상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

요약

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

초록

그것의 높은 해상도 때문에 전자 현미경 (EM) virologists 위한 필수적인 도구입니다. 그러나, 그들을 통해 바이러스 감염 또는 transfected 세포를 분석할 때 주요 어려움 중 하나는 감염 또는 transfection, 세포 검사를 방해의 낮은 효율. 이 어려움을 극복 하기 위해 가벼운 현미경 검사 법 (LM) 감염 또는 transfected 세포의 부분 모집단을 할당할 먼저 수행할 수 있습니다. 따라서, 바이러스 성 단백질에 융합 형광 성 단백질 (FPs)의 사용을 활용, LM는 여기 "긍정적인 페" 셀의 위치를 기록 하는 FP를 표현 하 고 영숫자 패턴 지원에 성장. 그 후, 셀 더 높은 압력 (HPF) 동결을 통해 EM에 대 한 처리, 대체 (FS) 및 수 지 포함 고정. 초 급속 동결 단계 다음 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 ultrastructural 수준에 분석 될 수 있는 선택된 된 셀의 우수한 막 보존을 보장 합니다. 여기, 단계별 상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 워크플로 제공, 샘플 준비, 이미징 및 상관 관계를 자세히 설명 합니다. 실험 설계는 많은 세포 생물학 질문에 적용할 수 있습니다.

서론

특정 생물 학적 과정의 더 나은 사진을 얻기 위해 두 현미경 modalities 결합의 아이디어는 오히려 오래 된. 따라서, "상호 현미경"을 사용 하 여 바이러스에 대 한 최초의 연구는 두 별도 게시^1,2로 1960 년에 출판 되었다. 그 연구에서 저자 두 현미경 기법에 의하여 adenoviruses에 의해 유도 된 핵의 형태에 변화를 분석 했다. 첫 번째 게시에서 아 데 노 바이러스 감염과 관련 된 형태학 세부 묘사 전자 현미경 (EM) 관찰 했다 보고¹. 두 번째 발행물에서 그들에 의해 관찰 하는 다른 구조 이전 EM²에 의해 관찰 하는 구조의 성격을 정의 조직화 학적인 얼룩 패턴의 가벼운 현미경 검사 법 (LM) 이미지와 상관 했다.

그러나 이러한 초기 연구에서 그들의 관측 수행 했다 독립적인 실험으로 준비 하는 다른 감염된 세포를 사용 하 여. "상관 관계", 실제로, 태어난 두 이미징 형식에서 오는 정보의 조합으로 현상을 이해 하는 특정, 특정된 생물을 이해 하기 위해 다른 분석 실험으로 얻은 모든 결과 비교 프로세스입니다.

용어는 상호 현미경 검사 법, 일컬어 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인), 공통점 (참조^3,,45검토), 방법의 증가 수에 적용 요즘, 그 두 영상 기법 (LM 및 EM) 매우 동일한 샘플에 수행 됩니다. 두 방법의 조합, 그로 인하여, 그 샘플³의 다중 모드, 다중 스케일 및 다차원 분석에서 결과. 이점은은 단백질 또는 다른 유형의 세포 인구 내의 관심사의 단백질을 표현 하는 세포 모집단의 식별을 가능 하 게 되는 많은 다른 세포의 광범위 한 개요 LM에 제공할 수 있다. 그들 특정 세포내 이벤트의 더 높은 해상도 이미지를 제공 하는 LM의 해상도 한계 극복. 또한, EM 사용 함으로써 모든 바인딩된 막 세포, 큰 고분자 복합물 (예를 들어, 리보솜, centrioles, 등) 및 cytoskeletal 요소를 포함 하 여 비 형광 subcellular 맥락의 시각화 소위 "공간 참조"⁶, 추가 공간 정보를 제공 하 고 LM에 의해 검출 하는 형광 자리에 문맥을 주는.

지난 몇 년 동안, 클레 멘 타인 세포 생물학⁵, 뿐만 아니라 (참조⁷검토) virologists 강력한 도구가 되고있다 성공적인 바이러스 전파 하는 복잡 한 바이러스 세포 상호 작용을 이해 하고자. 따라서, 바이러스 세포 막과 그들의 자신의 이득에 세포를 수정 하는 방법을 이해 병원 성 바이러스를 근절 하기 위해 항 바이러스 약품을 개발 하는 것이 필수적입니다.

여기, 클레 멘 타인 메서드 (FP) 형광 단백질을 융합 하는 바이러스 성 단백질을 표현 하는 셀의 LM에 의해 감지 수 설명 되어 있습니다. 이 세포는 이후 cryo 움직일 수 및 전송 전자 현미경 (TEM)이이 단백질의 표정 세포내 막 (그림 1)를 재배열 하는 방법으로 새로운 통찰력을 얻을을 통해 ultrastructural 분석에 대 한 추가 준비. 클레 멘 타인 날짜^{8,,910,11,12,13,14에 게시 바이러스학 연구의 대부분에 화학적으로 고정 셀 수행 되었습니다. ,15,,1617,,1819}. 이것은 주로 비활성화 biosafety 수준 2와-3 (BSL-2와 BSL-3) 실험실, 어디 곳을 알아내는-immobilization 셀은 일반적으로 불가능 biosafety 이유로 감염 물질의 필요. 그러나 세포 막의 최적 보존을 요구 하는 그 질문에 대 한 높은 압력 (HPF) 동결 통해 vitrification는,, 좋습니다²⁰. 이 경우 여기에 설명 된 클레 멘 타인 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 흥미롭게도, 감염 표본으로 작업 하는 경우에 특히 HPF 되었습니다 이전 화학적으로 활성화 된 예 BSL-2와 BSL-3 실험실에서 샘플에 수행할 수 있습니다. 화학 고정 이어서 HPF의 조합 cryo 보전 방법^21,22의 장점에서 적어도 부분적으로 이익을 가능성은.

