Vi tillhandahåller ett protokoll för in vitro självorganisering analyser av sinne och min på en stöds lipid lipidens i en öppen kammare. Dessutom beskrivs hur man bifoga analysen i lipid-klädda PDMS microcompartments att efterlikna i vivo villkor av reaktion inneslutning.
Många aspekter av grundläggande spatiotemporal organisationen av celler är styrda av reaktion-diffusion typ system. In vitro beredning av sådana system möjliggör detaljerade studier av deras underliggande mekanismer som inte skulle vara genomförbar invivo. Här ger vi ett protokoll för in vitro- beredning av MinCDE systemet av Escherichia coli, som placerar celldelning septum i cell mitten. Analysen är utformad för att leverera endast komponenterna som behövs för självorganisering, nämligen ett membran, de två proteinerna sinne och mitt och energi i form av ATP. Vi fabricera därför en öppen reaktionskammaren på ett täckglas, som en stöds lipid lipidens bildas. Den öppna konstruktionen av kammaren tillåter optimal förberedelse av den lipid lipidens och kontrollerade manipulation av bulk innehållet. De två proteinerna, sinne och MinE, samt ATP, läggs sedan in i bulk volymen över membranet. Bildbehandling är möjligt genom många optiska microscopies, som design stöder confocal, wide-fältet och Frida mikroskopi likadana. I en variant av protokollet bildas den lipid lipidens på en mönstrad stöd, på cell-formade PDMS mikrostrukturer, i stället för glas. Sänka bulk lösningen på kanten av dessa avdelningar omsluter reaktionen i ett mindre utrymme och ger gränser som gör att härma i vivo oscillerande beteende. Sammantaget beskriver vi protokoll för att rekonstituera MinCDE systemet både med och utan fysisk inneslutning, så att forskare att exakt styra alla aspekter påverkar bildandet av mönster, såsom koncentrationsintervall och tillägg av andra faktorer eller proteiner, och att systematiskt öka system komplexitet i en relativt enkla experiment.
Spatiotemporal mönster är viktiga i naturen, reglera komplexa uppgifter både på flercelliga och cellulär nivå, från morfogenes till reglerade celldelning1,2. Reaktion-diffusion system spelar en viktig roll i upprättandet av dessa mönster, men är fortfarande inte förstått. Ett utmärkt exempel på en reaktion-diffusion system och bäst kännetecknas biologiska system är hittills Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svänger från cell pole till cell pole i E. coli att avgöra mitten av cellen som den framtida avdelning platsen. Detta system bygger på ATPas sinnet, den ATPas aktiverande protein MinE, och membranet som en fysisk reaktion matris8. MinC är inte del av mekanismen för bildandet av mönster, men är den faktiska funktionella agenten: en hämmare av proteinet huvudsakliga divisome FtsZ5,6. MinC binder till sinne och därför följer svängningarna, vilket resulterar i en tid-genomsnitt protein koncentration gradient som är maximal vid cell polerna och minimal cell på mitten, endast tillåta FtsZ att polymerisera vid midcell9,10 . Systemets MinCDE är en del av den större familjen Walker A ATPases som är nyckeln till spatiotemporal organisationen i bakterier2, för positionering och transport protein komplex11 och plasmider12 och för att reglera cellen Division13 och kromosom segregation14. Därför MinCDE reaktion-diffusion systemet inte bara representerar en arketypisk reaktion-diffusion system, men har också uppmärksammats på grund av dess relevans för spatiotemporal organisationen i bakterier.
Detaljerade funktionella studier av det MinCDE systemet i vivo är komplicerade, eftersom manipulation av proteiner och genterapi radering oftast resultera i celldelning defekter. Dessutom det är utmanande att ändra membran sammansättning eller egenskaper i cytosolen i vivo 15,16. Ändringar i systemet och påverkande faktorer är svårt att tolka i komplexa miljön av cellen, ännu mer så om det är störd i en sådan viktig funktion som celldelning. Vi och andra har därför vänt sig till en in vitro beredning-metod, att minska systemet till dess huvudkomponenter: sinne, gruvan, ATP som energikälla, och stöds lipid lipidens som en reaktion matrix6,17, 18. denna bottom-up-strategi tillåter sond mekanismen av självorganisering i detalj utan komplexiteten av en levande cell. Formuläret proteiner resor ytan vågor6 och andra sorters mönster17,19 under dessa förhållanden, om än med en våglängd som handlar oftast om en magnitud större än i vivo. Underlättar exakt kontroll över alla aspekter påverkar mönster bildandet av en öppen kammare: protein koncentrationer6, protein boenden20, membran sammansättning10, buffert sammansättning och ATP koncentrationen 6, samt tillägg av andra faktorer såsom trängsel agenter21 och andra divisome proteiner22. I jämförelse, kan in vitro- beredning av MinCDE systemet i ett flöde cell18,19,23 användas för att undersöka påverkan av flöde17,23, protein begränsande villkor19, membran sammansättning19 och full 3D instängdhet18 på protein mönster, men gör en exakt kontroll av protein komponent koncentration och sekventiell komponent tillägg mycket mer komplicerat.
