고 신호 처리³⁵, 공동 조직 재생^{18,38에서 원조 하기 위하여 메쉬 전자와 줄기 세포 또는 폴리머 주입 39}, 그리고 통합 나노와이어 field-effect 트랜지스터 (NW-Fet)로 전자를 위한 메쉬 매우 지역화 및 다기능 뇌 프로브^{24,29,40,41 ,42}.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
전동 입체 프레임	World Precision Instruments	MTM-3	마우스 입체 수술용
512채널 녹음 컨트롤러	Intan Technologies	C3004	신경 기록 시스템의 구성
요소 RHD2132 증폭기 보드	Intan Technologies	C3314	신경 기록 시스템의 구성 요소
RHD2000 3피트 초박형 SPI 인터페이스 케이블	Intan Technologies	C3213	신경 기록 시스템의 구성 요소인
Mouse restrainer	Braintree Scientific	TV-150  STD	표준 1.25인치 내경; 제한된 녹음 세션 동안 마우스를 제한하는 데 사용됩니다.
Si 웨이퍼	Nova Electronic Materials		3" P < 100> .001-.005 옴-cm 356-406 μ m 두께 프라임 그레이드 SSP Si 웨이퍼 w/2 Semi-Std. 플랫 & 6,000 에이커° &플러스mn; 양쪽에 5% 습식 열 산화물.
Photomasks (소다 석회 유리에 크롬)	Advance Reproductions		Advance Reproductions 및 기타 공급 업체는 제공된 디자인 파일로 포토 마스크를 제조합니다. 당사의 포토마스크 디자인 파일은 요청 또는 리소스 웹 사이트 meshelectronics.org 에서 구할 수 있습니다. 또는 일부 대학 클린룸에는 현장에서 포토마스크를 만들기 위한 마스크 라이터가 있습니다.
AutoCAD 소프트웨어	Autodesk Inc.		포토마스크 그리기를 위한 디자인 소프트웨어. 무료 대안은 LayoutEditor입니다. 당사의 포토마스크 디자인 파일은 요청 또는 리소스 웹 사이트 meshelectronics.org 에서 구할 수 있습니다.
열 증발기	Sharon Vacuum		제조 중에 Ni, Cr 및 Au를 메쉬 전자 장치에 증발시키는 데 사용됩니다. 많은 대학 클린 룸에는이 도구 또는 유사한 도구가 있습니다.
SU-8 2000.5 네거티브 포토레지스트	MicroChem Corp.		네거티브 포토레지스트는 메쉬 전자 장치의 하단 및 상단 부동태화 층을 정의하는 데 사용됩니다.
MA6 마스크 정렬기	Karl Suss Microtec AG		각 포토 마스크를 웨이퍼의 패턴에 정렬하고 웨이퍼를 자외선에 노출시키는 데 사용됩니다. 대부분의 대학 클린룸에는 이 도구 또는 이와 유사한 도구가 있습니다.
SU-8 개발사	MicroChem Corp.		자외선에 노출된 후 SU-8 네거티브 포토레지스트를 현상하는 데 사용됩니다.
LOR3A 리프트 오프 레지	MicroChem Corp.		금속 리프트 오프 공정 중 언더컷을 촉진하기 위해 Shipley 1805 포토레지스트와 함께 사용
Shipley 1805 포지티브 포토레지스트	Microposit, The Dow Chemical Company		메시 전자 장치에서 금속 인터커넥트 및 Pt 전극을 정의하는 데 사용되는 포지티브 포토레지스트
MF-CD-26 포지티브 포토레지스트 개발자	Microposit, The Dow Chemical Company		S1805 포지티브 포토레지스트는 마스크 얼라이너에 노출된 후 현상합니다. 많은 대학 클린 룸에서이 화학 물질을 보유하고 있습니다.
스핀 코팅기	Reynolds Tech		포지티브 및 네거티브 레지스트가 있는 웨이퍼를 코팅합니다. 대부분의 대학 클린 룸에는 스핀 코터가 있습니다.
