Analyse av skjær flyt-indusert migrering av murint Marginal sone B celler In Vitro
Summary
Marginal sone B celler (MZBs) svarer på styrken av skjær flyt ved å reorientere sine overføringsbane flyten. Denne protokollen viser hvordan du registrerer og analysere overføring ved hjelp av en fluidics enhet, pumpe, mikroskop tenkelig system og fri programvare.
Abstract
Marginal sone B celler (MZBs) er en befolkning på B celler som befinner seg i musen splenic marginale soner som innhylle follikler. For å nå follikler, må MZBs overføre opp skjær styrken av blodstrøm. Vi presenterer her en metode for å analysere dette flyt-indusert MZB migrasjon i vitro. Først er MZBs isolert fra mus milten. Andre er MZBs avgjort på integrin ligander i flow chamber lysbilder, utsatt for å skråstille flyt, og fotografert under et mikroskop under overføring. Tredje bilder av de overfører MZBs behandles med MTrack2 automatiske cellen sporing plugin for ImageJ, og resultatet celle spor er kvantifisert ved hjelp av verktøyet Ibidi chemotaxis. Migrasjon data avslører hvor raskt cellene flytte, hvor ofte de endre retning, om skjær flyt vektoren påvirker deres migrasjon retning og hvilke integrin ligander er involvert. Selv om vi bruker MZBs, kan lett metoden tilpasses for å analysere migrering av noen leukocytter som svarer til styrken av skjær.
Introduction
Immunceller er mest motile cellene i kroppen og ofte må kjempe med skjæring kraft fra blod og lymfe. Men er det relativt få studier på skjær kraft-indusert migrasjon av leukocytter,1,,2,,3,,4,,5. Vi presenterer her en pålitelig og kvantitative protokoll for å analysere responsen på en immun cellen flyt i vitro. Utfører analysen krever ikke fabrikasjon av komponenter, og alt utstyr og forbruksmateriell er kommersielt tilgjengelig. Protokollen, inkludert celle rensing og migrasjon analyse, kan utføres på én dag. Til slutt, selv om vi beskrive overføring av marginal sone B-celler (MZBs), protokollen kan tilpasses analysere migrering mot strømmen av andre typer immunceller. Derfor er det mulig å bruke denne analysen til å systematisk analysere et bredt spekter av leukocytter med en omfattende forhold.
MZBs er en befolkning av B-celler som i musen, finnes bare i milten og transport mellom innsiden av hårsekkene og marginale soner6,7,8,9. Marginale sonen er et lag av immunceller ca 5-10 celler tykk. Cellen laget omslutter hårsekken, og består hovedsakelig av MZBs og makrofager, men også konstant naturlig killer T (iNKT) celler, dendrittiske celler (DCs) og nøytrofile, blant annet10. Cellene i marginale sonen er utsatt for enveis blodstrøm som stammer fra splenic arteries som avsluttet i en marginal sinus rundt hårsekken. Blodet er strømmer fra hull i marginale sinus gjennom marginale sonen samlet i venøse bihulene i rød cellulose og restaurert til sirkulasjon11. Fri-flyt av blod vasker over MZBs og viser dem mot antigener i blodet. MZBs la antigen i hårsekken ved skytling automatisk mellom marginale sonen og inne i hårsekken, som ikke utsettes for blod. Dermed som MZBs Flyplasstransport mot hårsekken, må de overføre opp skjær kraften av blodet flyt12 (figur 1A).
I denne protokollen, vi beskriver kvantitativt fastslå hvordan immunceller som MZBs svarer ikke flyte eller høy flow i vitro, for å avsløre hvordan de er programmert til å overføre i vivo. I det første trinnet, er MZBs renset fra en mus milt med magnetiske perler koblet til antistoffer fra kommersielt tilgjengelige kits. De ferske isolert MZBs introdusert i av en flow chamber lysbildet, slå seg ned på integrin ligander og utsatt til flyt av migrasjon buffer med en pumpesystem (figur 2A). Cellene er avbildet med en time-lapse video mikroskopi system. Bildene behandles deretter for analyse med en gratis ImageJ plugin, MTrack213,14, automatisk spore cellene. Spor kan deretter kvantifiseres med gratis Ibidi Chemotaxis verktøyet15 å bestemme ulike parametere inkludert hastighet, rett linje og migrasjon indeks. Disse verdiene kan brukes til å fastslå effekten av overføringen hemmere, celle stimulators, chemokines og andre overføring-påvirker kjemikalier på skjær-flow indusert overføringen for å forstå krefter kontrollere immun celle bevegelse i vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode for å analysere migrering av celler som gjenkjenner kraft av skjær flyt og svare ved å endre deres migrasjon. En analyse av MZBs viste at MZBs overføre spontant på ICAM-1 og i nærvær av flyt, vil migrere flyten. I vår tidligere arbeid viste vi at MZBs overfører ikke flyten på VCAM-1 men i stedet forblir fast på plass. Murine splenic marginale sonen inneholder hovedsakelig ICAM-1, mens rød masse inneholder både ICAM-1 og VCAM-1. Fra disse dataene, kan det konkluderes at MZBs ville o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 til K.-D.F.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