Använder denna öppna kammare, vi också mönstrad stöd av de planar lipid-lipidmonolager som kan en sond hur geometriska gränser inflytande mönster bildandet21, ett fenomen som har nyligen också varit undersökta i vivo med bakterier gjutna i mikrostrukturer7. Vi har också anställd denna analys att undersöka hur definierade mutationer i min påverkar mönster bildandet av system20. Samma grundläggande assay format har dessutom varit anställd att undersöka hur mönster bildandet kan styras av ljus, att införa en azobenzene-tvärbunden gruvan peptid i analysen och imaging med Frida mikroskopi24.
Vi hittade att bildning för att replikera den MinDE mönstret observerats i vivo i en in vitro- system, fångenskap var nyckeln. Tillåtet att använda stavformade microcompartments, med måtten anpassas till den större våglängd av MinDE i vitro (10 x 30 µm), med en stöds lipid lipidens plätering rekonstitution av MinDE pol-till-pol svängningar och protein gradient bildas 10,25. I denna analys sätts stöds lipid-lipidmonolager på en mönstrad PDMS substrat som innehåller flera hundra repliker av stavformade microcompartments som förblir öppna på toppen. Reaktionen kan ställas in i en öppen kammare av detta, och därefter bufferten sänks till kanten av den microcompartments, därmed begränsar reaktionen till en liten volym. Även om dessa avdelningar har ett luft-buffert gränssnitt på ena sidan och därmed representerar inte en full 3D nedkomsten av membran, härmade protein dynamiken i vivo svängningar10,25. Jämfört med full 3D instängdhet, som visar mycket liknande resultat18, öppna mikrostrukturer analysen är relativt enkel och lätt att hantera och kan även utföras av laboratorier som inte är utrustade med specialiserade mikrofluidik utrustning och renrum faciliteter.
Här presenterar vi ett experimentellt protokoll för beredning av MinCDE mönster bildas på stöds lipid lipidmonolager in vitro- med en öppen kammare som möjliggör kontroll av alla komponenter och enkel tillgång av optisk mikroskopi och, med mindre ändringar, är också anpassningsbar för surface-probe tekniker26. Bredvid planar stöds lipid lipidmonolager, vi visar också hur protein förlossningen kan vara erhållits med enkla mönstrade stöds lipid lipidmonolager på stavformade PDMS mikrostrukturer. Dessa analyser, kan även om optimerad för MinCDE-systemet, även överföras till andra protein system som samverkar på ett liknande sätt med membranet, såsom FtsZ27 eller en minimal aktin cortex28.
Vi har beskrivit ett protokoll för in vitro- beredning av MinCDE självorganisering på planar stöds lipid lipidmonolager och i lipid lipidens omfattas 3D-strukturer, i exemplet med stavformade PDMS mikrostrukturer. För att få värdefulla data från dessa analyser, är de viktigaste faktorerna att styra protein och membran kvalitet.
Att säkerställa proteinkvalitet, protein massan bör bekräftas med hjälp av SDS-PAGE och masspektrometri. Dessutom bör det kontrolleras att proteiner är lösliga och inte aggregerade, med hjälp av analytisk gelfiltrering eller dynamisk ljusspridning. Gelfiltrering kan användas för att ta bort eventuella aggregerade bråkdel av proteiner. Noggrann pH-justering och kvalitet extra nukleotider är kritisk, som tillägg av icke-justerade eller delvis försämrad nukleotid till protein bestånd eller självorganiserande analyser är tillräcklig för att undanröja proteinaktiviteten, därför att avskaffa självorganisering.
Bredvid proteinkvalitet, membran kvalitet är mest kritiska och felaktig membran bildas är oftast orsaken för defekta självorganisering och beskärningen av tingsliga ytstrukturer.
När du utför protokollet för första gången, är det bra att märka stöds lipid-lipidmonolager av inklusive märkt lipider som Atto-655-knark eller DiI låg molar procentsatser (0,05%). Därmed kan de egenskaper och kvalitet av membranet bedömas direkt. Använda FRAP, kan rörligheten på membranet bedömas. Dessutom kan en direkt bedöma kvaliteten på tvättning av SLB, som det kommer antingen vara alltför många blåsor, ingen flytande membran eller inget membran alls, om det har tvättats. Den öppna avdelning metoden tillåter att noggrant tvätta membranet, och därmed också ta bort blåsor som håller fast på ytan av SLB. De mest avgörande faktorerna för att få vätska och homogen stöds lipid lipidmonolager är rengöring och hydrophilicitet stödytan och rätt storlek och enhetligheten i de SUVs. kan det vara bra att kontrollera SUV storlek och storlek distribution med dynamiska ljusspridning. För smala storlek distributioner rekommenderar vi strängpressning blåsor i stället för att sonicating dem. Andra metoder för rengöring coverslips, exempelvis behandlingar med starka baser, grundläggande tvättmedel eller använda coverslips direkt efter sköljning med vatten, kan ge bra resultat, beroende på applikation och lipid blandningen.
