세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.
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방법 논문
SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포 노화는 건강한 수명에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 노화의 특징 중 하나입니다. 세포 배양에서 특히 노화 세포를 죽일 수있는 약물, senolytics라고, 생체 내에서 노화 세포 부담을 감소시키고 건강을 연장 할 수 있습니다. Senolytics의 여러 클래스는 현재까지 HSP90 억제제를 포함 하 여 확인 되었습니다., Bcl-2 가족 억제제, piperlongumine, FOXO4 억제 펩 티 드와 다 사 티 닙/케르세틴의 조합. 증가된 리소좀 pH에서 SA-β-Gal의 검출은 노화 세포의 검출을 위한 최고의 특징 마커 중 하나이다. 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 활성의 살아있는 세포 측정은 호흐트트 염료를 인터컬레이팅하는 DNA를 이용하여 총 세포 수의 측정과 조합하여 형광 기질 C12FDG를 이용한 가능성을 열어준다. 노화 세포 (senolytics)를 죽이거나 SA-β-Gal 및 노화 세포의 다른 표현형을 억제하여 전반적인 SA-β-Gal 활성을 감소시키는 세포 치료 약물에 대한 스크린 (senomorphics). 높은 함량의 형광 이미지 수집 및 분석 플랫폼을 사용하면 SA-β-Gal, 세포 형태 및 세포 수에 미치는 영향에 대한 약물 라이브러리의 신속하고 높은 처리량 스크리닝이 가능합니다.
서론
세포 노화는 레너드 헤이플릭과 폴 무어헤드에 의해 처음으로 기술되었으며, 이들은 정상 세포가 배양1에서 증식하는 능력이 제한적이라는 것을 보여주었다. 노화 세포는 영양소의 존재에도 불구하고 증식하지 못하고, 성장 인자 및 접촉 억제의부족, 그러나 신진 대사 활성 남아 2. 이러한 현상은 복제 노쇠로 알려져 있으며 주로 인간 세포 3에서 텔로미어 단축에기인했다. 추가 연구는 세포가 또한 종양 발생 스트레스 (종양 유전자 유도 노쇠, OIS), DNA 손상, 세포 독성 약물, 또는 조사 (스트레스 유도 노쇠, SIS)와 같은 다른 자극에 대한 응답으로 노화를 겪도록 유도 될 수 있음을 보여 주었다4 , 5개 , 6. 텔로미어 침식을 포함한 DNA 손상에 반응하여 세포는 노화를 시작하거나 통제되지 않은 세포 성장을 시작하거나 손상을 복구 할 수없는 경우 세포 사멸을 겪습니다. 이 경우, 세포 노화는 종양 억제 방식으로 작용하므로 유익한 것으로보인다 2. 대조적으로....
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프로토콜
동물 사용은 스크립스 플로리다 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. 노화 뮤린 배아 섬유 아세포 (MEF)의 생성 – 12-15 일
- 앞서33일설명한 바와 같이 배아일 13일(E13)에서 임신한 암컷 마우스로부터 야생형 및 Ercc1--MEFs를 분리한다.
참고 : 모든 다음 단계는 무균 조건하에서 멸균 기구를 사용하여 조직 배양 후드에서 수행됩니다. - 눈 위에 배아 머리를 절제.
- 붉은 조직 (심장과 간)을 제거하고 필요한 경우 지질 형질 티핑에 사용하십시오.
- Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체 (DMEM)와 햄의 F10의 1:1 혼합물의 500 mL를 10 % 태아 소 혈청, 1 x 비필수 아미노산, 페니실린 및 스트렙 토미신을 성장 매체로 준비하고 각 사용 전에 약 15 분 동안 37 °C까지 따뜻하게하십시오. 4 °C에서 성장 매체를 저장합니다.
- 배아의 나머지 부분을 0.25% 트립신/EDTA로 10분 동안 배양합니다.
- 배아를 1mm 조각으로 잘라 내고 조직을 여러 번 위아래로 피펫합니다.
- 10 cm 직경 세포....
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결과
SA-β-Gal 활성은 복제고갈, 유전자 독성 및 산화 스트레스로부터 다양한 방법으로 노화하도록 유도되는 세포에서 종양유전자 활성화23,25,38에검출될 수 있다. Ercc1-결핍마우스 배아 섬유아세포세포를 이용한 현재 모델에서, 노르목성 성장 조건(20% O2)은 몇 개의 대행을 위해 이들을 경작한 후 세포 노화를 유도하기에 충분하였다. 야생형 MEF는 또한 노화를 겪지만 20% O2에서추가 통로가 필요합니다. 그림 1은 Ercc1-결핍 마우스 배아에서 1 차 MEF 세포의 분리로 시작하여 산화 스트레스에 의한 세포 노화의 유도, 그리고 마지막으로 현미경 데이터의 분석에 이르기까지.......
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토론
SA-β-Gal은 Dimri et al.에 의해 원래 발견된 세포 노화에 대한 잘 정의된 바이오마커입니다. (1995) 노화성 인간 섬유아세포가 증식 세포에 비해 pH 623에서 분석되었을 때 SA-β-Gal의 활성이 증가한다는 것을 보여준다. 한편, SA-β-Gal에 대한 생체외 및 생체내 분석기는 상이한 세포 유형 및 조직25,39,40에대해 확립되었다. 본 프로토콜에 기재된 살아있는 세포에서 SA-β-Gal을 측정하는 형광 기반 단세포 방법은 세포 노화에 영향을 미치는 약물에대한 우수한 1차 스크리닝 도구(17)이다. 그러나, SA-β-Gal은 노화 세포 검출을 위한 가장 편리한 마커 의 한으로 여겨지지만, 세포 주기 조절기 p16Ink4A
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 NIH 그랜트 AG043376에 의해 지원되었다 (프로젝트 2 및 코어 A, PDR; 프로젝트 1 및 코어 B, LJN) 및 AG056278 (프로젝트 3 및 코어 A, PDR, 프로젝트 2, LJN) 및 글렌 재단 (LJN)의 보조금.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | 코닝 | 10-013-CV | 중간 |
| 햄스 F10 | Gibco | 12390-035 | 중간 |
| 태아 소 세럼 | 조직 배양 생물학적 제제 | 101 | 세럼 |
| 1x 비필수 아미노산 | 코닝 | 25-025-Cl | 아미노산 |
| 바필로마이신 A1 | Sigma | B1793 | 리소좀 억제제 |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal 기질 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA 삽입제 |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 억제제 |
| InCell6000 세포 이미징 시스템 | GE 헬스케어 | 고함량 이미징 시스템 |
참고문헌
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology....
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재인쇄 및 허가