PJ 플라즈마 표면처리 시스템	AST Products, Inc.		수용액으로 방출되기 전에 메쉬 전자 장치의 표면을 산화시키는 데 사용됩니다. 대부분의 대학 클린룸에는 이 도구 또는 이와 유사한 도구가 있습니다.
전자빔 증발기	Denton Vacuum		메쉬 전자 장치를 제조하는 동안 Cr 및 Pt를 증발시킵니다. 많은 대학 클린 룸에는이 도구 또는 유사한 도구가 있습니다.
리무버 PG	MicroChem Corp.		LOR3A 및 Shipley S1805 레지스트를 용해하는 데 사용
염화 제 2 철 용액	MG 화학 물질	415-1L	Ni 에칭 용액
36 % 염산 용액	Kanto Corp.		Ni 에칭 용액의 구성 요소
: 유리 모세관 바늘	Drummond Scientific Co.		내경 0.40mm, 외경 0.65mm. 다른 직경을 사용할 수 있습니다.
마이크로피펫 홀더 U-type	Molecular Devices, LLC	1-HL-U	입체택시 주입 중 유리 모세관 바늘을 고정하는 데 사용
1 mL 주사기	NORM-JECT®, Henke Sass Wolf		모세관 바늘에 메쉬 전자 장치를 수동으로 로드하는 데 사용
폴리에틸렌 intrademic 카테터 튜브	Becton Dickinson and Company		내경 1.19 mm, 외경 1.70 mm
5 mL 주사기	Becton Dickinson and Company		생체 내 메쉬 전자 장치 주입용 주사기 펌프에 사용
접안 렌즈 카메라	Thorlabs Inc.	DCC1240C	주입 중 모세관 바늘 내의 메쉬 전자 장치를 보는 데 사용됨
USB 카메라용 ThorCam uc480 이미지 수집 소프트웨어	Thorlabs, Inc.		주입 중 모세관 바늘 내의 메쉬 전자 장치를 보는 데 사용
주사기 펌프	Harvard	Apparatus PHD 2000	메쉬 전자 장치 주입 중 모세관 바늘을 통해 정확한 양의 용액을 흐르는 데 사용
EXL-M40 치과 드릴	Osada	3144-830	개두
0.9mm 드릴 버	Fine Science Tools	19007-09	개두술 드릴링 용
핫 비드 살균기 14cm	Fine Science Tools	18000-50	수술 기구
CM1950 동결 절제 기구	Leica Microsystems		냉동 조직을 절편으로 자르는 데 사용됩니다. 많은 대학에는 공유 시설에서 사용할 수 있는 이 도구 또는 유사한 도구가 있습니다.
0.3% Triton x-100	Life Technologies		조직학에 사용
5% 염소 혈청	Life Technologies		조직학에 사용
3% 염소 혈청	Life Technologies		조직학에 사용
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab177487	조직학에 사용
마우스 항신경필라멘트	Abcam	ab8135	조직학에 사용
쥐 anti-GFAP	Thermo Fisher Scientific Inc.	PA516291	조직학에 사용
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific Inc.	P36930	조직학에 사용되는
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich Corp.	P6407-5MG	분자량 = 70-150 kDA
직각 엔드 클램프	Thorlabs Inc.	RA180/M	피펫 홀더를 입체식 프레임에 부착하는 데 사용됩니다
인쇄 회로 기판(PCB)	고급 회로		메쉬 전자 장치와 Intan 기록 시스템과 같은 주변 측정 전자 장치 사이를 연결하는 데 사용됩니다. Advanced Circuits 및 기타 공급업체는 제공된 설계 파일을 기반으로 PCB를 제조 및 조립합니다. 당사의 PCB 설계 파일은 요청 시 또는 리소스 사이트 meshelectronics.org
32채널 표준 증폭기 커넥터	Omnetics Connector Corp.	A79024-001	PCB에 조립된 구성 요소
32채널 플랫 플렉시블 케이블(FFC)	Molex, LLC	152660339	전자 I/O 패드에 인터페이스할 때 클램핑 기판으로 사용됩니다
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