Method Article

축수 된 중간 대뇌 동맥에서 멤브레인 전위를 기록하는 마이크로 전극 Impalement 방법

DOI:

10.3791/59072

⸱

July 2nd, 2019

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Mississippi Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서의 주요 목표는 미세 전극 impalement방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥에서 막 전위 (Vm)를 기록하는 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것입니다. 굴절된 중간 대뇌 동맥은 근진한 톤을 얻기 위해 평형화되고, 혈관 벽은 높은 저항 성 미세 전극을 사용하여 찔려있습니다.

Abstract

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혈관 평활근 세포의 막 전위 (V m)는 혈관 톤을 결정하고 따라서 장기에 혈류를 결정합니다. 질병 조건에서 V m을 조절하는 이온 채널 및 전기 생성 펌프의 발현 및 기능의 변화는 잠재적으로 Vm,혈관 톤 및 혈류를 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 전기생리학에 대한 기본적인 이해와 건강하고 병들린 상태에서 Vm을 정확하게 기록하는 데 필요한 방법이 필수적이다. 이 방법을 사용하면 다른 약리학 적 에이전트를 사용하여 V m을 변조하여 V m을 복원 할 수있습니다. 여러 가지 방법이 있지만, 각각의 장점과 단점을 가지고 있지만, 이 문서는 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥과 같은 혼수 저항 혈관으로부터 Vm을 기록하는 프로토콜을 제공한다. 중간 대뇌 동맥은 myograph 챔버에서 myogenic 톤을 얻기 위하여 허용되고, 혈관 벽은 높은 저항 마이크로 전극을 사용하여 찔려 있습니다. Vm 신호는 전계를 통해 수집되고 디지털화되고 분석됩니다. 이 방법은 세포를 손상시키지 않고 멤브레인 저항을 변경하지 않고 용기 벽의 Vm을 정확하게 판독할 수 있습니다.

Introduction

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세포의 멤브레인전위(Vm)는 혈장 막을 가로지르는 이온 전하의 상대적 차이와 이러한 이온에 대한 멤브레인의 상대적 투과성을 지칭한다. Vm은 이온의 차동 분포에 의해 생성되며 이온 채널 과 펌프에 의해 유지됩니다. K+, Na+및 Cl과 같은 이온 채널은 휴식 VM에실질적으로 기여합니다. 혈관 평활근 세포 (VSMC)는 K+ 채널1,전압 게이트 Ca2+ 채널 (VGCC)2의두 가지 유형의 4 가지 유형 이상을 표현하고, 2 가지 유형의 Cl- 채널3, 4개 , 5,상점 운영 Ca2+ 채널6,스트레치 활성화 양이온 채널7,8,그리고 전기 발생 나트륨 - 칼륨 ATPase 펌프

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Protocol

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수컷 쥐는 UMMC의 동물 관리 시설에 보관되었으며, 이는 실험실 동물 관리 협회 (AAALAC)의 평가 및 인증협회의 승인을 받았습니다. 동물들은 연구 기간 내내 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 동물은 온도가 24±2°C, 습도 수준이 60-80% 및 12h 의 빛/어두운 사이클로 통제된 환경에서 유지되었다. 모든 프로토콜은 UMMC의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 장비 준비

  1. 이중 채널 차동 전계 증폭기(재료 표참조)를 용기 챔버 가까이에 배치하고 원하는 위치에 배치합니다.
  2. 증폭기 채널 A 또는 B의 출력을 BNC-BNC 케이블로 디지타이저의 채널 입력에 연결합니다.
  3. 현미경 조작기에 프로브를 장착하고 현미경과 근사근처에 놓습니다. 녹음 설정은 진동이 없는 테이블에 설치해야 합니다.
  4. 설명서에 설명된 대로 이 실험을 위해 노브와 스위치를 앰프 전면에 배치합니다.
  5. 적절한 전극을 통해 배전그라운드를 앰프의 회로 접지에 연결합니다. 마찬가지로 케이지가 앰프의 섀시에 접지되었는지 확인합니다.

2. 마이크로 전극 및 조립의 준비

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Results

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제시된 방법은 굴절된 용기에서 Vm을 기록하는 데 안정적으로 사용될 수 있다. 뇌에서 MCA를 격리하는 방법을 설명하는 간단한 절차가 그림 1A에제시되어 있습니다. 두개골에서 뇌를 분리 한 후, MCA는 해부하고 낮은 칼슘 PSS를 포함하는 페트리 접시에 배치되었다. 부착 된 결합 조직의 일부는 또한 격리 하는 동안 MCA에 손상을 방지 하기 위해 스프링 가위와 집게를 사용 하 여 MCA와 함께 해부 되었다. 신중하게 결합 조직도 제거되었고 해부된 MCA는 근사체로 옮길 준비가 되었습니다. MCA는 캐뉼라에 장착하고 근사에서 캐뉼라의 양 끝에 봉합매듭을 사용하여 묶었다. 전형적인 마이크로전극 임팔레멘트 방식의 개략적 표현은 도 1B에도시되어 있다. 3M KCl으로 채워진 마이크로 전극은 프로브의 홀더를 통해 전전자계에 연결되었습니다. 전기계의 채.......

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Discussion

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이 문서에서는 날카로운 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 굴절된 용기 준비로부터 Vm을 기록하는 방법에 대한 필요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 널리 사용되며 광범위한 실험 적 질문에 대답하는 고품질의 일관된 Vm 기록을 제공합니다.

메서드의 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 고려 사항 및 문제 해결 단계가 여기에 설명되어 있습니다. 마이크로 전극의 품질 (선명도 및 저항) 및 침투 하는 셀룰러 프로세스는V m의 안정성과 정확성에 영향을 미칩니다. 신호가 지속적으로 표류하거나 증폭기의 기록 범위 위 또는 아래에 있는 경우 전극이 차단되었거나 팁이 끊어졌을 가능성이 큽입니다. 세포가 부분적이거나 불충분하거나 손상되는 경우 기록된 전위는 0mV로 다시 올라가서 불안정한 신호또는 신호가 생성되지 않습니다. 일부 경우, 셀의 내용물도 매우 높은 저항 전극을 차단할 수 있다. 이러한 모든 문제는 단순히 전극을 새 것으로 교.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 작품은 UMMC, AHA 과학자 개발 보조금 (13SDG14000006)에서 교내 지원 연구 프로그램 (IRSP)에서 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 말리카르주나 R. Pabbidi에 수여.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection instruments
Aneshetic VaporiserParkland scientificV3000PK
Dissection microscopeNikon Instruments Inc., NYEclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575Harvard Apparatus, MA73-198
Littauer Bone CutterFine science tools16152-15
Moria MC40 초미세 집게정밀 과학 도구11370-40
수술 용 가위 Sharp-Blunt정밀 과학 도구14008-14
봉합Harvard Apparatus72-3287
Vannas Spring ScissorsFine science tools15018-10
Electrophysiology Instruments
전하 결합 장치 카메라Qimaging, , BCRetiga 2000R
차동 전위계 증폭기WPIFD223A
인라인 압력 변환기Harvard Apparatus, MAMA1 72-4496
MicromanipulatorThor labsPCS-5400
MicroelectrodesWarner Instruments LLC, CTG200-6,
Micro Fil (극세사 주사기)WPIMF28G67-5
미세 전극 홀더WPIMEH1SF
근그래프생활 시스템 기기, VTCH-1-SH
풀러셔터 기기, San Rafael, CAP-97
무진동 테이블TMC3435-14
< strong>Softwares
Clampex 10분자 장치
p Clamp 10분자 장치
이미징 소프트웨어Nikon, NYNIS-elements
Chemicals
NaClSigmaS7653
KCl시그마P4504
MgSO4SigmaM7506
CaCl2 SigmaC3881
HEPES시그마H7006
포도당시그마G7021
NaH2PO4SigmaS0751
NaHCO3시그마S5761
사

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Va....

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Membrane PotentialMicroelectrode ImpalementMiddle Cerebral ArteryVascular Smooth MuscleElectrophysiology RecordingMyograph ChamberBorosilicate MicroelectrodesPotassium Chloride FillingElectrometer AmplifierCannulated Vessel Preparation

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