그림 1 :를 통해 세포의 분석에 대 한 워크플로의 도식 표현 클레 멘 타인. 셀 패턴화 된 사파이어 디스크에 먼저 LM EM에 대 한 그들의 처리 전에 FPs를 표현 하는 세포를 지역화 하 여 분석 된다. 일단, 셀 즉시 HPF과 FS 이후에 수 지에 포함 된 수에 의해 고정 됩니다. 수 지, 셀 성장 했다 지원의 중 합 시 (= 사파이어 디스크) 수 지 블록에서 제거 해야 합니다. 포함 된 셀을 포함 하는 블록을 표현 하는 FPs, 나머지 셀은 다이아몬드 칼으로 sectioned 작은 사다리꼴에 잘립니다. Ultrathin 섹션은 슬롯 격자에 수집 하 고 이러한 세포의 ultrastructural 정보를 얻기 위해 가장에 의해 추가 검사. 이 그림은 적응 하 고 허가 기준²⁹수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

1. 세포 배양에 대 한 디스크 패턴화 된 사파이어의 준비

1. 그들의 표면 중 하나에 15 mL 원뿔 원심 분리 관에 새겨져 있는 영숫자 패턴으로 패턴화 된 사파이어 디스크 ( 재료의 표참조)를 전송 합니다.
   참고: 또는, 영숫자 패턴 없이 기존의 0.05 m m 두께 사파이어 디스크 수 사용할 수 있는 참조 패턴 위에 파인더 그리드와 코팅 탄소에 의해 만들어집니다. 이 목표에 그들은 청소 되어야 한다 에탄올과 탄소 패턴 적용 되기 전에.
2. 에탄올과 그들을 철저히 씻으십시오. 필터 종이 페 트리 접시에 그들을 밖으로 확산 하 고 그들이 말리 면. 에 넣어 유리 슬라이드 슬림 긴 핀셋을 사용 하 여 서로 분리.
3. 거꾸로 현미경 (4 배 확대)으로 좌표의 패턴은 모든 사파이어 디스크에서 읽을 수 있는지 여부를 확인 합니다.
   참고:이 경우가 아니라, 핀셋의 도움으로 사파이어 디스크를 플립.
4. 페 트리 접시에 사파이어 디스크를 저장 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

2. 패턴화 된 사파이어 디스크 세포 배양

1. 5 분에 대 한 자외선 (UV) crosslinker와 패턴화 된 사파이어 디스크 소독.
2. 사파이어 디스크 캐비닛 셀 문화 biosafety 가져가 라. 소독 캐비닛 biosafety에 에탄올과 긴 핀셋.
3. 세포 배양 매체의 절반을 추가 ( 재료의 표참조) 셀 문화 접시에. 전송 사파이어 디스크 신중 하 게 긴 핀셋으로 세포 배양 접시에.
4. 씨앗 1 x 10⁵ Huh7 Lunet 세포, T7 중 합 효소의 세포 배양 매체 문화 접시에 나머지 절반에 resuspended를 안정적으로 표현.
   참고: 실험의 끝 지점에서 셀 confluency 이어야 한다 그런 방법으로 시드 되어야 하는 셀의 수를 계산 하지 이상 20-30%. 높은 세포 밀도 EM에 의해 후기에서 셀의 이전을 방해 됩니다. 또한, 이상 confluency 사파이어 디스크에서 세포의 분리 될 수 있습니다.
5. 사파이어 디스크 문화 접시의 하단에 남아와 영숫자 좌표는 여전히 거꾸로 현미경으로 읽을 수 있는 확인 하십시오.
   참고: 경우에 디스크 세포 배양 매체에 플 로트, 하단에는 디스크를 밀어 하 고 결국 올바른 방향으로 다시 그들을 플립 긴 핀셋을 사용 합니다.
6. Transfect 세포 transfection 에이전트의 제조업체 지침에 따라 참조^21,23 이전 보고 다음날.

3. LM 이미징 패턴화 된 사파이어 디스크에 성장 하는 세포의

1. 이미징 금속판 30-50 µ L을 포함 하는 실험의 끝 지점에서 사파이어 디스크 전송 / 일반적인 배경 형광을 줄이기 위해 산도 표시기 무료 매체의 위치.
   참고: 여기에 설명 된 금속 격판덮개 (그림 2) 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL) 워크숍에서 설계 되었습니다. 이 접시 또는 유사한의 부재, 유리 아래쪽 셀 문화 요리 또한 사용할 수 대신 LM에 대 한. 그것은 산도 표시기 없이 매체에 대 한 정상 세포 배양 매체를 변경 하는 것이 중요입니다. Note는 또한 긴 노출 시간 때문에 그들은 photobleaching, 반응성 산소 종 (ROS) 축적 및 셀^24,25의 생리 적 피해를 발생할 수 있습니다 피해 야 한다.
2. 거꾸로 widefield 형광 현미경 세포 이미지.
   참고: 녹색 형광 단백질 (GFP)를 사용 하는 경우-태그 단백질, 각각 대표 결과, 450-490 nm 및 500-550 nm 여기 및 방출 필터와 같이 사용 해야 합니다.
3. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경을 사용 하 여 관심사의 세포 어디 FPs 레코드를 표현 하는 셀 패턴화 된 사파이어 디스크의 좌표를 할당 셀의 낮은 확대 이미지 (10-20 X)를 먼저 취득.
   참고: 관심의 셀/셀의 위치에 대 한 더 나은 개요를 도움이 될 몇 가지 분야를 바느질. 또한 그 단계 대조 현미경 검사 법 사용 될 수 선택적으로 여기 참고.
4. 동일한 셀/셀 더 분별 세포내 공간 내에서 관심사의 단백질의 subcellular 지 방화의 고배율 (형광 및 DIC) 이미지 (63-100 X, 기름 침수 목표)를 취득 합니다.
   참고: DIC 이미지 컨텍스트 정보를 제공합니다. 이 정보는 마지막 상호 관계는 셀의 "해 부" 랜드마크와 더 정확한 때문에 종종 연관 LM 이미지 안에 현미경 나중에 중요 한입니다. 일부 사파이어 디스크 cryo-동원 정지 하는 동안 휴식 수도 있습니다, 그것은 좋습니다 조건 당 triplicates를 준비 하. 또한, 일부 셀에서에서 분리할 디스크 HPF와이 프로토콜의 후속 단계 동안 동안 다른 셀의 열 대권 외 동결 손상 때문에 아티팩트를 포함 될 수 있습니다. 따라서, 디스크의 두 개 이상 영역 끝에 있을 것 이라는 충분 한 세포를 분석할 수 있도록 LM을 통해 몇 군데 한다. 중요 한 것은,이 두 분야는 디스크의 반대편에 있어야 합니다. 이러한 방식으로 셀 포함 된 수 지 블록 2 개 반으로 삭감 될 수 있다 고이 분야의 얻어질 수 있다.

그림 2 :에 셀의 LM 이미징에 대 한 스키마 패턴 사파이어 디스크. (A) 사파이어 디스크 이미징 판에 좋은 족집게의 도움으로 전송 됩니다. (B-C) 이 접시 특별히 설계 되었습니다 EMBL 워크숍 하이델베르크에 가벼운 현미경, pH 지시자 없이 세포 배양 매체와 사파이어 디스크 수 군데 하는 어디에 맞게. 75 m m x 25 m m x 1 m m, 4-5 구멍 사파이어 디스크의 크기에 맞게 3mm 드릴 비트와 함께 그것에 가공 된 금속 슬라이드 그것에 의하여 이루어져 있다. 또한, 작은 홈에 90 ° 각도로 구멍의 양쪽에 가공 된 했다. 이러한 구멍 쉽게 그들을 조작 때 집게로 디스크를 액세스할 수 있습니다. 최적의 이미징 조건 수 있도록 유리 coverslips 번호 0 (0.085 0.13 m m 두께) UV 접착제로 구멍 아래 붙어 있었고 강화 자외선 아래에 배치. 패턴화 된 사파이어 디스크 표면에 새겨져 있으며 영숫자 좌표를 묘사의 (D) 높은 확대 이미지. 패턴화 된 사파이어 디스크는 상용 ( 재료의 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 셀 패턴화 된 사파이어에 성장 하는 곳을 알아내는-Immobilization HPF 통해 디스크

1. HPF에 대 한 "A"와 "B" 알루미늄 사업자 배치 ( 재료의 표참조) 페 트리 접시 필터 종이에서 적셔 1-hexadecene. 젖어 패턴화 된 사파이어 디스크 1-hexadecene로 페 트리 접시에 셀을 포함 하.
   참고: 디스크를 조금 이동를 세포 배양 매체를 씻어.
2. "A"와 "B" 알루미늄 캐리어 HPF 홀더 (그림 3B) 다음과 같이에 사파이어 디스크를 조립 한다. 하단에서 위쪽으로 향하게 평평한 쪽 "B" 캐리어를 놓습니다. 위쪽으로 향하게 하는 셀이 편평한 측에 사파이어 디스크를 놓습니다. 셀을 직면 하 고 그것의 0.1-m m 깊이 가진 "" 운반대를 추가 합니다.
   참고: 패턴화 된 사파이어 디스크 기존 사파이어 디스크 보다 두꺼운 이기 때문에, 상업적으로 사용할 수 있는 "A" 캐리어 (0.05 m m 사파이어 디스크 비 꽃무늬와 함께 사용할 수 있도록 설계) 했다는 EMBL에이 0.2 m m 깊이에서 0.05 m m로 잘라 HPF 홀더(그림 3)에 맞추기 위해 워크숍. 이 목표에 "" 운반대는 0.2 m m 측면 노출 되 고 아래로 절단 하는 동안 여전히 남아 금속 튜브의 끝에 삽입 됩니다. 쪽 아래 컷은 플랫 되도록 다음 모래를 뿌린. 또는, 특별 한 알루미늄 캐리어 패턴화 된 사파이어 디스크 위에 사용할 수 있습니다 (상업적으로 사용 가능한 재료의 표를참조), 사파이어 디스크 및이 캐리어만 구성 되 고이 경우 HPF "샌드위치".
3. HPF 컴퓨터의 소유자를 닫고 셀을 고정 합니다.
   참고:이 프로토콜은 특정 HPF 기계에 대 한 특정. 다른 HPF 기계 또는 사용된^6,26일 수 있었다. 어떤 경우에 공급 업체에서 새로운 세대 컴퓨터의 존재를 알고 이십시오.
   주의: 안전 고글과 청각 보호 헤드폰을 사용 합니다.
4. 임시 저장을 위한 액체 질소로 폴리스 티 렌 상자에 냉동된 "샌드위치"를 배치 합니다.
   주의: 고글을 사용 하 고 액체 질소를 처리 하는 경우 잠재적인 위험에 대 한 정보를 지역 안전 요원에 연락해.
   1. 혼동을 피하기 위해, 각 "샌드위치" 별도 0.5 mL microcentrifuge 튜브에서 (폴리스 티 렌 상자) 안에 숫자로 표시를 배치 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 동결 대체 (FS) 즉시 수행할 수 없는 경우 샘플에에서 저장할 수 있습니다 곳을 알아내는-튜브 (상단에 구멍 뚫은 구멍)와 상자, 극저온 액체 질소에 선반에서 개최 하는 dewar ( 재료의 표참조). 방에 산소 가스 센서, 산소 부족 시 질 식 방지를 하는이 액체 질소 용기 있어야 합니다.
      주의: 모든 절차 (단계 5와 6) 아래에 설명 된 수 실행 한다 biosafety 내각에서. 또한, 사용 시 약의 대부분은 위험한. 그들을 사용 하기 전에 읽고 신중 하 게 소재 안전 데이터 시트는 제조사에서 제공 하 고 안전 하 게 처리 되도록 로컬 규칙에 대 한 안전 요원에 게 필수입니다. 이들 사용된 재료의 정확한 처리를 위해 뿐만 아니라 아래에 설명 된 장비의 적절 한 사용에 대 한, 그것은 또한 지역 연구소의 건강 및 안전 절차를 참조 하는 데 필요한.

그림 3 : 패턴화 된 사파이어의 어셈블리의 스키마 HPF에 대 한 두 명의 알루미늄 사업자 사이의 디스크. (A) 0.2 m m에 0.05 m m. 영숫자 패턴으로 0.16 m m 두께 사파이어 디스크 표면에 에칭 (B) 에서 깊은 측면에 잘려야 하는 전통적인 "A" 캐리어의 컷-멀리 보기 HPF에 대 한 두 명의 알루미늄 사업자로 조립 다음과 같이: 사파이어 디스크 위쪽으로 향하게 하는 세포와 "B" 캐리어의 평면에 배치 됩니다. 다진 셀을 직면 하 고 그것의 0.1-m m 깊이 가진 "A" 캐리어 닫기 "HPF 샌드위치"를 위에 배치 됩니다. 알루미늄 캐리어와 패턴화 된 사파이어 디스크는 상용 ( 재료의 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5입니다. FS Cryo 고정 셀의

1. FS 기계를 작성 ( 재료의 표참조) 액체 질소. -90 ° C에 온도 설정 하 고 컴퓨터는이 온도 도달 될 때까지 기다립니다.
2. 0.2% 오스뮴 tetroxide (OsO₄)를 포함 하는 FS 매체 준비 (v/v), 0.1 %uranyl 아세테이트 (UA) (w/v) 유리 증 류 아세톤 FS 기계 동안에 냉각 됩니다.
   참고: 준비, FS 매체의 (예) 12 mL 작은 유리 용기에 UA의 0.012 g 4% OsO₄의 600 µ L를 혼합. 5 분 추가 11.4 ml를 피펫으로와 유리 증 류 아세톤의 초음파 목욕 장치에이 혼합물을 분해 하 고 잘 섞으십시오.
3. FS 매체의 200-500 µ L microcentrifuge 튜브 1.5 mL를, 뚜껑을 닫고를 FS 컴퓨터에 그들을 전송. 진정 FS 매체에 대 일 분을 기다립니다.
4. 포함 하는 액체 질소 냉각된 긴 핀셋 FS 매체를 포함 하는 튜브를 사용 하 여 셀과 사파이어 디스크 언된 "샌드위치"를 전송 합니다.
   주의: 곳을 알아내는-보호 장갑 및 고글을 사용 합니다.
   참고: HPF "샌드위치" 처리 하는 동안 자연스럽 게 분해 될 수 있습니다. 이 경우에, microcentrifuge 관에 고정 된 사파이어 디스크 전송 됩니다 있는지 확인 합니다. 알루미늄 캐리어 삭제 될 수 있습니다.
5. 다음 날²⁷까지 FS를 다음과 같이 실행 하는 방법:-80 ° C 8 h;-90 ° C에서 -80 ° C ~ 8 h;-50 ° C에서 2 h;-20 ° C-50 ° C에서 2 h 0 ° C에-20 ° C에서.

6. 수 지의 동결 포함 대체 샘플

주의: 아래에서 설명 하는 모든 절차 수 실행 한다 biosafety 내각에서. 또한, 사용 시 약의 대부분은 위험한. 그들을 사용 하기 전에 읽고 신중 하 게 소재 안전 데이터 시트는 제조사에서 제공 하 고 안전 하 게 처리 되도록 로컬 규칙에 대 한 안전 요원에 게 필수입니다. 이들 사용된 재료의 정확한 처리를 위해 뿐만 아니라 아래에 설명 된 장비의 적절 한 사용에 대 한, 그것은 또한 지역 연구소의 건강 및 안전 절차를 참조 하는 데 필요한.

1. FS 기계에서 대체 표본에 밖으로가 고 20 분 동안 얼음에 그들을 배치.
2. 20 분 동안 실 온에서 샘플을 유지 하 고 그들을 철저 하 게 세척 (3 번, 10 분 각) 유리 증 류 아세톤과. 만약 그들이 아직도 microcentrifuge 튜브는 FS 후 긴 핀셋으로 알루미늄 캐리어를 삭제 합니다.
3. 유리 증 류 아세톤, 뒤에 100% 수 지와 야간 보육에 25%, 50% 및 75% 수 지에서 1 h 외피를 사용 하 여 4 단계 에폭시 수 지 시리즈에 (나머지 사파이어 디스크)에 세포를 침투 하 고 1 시간에 대 한 다음 날 100% 수 지를 교환 합니다.
4. 조심 스럽게 흐름을 통해 반지 가득 100% 수 지 시 약 탕에 탑재로 사파이어 디스크를 놓습니다. 이 반지는 10 사파이어 디스크 합 금형으로 사용 됩니다.
   참고: 사파이어 디스크 해야 합니다 수 완전히 밀어 바닥에 읽을 수 있는 방식으로 위쪽으로 향하게 하는 좌표와. 이 연기 추출기에 연결 된 눈의 도움으로 체크 될 수 있습니다. 또는, biosafety 캐비닛 내부 눈 대신 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 숫자 (1-10) 샘플을 식별 하는 데 도움이 시 약의 바닥에 새겨져 있다.  또한, 샘플의 식별 종이 태그 수 지 블록에 포함 될 수 있습니다.
5. 48 h에 대 한 60 ° C에서 오븐에서 샘플 유해

7. 생산 수 지 블록에서 패턴화 된 사파이어 디스크의 제거

1. 오븐에서 세포를 포함 하는 단단한 수 지 블록을 제거 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 만약에 아닙니다, 그들을 절단 하기 전에 실내 온도 아래로 블록 식 지.
2. 수 지 블록에 대 한 액세스를 면도날으로 포함 금형을 잘라. 핀셋을 사용 하 여 원통형 수 지 블록을 제거 합니다.
   참고: 종이 태그는에 포함 되지 않은 경우는 수 지 중 합, 수 영구 표시와 함께 블록 전에 차단 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 그들을 저장. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
3. "버블링" 멈출 때까지 액체 질소를 포함 하는 폴리스 티 렌 상자에서 사파이어 디스크를 포함 하는 수 지 블록의 끝을 담가. 그런 다음, 끓는 H₂o.에 수 지 블록의 끝을 담가
4. 사파이어 디스크 수 지 블록 해제 될 때까지 필요한 만큼 여러 번 앞의 두 단계를 반복 합니다.
   주의: 곳을 알아내는-보호 장갑 및 고글을 사용 합니다.
   참고:이 작동 하지 않는 경우 다시 시도 하기 전에 디스크 주위 polymerized 수 지의 비트를 제거 하는 면도날을 사용 합니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.

8. 타겟 트리밍 가장 위한 Ultrathin 단면

1. 관심사의 세포는 블록 얼굴 한 ultramicrotome의 눈을 검사 하 여 존재 하는 수 지 블록 얼굴에 영역을 식별 합니다.
   참고: 패턴화 된 사파이어 디스크에서 좌표 패턴의 부정적인 인쇄물 블록 얼굴에 그대로 유지 됩니다. 관심사의 세포 타겟된 트리밍에 대 한 위치는 지역 식별 수 있습니다. LM 이미지 블록 얼굴의 동일한 위치에의 발견을 촉진 하기 위하여 수직으로 대칭 이동 될 해야 합니다.
2. 세포를 포함 하는 셀/작은 평면 피라미드에 대 한 관심의 한 사다리꼴의 모양으로 포함 된 셀 단층 트림 (~ 200 µ m × 250 µ m 평균 크기)를 깨끗 한 면도날으로.
3. 35 ° 다이아몬드 칼으로 포함 된 셀의 70 nm ultrathin 섹션을 가져옵니다.
4. 초 정밀 핀셋의 도움으로 EM 슬롯 격자에 섹션을 배치 합니다.
   참고::: 메쉬를 사용 하 여 격자 섹션 그리드 바에 의해 복 면 될 수 있기 때문에 피해 야 한다.
5. 격자 격자 상자에 저장 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

9. 가장 분석 Ultrathin 섹션의

1. 전송 전자 현미경의 소유자에 슬롯 그리드를 놓습니다. 낮은 확대 (개요) 이미지, 관심의 셀의 완전 한 셀 프로 파일은 표시를 획득 합니다.
   참고::: 셀/셀의 찾을 수 있습니다 다시 DIC 조회 LM 전에 인수를 비교 하는 참조로 셀 프로 파일 및 다른 한 셀의 위치를 사용 하 여.
2. 시도 하 고 ultrastructural 수준에서 이전 LM에 의해 관찰 하는 형광 신호에 해당 하는 기능을 찾을 관심의 셀/셀의 고배율 이미지를 취득 합니다.
   참고: 몽타주 이미지는 관심사의 세포/세포의 높은 해상도 대 한 개요를 고배율에서 얻어질 수 있다. 또한, 그것은 종종 형광 이미지를 비교 하기 전에 3d에서 셀을 재구성 수 연속 직렬 섹션에서 동일한 셀의 이미지를 수집 하는 데 필요한.

결과

(그림 1), 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 Huh7 Lunet 셀 패턴화 된 사파이어 디스크에 시드 되었고 이후 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 두 개의 도메인을 표현 하는 플라스 미드와 페 T7 RNA 중 합 효소를 안정적으로 표현 nonstructural 단백질 NS5A, 태그 GFP (pTM_AH-D1-GFP) (그림 4). 다음 날, 패턴화 된 사파이어 디스크, 세포 성장 했다 셀 문화 요리에서 촬영 되었고 LM (그림 4, 그림 2)에 의하여 몇 군데. 아-D1-GFP를 표현 하는 그 세포는 cytosol에서 녹색 형광의 존재에 의해 확인 되었고 사파이어 디스크 (그림 5A, 5B)의 좌표-패턴 내에서 자신의 위치를 저장 하는 기록. 바로 뒤에 그들의 LM 검사, 관심사의 세포를 포함 하는 사파이어 디스크 두 알루미늄 캐리어 (그림 3) 사이 조립 하 고 HPF 여 곳을 알아내는-동원 정지를 받게 했다. 대체 하 고 이후에 에폭시 수 지에 포함 된 셀 고정 후 했다.

생산 수 지 블록에서 사파이어 디스크의 제거에 따라 영숫자 패턴의 인쇄물 관심사의 세포 있었다 지역 검색 허용 블록 얼굴에 표시 했다. 수 지 블록의 나머지는 관심사의 세포를 은닉 하는 작은 사다리꼴 생성 하 멀리 손질 했다. 직렬 ultrathin 섹션이이 사다리꼴에서 얻은, EM 슬롯 격자에 수집 되었고 더욱더 편 (그림 5C)에 의해 분석. 참고는 수동으로 직렬 연속 섹션 가능²⁸ 은 노동 집약적인 및 잘 훈련 되 고 숙련 된 직원이 필요 합니다. 그것은 또한 세포는 낮은 confluency 때이 클레 멘 타인 프로토콜 (그림 5A) 이전 LM으로 식별 하는 같은 셀의 빠른 인식을 보장 하기 위해 중요 한. 그렇지 않으면, 높은 셀 confluency 데 수 있습니다 극적으로 느리게 그들 수준에서 세포의 성공적인 찾기.

TEM 분석의 관심 (그림 5D, 5E) 셀의 여러 ultrathin 섹션, 변수 형태에서 구분의 소포의 큰 축적의의 세포내 공간에 존재 밝혀 아-D1-GFP, 표현에 cytosol는 단일 지질 bilayer (그림 5E)에 의해 둘러싼.

그림 4 : 워크플로 도식 표현에 묘사 된 클레 멘 타인 예제를 수행 하려면 다음 그림 5 . 인코딩 amphipathic 나선 (AH) 및 도메인 1 (D1) HCV NS5A 단백질의 DNA 플라스 미드와 페 했다 안정적 T7 RNA 중 합 효소를 표현 하는 Huh7 Lunet 셀 태그 GFP (pTM_AH-D1-GFP)와 그것의 C-터미널. NS5A 단백질의이 부분의 식 transcriptionally T7 발기인 (T7 오후) 및 translationally 이차 구조에 의해 표시 된 encephalomyocarditis 바이러스 (EMCV) IRES (내부 리보솜 입장 위치) 요소를 제어 합니다. 24 h 후 transfection (24 hpt) 세포 성장 패턴 사파이어 디스크 고 LM에 의해 탐지 되 고 즉시 HPF FS 대상이 아-D1-GFP를 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 클레 멘 타인 절차의 예. (A) Huh7 Lunet 세포 GFP-긍정적인 세포 성장 패턴화 된 사파이어 디스크, 플라스 미드와 transfection 후 24 시간에 pTM_AH-D1-GFP를 할당할 형광 현미경에 의해 분석 T7 중 합 효소를 안정적으로 표현. 클레 멘 타인에 의해 분석할 흰색 점선된 사각형 내에서 선택 된 단일 셀의 (B) 높은 확대 이미지. HPF, FS 및 수 지 포함 후 동일한 셀의 ultrathin 섹션의 (C) 가장 이미지. (D) 직렬 70 nm ultrathin 섹션의 셀을 포함 하는 슬롯 안에 격자에 도식 적인 표현입니다. 왼쪽에 (E) : 가장 관심의 셀의 두 섹션의 개요. 오른쪽: 단일 막 통해 cytosol에서 구분 된 소포의 높은 숫자를 공개 왼쪽에 노란색 사각형에서 선택한 세포내 영역의 고배율 TEM 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

복제 관련 HCV 명료 하 구조, 주로 이중 막 소포 (Dmv)²¹, 전에을 여기에 제시 된 세포 막에는 바이러스 성 단백질 식의 영향을 공부 하는 클레 멘 타인 방법론 성공적으로 사용 되었습니다. ²³이 HCV 유도 구조 형성 하는 데 필요한 중요 한 빌딩 블록을 결정 합니다. HCV의 복제²¹공부 클레 멘 타인을 사용 하 여 우리의 첫 번째 작업에 유의 여기에 설명 된 프로토콜의 약간 수정된 된 버전을 적용 했다. 연구, 영숫자 패턴 없이 기존의 0.05 m m 두께 사파이어 디스크 사용 했다 있는 참조 패턴에 의해 만들어진 상단에 파인더 그리드와 코팅 탄소 ( 재료의 표참조). 이 버전의 현재 프로토콜 적용할 수 있습니다 결국, HPF에 대 한 "A" 캐리어 그림 3A아래로 절단의 필요 없이 직접 사용할 수 있다는 장점과 함께. 또는, 프로토콜에서 설명 했 듯이, "A" 캐리어 두꺼운 이용 될 수 있다 ( 재료의 표참조)는 "B"의 필요 없이 패턴화 된 사파이어 디스크.

흥미롭게도,이 프로토콜 같은 셀 페 설명 대로 바이러스 성 단백질으로 여기 고 다른^19,23, BSL-1 샘플, 공부 뿐만 아니라 바이러스에 감염 된 세포를 공부를 적용할 수 있습니다. 있지만 작업 인간의 병원 체는 일반적으로 BSL-2와 BSL-3 실험실, 일부 국가에서는 그건 cryo-동원 정지가 biosafety 조건 하에서 수행할 수 있습니다. 그 BSL-2와 BSL-3 실험실 어디 vitrification 불가능, 현지 규정 또는 HPF 시스템의 부재, 바이러스 감염 세포 준비 될 수 있다 아직도 알데하이드와 화학 기정 사전에 실시 하는 경우이 메서드를 사용 하 여 즉 전에 BSL-2 또는 BSL-3 시설을 떠나. 또한, 알데하이드 프로토콜의 나머지는 여기에 설명 된 동일 동안 형광, 계속 고정 후 즉시 침묵 될 필요가 있다. 이 기술은 셀 두 번, 화학적 및 vitrification를 통해 고정 되어 있기 때문에 중복 간주 될 수 있습니다. 그러나,이 이중 고정 프로토콜 셀 화학 기정 혼자²¹대상이 있는 Dmv에 비해 HCV 유도 Dmv의 훨씬 더 나은 보존을 실제로 지도 한다.

추가 수정 및 독자를 문제 해결에 대 한이 원고에 대 한 프로토콜 부분에 걸쳐 메모를 부릅니다. 이 노트는 함정을 피하기 위해, 뿐만 아니라이 방법을 수행할 때 발생할 수 있는 상 상속 어려움을 극복 하기 위해 대안을 설명 합니다.

이 기술을 적용 하기 위한 주요 필수 HPF입니다. 때 cryo immobilizing HPF 통해 셀 (HPF 기계의 부재) 때문에 가능 하지 않습니다 또는 (때 막 보존 수 필요 하지 않습니다) 필요 없습니다, 세포 화학적 고정 및 이후에 준비 고 수 EM^{8에 의해 분석 9,10,11,12,13,14,15,,1617,18 ,19}. 이 옵션에는 셀 또는 셀 클러스터 재배치 gridded 패턴으로 셀 문화 요리 하지만 사파이어 디스크를 사용 하 여가 필요 하지 않습니다. 이 요리를 사용 하 여의 주요 장점은 큰 표면 영역의 심사를 수 있도록 사파이어 디스크에 비해 그들의 더 큰 직경. 따라서,이 클레 멘 타인 프로토콜의 응용 프로그램은 성공적으로 적용 되었다 HCV¹⁵ 에 대 한 항 바이러스 화합물의 효과 연구 하거나 noroviruses¹⁹nonstructural 단백질에 의해 유도 된 막 재배열을 시각화. 이 방법의 성능을 제한 하는 수 있는 또 다른 문제는 상업 FS 장치의 부재 이다. 이 경우에, 기본적인 수 제 FS 시스템 대신 활용할 수 있습니다. FS 장치 자동 처리 사고를 줄일 수 있습니다, 하지만 집에서 만드는 장치는 성공적으로 사용 예를 들어 켄트 맥도날드의³⁰ 와 폴 발터의 실험실에서.

화학 기정에 관하여 여기에서 설명 하는 프로토콜 세포내 구조²⁰의 최적의 보존을 보장 합니다. 따라서, 위에서 언급 한 HPF와 FS 장치를 사용할 수 있는 경우에 관심사의 세포를 vitrifying 것 선호.

이 클레 멘 타인 방법 미래 대안 ultrastructural 수준에서 2D 정보를 얻으려고 뿐만 아니라 바이러스에 의해 발생 하는 막과 세포 기관이 변경의 아키텍처에 대 한 3 차원 정보를 얻기 위해이 방법 사용의 가능성을 포함 합니다. 전자 단층 촬영 (동부 표준시)와 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (거짓말-sem의) (에서 광범위 하 게 설명된²⁹)를 포함 하 여 3 차원 EM 방법 또한이 현재 프로토콜^{21, 다음 준비 된 셀에 적용 될 수 있습니다. 31}. 또한, 3 차원 정보 수 또한 얻어질 LM 수준 z 스택의 인수를 허용 하는 confocal 현미경을 사용 하는 경우. 사실,이 옵션이 좋습니다 때 LM 및 EM 데이터 집합 사이의 정확한 상관관계는 원하는 (예를 들어¹⁷참조). 3D z-스택에 포함 된 정보는 2D 가장 이미지와 상관 관계를 개선 하기 위해 에이즈. 따라서 이러한 시나리오에서는 최고의 피팅 LM 및 EM 이미지 선택하실 수 있으며 다음 얼음 (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² 의 ec-클레 멘 타인 플러그인 등의 획기적인 통신 플러그인 가능한 상관 관계 소프트웨어 중 하나를 받게 이미지 J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), LM EM 이미지 중복의 생성 결과.

일시적인 정보 특정 이벤트의 활동을 이해 하는 데 필요한 때 시간 경과 영상 EM과 함께에서 살아있는 세포의 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 관심 이벤트 동안 셀 고정 됩니다 즉시, "냉동된 스냅숏" 이후에 그들을 통해 분석할 수 있는 생성, 동원 정지의 시간에 그 특정 순간에 대 한 자세한 ultrastructural 정보를 제공 하. 실시간으로 관찰 후 그 "냉동된 스냅숏"을 얻으려면 세포 화학적 고정된³³ 또는 곳을 알아내는 움직일 수⁶수 있습니다. 이후 많은 세포질 과정의 화학 정착 확산 프로세스 보다 더 빨리 발생, 만약에 가능 하다 면, 매우 빠른 냉동 수행 되어야 한다. 그러나, 그것은 HPF 기계 그들의 효과적인 시간 해상도³⁴에 다을 고려 하는 것이 중요입니다.

또한,이 프로토콜 에폭시 수 지에 셀을 포함 하는 위해 설계 되었습니다, 비록 셀 수 또한에 포함 Lowicryls, LR 화이트 또는 LR 금 같은 저 점도 수 지. 이러한 포함 미디어를 사용 하 여 형광^37,38 뿐만 아니라 antigenicity^35,36, 보존을 가능 하 게 하 고, 따라서, 주로 후에 섹션 immunolabeling³⁹ 를 포함에 대 한 사용 ^{, 40} 그리고 섹션에 클레 멘 타인^41,42,43,44, 어디는 LM 포함 후 이루어집니다. 두 방법 (면역-EM 및 섹션에 클레 멘 타인) 그 실험에 있는 비 특성 구조를 쉽게 찾을 수 가장을 통해 또는 miscorrelation LM와 그들 사이 대 한 제어 신호에 대 한 중요 한 되어야 합니다. 마찬가지로, 두 이미징 형식 (LM 및 EM)에 의해 구상 될 수 있다 항 체로 실행 될 수 있다 예를 들어 LM (사전 단계 포함)의 transfected 세포를 식별 하 고의 훨씬 더 정확한 지 방화를 달성 하기 위해⁴⁵ 개는 GFP 면역-EM (포스트 포함 단계)에 의해 그것의 특정 라벨을 통해 신호. 그러나에 고려 한다,, 그 permeabilization LM EM 수준에서 셀 건축의 최적의 보존 될 수 있습니다 세포내 공간에 항 체의 액세스를 허용 하기 전에 수행 됩니다. 흥미롭게도,이 프로토콜은 또한 적합 다 색 실험을 위해 (같이) GFP 이외의 다른 형광 태그의 사용으로 달성 될 수 있다. 결론적으로,이 프로토콜은 LM에 또는 EM 면 해결 되는 질문에 따라 적응의 많은 상 상속 가능성이 있다. 다른 대체 프로토콜의 포괄적인 설명에 대 한 독자^5,46을 부릅니다. 현미경 modalities 결합 방법을에 함께 결과 바이러스 및 그들의 단백질 실제 생활에서 그들의 호스트와 상호 작용 하는 방법을 더 잘 이해할 수 있도록 정보의 이득입니다.

이 메서드 내에서 가장 중요 한 단계는 관심의 세포에서 직렬 섹션의 컬렉션 이다. 대표적인 결과 섹션에서 강조,이 전문가 직원 뿐만 아니라 인내심이 많이 필요합니다. 중요 한 것은,이 단계는 두 가지 이유로 그들 수준에서 다시 셀을 찾을 수 필수적입니다. 첫째, 클레 멘 타인 프로토콜 사전 LM 포함을 사용 하 여의이 종류에서 좌표만 볼 수 있습니다 LM 수준 및 수 지 블록 얼굴에 포함 후. 그러나, 그들은 되지 않습니다 볼 수 가장에 의해 섹션에. 따라서, 관심사 (ROIs)의 지역에 아래로 블록 얼굴에 타겟된 트리밍 이후에 가져온 섹션 주어진된 FP를 표현 하는 셀을 포함 되도록 면도날으로 신중 하 게 수행할 수 해야 합니다. 둘째, "스캔" 몇몇 단면도 LM와 그들 인수 사이의 최고의 오버레이 찾을 필요가 있다. 방법 LM 포스트 포함 단계에서 수행 됩니다, 달리이 경우 LM EM 오버레이 그렇게 정확 하지. 낮은 오버레이 정확도 LM와 EM, EM, 샘플 처리 동안 수축 및 단면⁴²동안 압축 축 해상도 차이 때문 이다. 그럼에도 불구 하 고, 효율적인 추적 방법, 랜드마크를 사용 하 여 같은 다시 셀을 찾는 데 도움이. 이 세포 및 그들의 핵의 모양 뿐만 아니라, 다른 한 셀의 위치가 포함 됩니다. 이와 관련, 프로토콜에 설명 된 대로 DIC 이미지 상관 관계 개선에 중요 한 세포의 "해 부" 정보를 제공 합니다. 또는, 핵 또는 다른 잘 인식할 수 있는 셀 세포 (미토 콘 드리 아 등 지질 작은 물방울) LM 전에 스테인드 하 고 랜드마크로 서 사용 될 수.

마지막으로, 그것은 비록이 원고 바이러스학 연구에 대 한이 기술의 사용에 초점을 맞추고,이 실험적인 디자인의 범위는 보다 일반적인 생물 학적 질문 확장 수 있습니다 말할 것도 주목 된다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230 Vac, 254nm UV 전구 장착, 각각 8W.
패턴화된 사파이어 디스크	엔지니어링 오피스 M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	627	직경은 0.3mm이고 두께는 0.16mm이며, 세포의 재배치를 허용하는 에칭된 영숫자 패턴이 있습니다. 이메일로만 주문할 수 있습니다: martin-wohlwend@bluewin.ch.
슬림하고 긴 핀셋	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", 사파이어 디스크 핸들링용.
세포 배양 배지	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	2mM L-글루타민, 비필수 아미노산, ml당 100 단위 페니실린, 100 &마이크로가 보충된 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM); ml 당 g 스트렙토마이신 및 10% 태아 송아지 혈청(DMEM 완료, 아래 참조). 각 500mL 10병이 들어 있는 패키지.
L-글루타민	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	패키지에는 각 100mL 20병이 들어 있습니다.
비필수 아미노산	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	각 100mL 20병이 들어 있는 패키지.
페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	각 100mL 20병이 들어 있는 패키지.
태아 종아리 혈청	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	50mL
도립 현미경	Olympus Deutschland, Hamburg, Germany	CKX41	삼안 헤드 옵션과 형광 업그레이드 기능을 갖춘 도립 현미경입니다.
T7 RNA-중합효소를 안정적으로 발현하는 Huh7-Lunet 세포	Ralf Bartenschlager 교수 실험실에서 사용 가능		Bartenschlager 교수에게 문의: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 형질주입 시약	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	광역 스펙트럼, 저독성, DNA 형질주입 시약. 0.4mL
도립 광시야 형광 현미경	바이알 Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일	Zeiss Observer.Z1	살아있는 세포 배양과 관련된 실험을 위한 도립 형광 현미경.
1-헥사데센	Merck, 다름슈타트, 독일	8220640100
고압 프레징(HPF)용 100mL"A" 알루미늄 홀더	엔지니어링 오피스 M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	241	이 프로토콜에 사용된 홀더이며 0.1mm와 0.2mm의 2가지 깊이가 있습니다. 이메일로만 주문할 수 있습니다: martin-wohlwend@bluewin.ch.
HPF 엔지니어링 사무실용 "B" 알루미늄 홀더	M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	242	이 프로토콜에 사용된 홀더입니다. 두께는 0.3mm입니다. 이메일로만 주문할 수 있습니다: martin-wohlwend@bluewin.ch.
HPF용 "A" 알루미늄 홀더(패턴 사파이어 디스크 작업용 특별)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	737	이것은 "B" 홀더 또는 "A" 홀더 에디션이 필요 없이 패턴화된 사파이어 디스크(현재 프로토콜의 대안)와 함께 단독으로 사용할 수 있는 홀더입니다. 두께는 0.84mm입니다. 이메일로만 주문할 수 있습니다: martin-wohlwend@bluewin.ch.
사파이어 디스크	엔지니어링 오피스 M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	405	이 사파이어 디스크는 직경이 0.3mm이고 두께가 0.05mm인 "기존" 디스크입니다. 또한 패턴이 있는 사파이어 디스크 대신 CLEM에 대안으로 사용할 수도 있습니다.
파인더 그리드	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA	LF135-Cu	이 135개의 메시 그리드는 탄소 코팅을 통해 "기존" 사파이어 디스크(위에서 설명)에 영숫자 패턴을 만드는 데 사용되므로 CLEM에 사용할 수 있습니다.100 그리드/바이알.
HPF 기계	ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland	HPM 010	이 HPF 기계는 이 프로토콜에 사용되었습니다.
HPF 기계	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", 이 프로토콜에서 사용된 HPM 기계의 사용에 대한 대안으로 사용됩니다(위에서 설명).
Cryo-tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	액체 질소에 동결 고정 시료를 장기간 보관합니다. 500개의 cryovials가 포함된 패키지.
액체 질소 듀어	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	GZ-05094-60	1600 극저온 튜브 용량의 극저온 랙이 장착된 액체 질소에 극저온 고정 시료를 장기간 보관합니다.
자동 동결 대체(AFS) 기계	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EM AFS2	이 기계는 동결 대체 및 점진적 온도 저하(PLT) 기술을 수행하고 수지의 저온 매립 및 중합을 가능하게 합니다.
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% 수용액, 10 x 2mL 앰플이 들어있는 상자
Uranyl-Acetate (UA)	Serva, Heidelberg, Germany	77879.01	(UA) -2 H 2 / sub >O 25 grs를 포함하는 병.
Sonicator	Bandelin Electronic, 베를린, 독일	329	"Sonorex Super RK 31"은 FS 매체를 준비할 때 OsO4 및 Ua를 혼합하기 위해 이 프로토콜에서 사용되는 수성 세척 용액용 고출력 초음파 세척 수조입니다.
유리 증류 아세톤	전자 현미경 과학, Hatfield, PA, USA	10015	100mL
실체 현미경	Leica Microsystems, 비엔나, 오스트리아	Leica M80	이미지 캡처용 카메라가 장착된 일일 검사를 위한 일상적인 실체 현미경.
에폭시 수지	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812는 제조업체가 제공한 비율로 함께 혼합해야 하는 여러 구성 요소가 포함된 키트입니다.
플로우 스루 링	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707157	100개가 포함된 패키지.
시약 수조	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707154	100개가 들어있는 패키지.
초박절편기	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica EM UC7	실온에서 반박형 및 초박형 절편을 준비하기 위한 초박절편기.
Ultra 35 ° 다이아몬드 나이프	Diatome Ltd., Nidau Switzerland	AGG339-735	이 나이프의 가장자리 길이는 3mm입니다.
초미세 핀셋	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", EM 그리드 처리용.
EM 슬롯 그리드	전자 현미경 과학, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 그리드/바이알.
EM 그리드 보관 상자	전자 현미경 과학, Hatfield, PA, USA	71155	100개의 그리드를 수용할 수 있습니다.