Första halvan av det protokoll som presenteras här, in vitro- beredning på planar stöds lipid lipidmonolager i öppna avdelningar, har fördelen av rendering yta tillgänglig för optiska microscopies, såsom Frida mikroskopi30, FRAP analys6, singel-particle tracking34, samt ytan sonden tekniker såsom atomic force microscopy26. Det stora homogena området möjliggör bättre statistik på definierade koncentrationer. Dessutom kan metoden med öppen kammare att exakt styra proteinkoncentration och en snabb och enkel tillägg av ytterligare komponenter, därav tillåter för att titrera proteinkoncentration i en enda kammare20. Analysen kan också utökas genom tillägg av andra bakteriella divisome komponenter såsom FtsZ22,35, olagligt på den tiden22 eller chimära protein FtsZ-YFP-MTS10,35.
Andra grupper har tagit ett liknande förhållningssätt till beredning av Min system i vitro, men använder en flöde cell i stället för en öppen kammare17,18,19. Flöde-celler har vissa fördelar, särskilt när en sluten 3D-miljö är behövs18, påverkan av flöde17,19,23 eller membran sammansättning23 på MinCDE mönster är undersökt, eller om protein mönster är att observeras under protein begränsning villkor19. Lokal styrning av molekylär koncentrationer är dock svårare. Proteinkomponenter, särskilt sinne, binder starkt till membranet de först möter18,19. Vår erfarenhet uppvisar proteinerna ofta icke-specifik bindning till slangar, vikar, sprutor och andra mikroflödessystem delar. Därför lokala protein koncentrationer skiljer sig från ingående koncentrationer18 och varierar också över längden av cellen flöde, vilket resulterar i en mängd olika protein mönster på membranet mellan inlopp och utlopp, som observerades av andra19.
Den andra hälften av protokollet presenteras här, in vitro- beredning i stavformade mikrostrukturer återanvändning av metoden Öppna avdelningen på en mönstrad stöd omfattas av lipid lipidmonolager möjliggör en enkel härma i vivo protein beteende även om exakt kontroll över protein koncentrationer är förlorad på grund av buffert borttagning. Observera att eftersom våglängden av MinDE är ungefär en storleksordning större in vitro- än i vivo de stavformade microcompartments är också om en storleksordning större (10 x 30 µm) än en stavformad E. coli cell.
Sammantaget gör detta protokoll för exakt kontroll av alla villkor inklusive proteinkoncentration, buffert sammansättning och membran egenskaper. Användningen av 3D strukturerat stöd ger reaktionen att studeras under fysisk inneslutning, härma i vivo beteende utan behov av komplexa mikrofluidik utrustning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Michael Heymann och Frank Siedler för produktion av kisel wafers, Core Facility MPI-B för stöd i protein rening och Simon Kretschmer och Leon Harrington för synpunkter på manuskriptet.
Reagents | |||
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
DOPG | Avanti Polar Lipids | 840475 | |
E.coli polar lipid extract | Avanti Polar Lipids | 100600 | |
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate | Roche | ||
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285-1G | |
Sodium chloride | VWR | 27810.295 | |
Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
Tris-base | Sigma Aldrich | T1503-1kg | |
Hydrochloric acid | Roth | 9277.1 | |
TCEP-HCl | Termo Fisher Scientific | 20491 | |
Ethylene Diamine Tetraacetate | Merck Millipore | 1.08418.1000 | |
Sulfuric Acid 98% | Applichem | 173163.1611 | |
Hydrogen Peroxide 50% | Applichem | 147064.1211 | |
HEPES | Biomol | 05288.1 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 102950 | Uvasol |
Glycerol 86% | Roth | 4043.1 | |
TB medium | |||
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roth | 2316.x | |
Atto-655-DOPE | Atto Tec | AD 655-161 | |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
PDMS base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
PDMS crosslinker | Dow Corning Corporation | ||
Materials | |||
UV Glue | Norland Products | 6801 | #68 and #63 both work well |
Coverslips #1.5 24×24 mm | Menzel Gläser | ||
Coverslips #1 24×24 mm | Menzel Gläser | used only for PDMS microstructures | |
0.5 ml reaction tube | Eppendorf | 0030123301 | |
culture flask 2L | Corning | e.g. 734-1905 | |
His-Trap HP | GE Healthcare Life Sciences | ||
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG | GE Healthcare Life Sciences | ||
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column | Biorad | 7322010 | |
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 – 0.5 mL or 0.5-3 mL | Termo Fisher Scientific | 66333 or 66330 | |
razor blade | |||
Instruments | |||
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems | Merck | ||
automated protein purification system: Äkta Pure | GE Healthcare Life Sciences | ||
bath sonicator | Branson | e.g. Model 1510 | |
ARE-250 mixer | Thinky Corporation | ||
Plasma cleaner Zepto | Diener electronic | use oxygen as process gas | |
positive displacement pipettes | Brand | Transferpettor models with glass tips | |
LSM780 confocal laser scanning microscope | Zeiss | Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective | |
Plasmids | |||
pET28a-His-MinD_MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield | |
pET28a-His-MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinE | |
pET28a-His-EGFP-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-EGFP-MinD | |
pET28a-His-mRuby3-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-mRuby3-MinD | |
pET28a-His- MinC | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinC |