타입-1 당뇨병에 대 한 의약품 후보 백신의 빨간 사탕 과도 식

요약

여기, 선물이 식용 식물에 타입 1 당뇨병에 대 한 경구 백신 후보자를 생산 하는 프로토콜.

초록

식물 분자 농업 관심사의 분자를 생산 하는 식물의 사용 이다. 이 관점에서 식물 사용할 수 있습니다 모두 생물 반응 기 생산 및 최종 제품의 후속 정화 및 분리 단백질의 직접 구두 전달에 대 한 식용 식물을 사용 하는 경우. 이 작품에서는, 우리는 진공 침투 전달 deconstructed 식물 바이러스-기반 재조합 DNA 기술을 사용 하 여 식용 식물 시스템에 타입-1 당뇨병 (T1D)에 대 한 후보 구강 백신의 개발 제시. 우리의 결과 빨간 사탕 T1D T1D 백신으로 유망한 후보 간주에 관련 된 인간의 파생된 autoantigen 과도 표현 위한 적합 한 호스트 보여줍니다. 위 소화에에 그들의 저항, 잔류 세균의 존재 및 사용 가능성에 대 한 프로세스 생산의 개요를 제공의 2 차 대사 프로필 있는 autoantigen 생산 잎 특징 철저 하 게 했다 분리 단백질의 직접 구두 전달 식물. 우리의 분석 시뮬레이션된 위 소화, 식물 유래 갓 백신의 제조에서 캡슐화 전략 필요 하다는 것을 제안에 따라 동결된 후보 구강 백신의 거의 완전 한 저하를 보였다.

서론

식물 분자 생물학 혁명 1980 년대에서 이후 바이오의 생산을 위한 공장 기반 시스템 미생물 및 포유류 세포¹에 따라 기존 시스템의 대 안으로 여겨질 수 있다. 식물은 확장성, 비용 효율성 및 안전²가장 관련성이 높은 되 고 여러 장점이 전통적인 플랫폼을 표시 합니다. 재조합 제품 변형 된 식물 조직에서 정화를 다음 관리, 중 parenterally 또는 구두와, 또한, 변형 된 식용 식물 직접 구두 전달에 대 한 사용할 수 있습니다. 구강 경로 동시에 점 막 및 조직 면역을 촉진 하 고 그것은 바늘과 전문된 의료 인력에 대 한 필요성을 제거. 또한, 구두 전달 일반적으로 재조합 단백질³의 총 제조 비용의 80%를 차지 하는 복잡 한 다운스트림 처리를 제거 합니다. 그 모든 장점은 생산, 공급 및 노동 세계 인구의 대부분을 저렴 한 약을 만드는 각 복용량의 비용 절감으로 번역 될 수 있다.

여러 가지 전략, 모두 안정적인 변환 및 과도 식, 식물에서 재조합 단백질의 생산을 위해 개발 되었다. 그들 가운데, 높은 수율 deconstructed 식물 바이러스-기반 식 시스템 (예: magnICON) 상대적으로 짧은 날짜....

프로토콜

1. 붉은 사탕 무 우와 시금치 재배

1. 붉은 사탕 무 우 성장 (B. vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (S. 올레라케아 이력서 산업) 식물 성장 챔버에 각각 23/21 ° C에서의 빛의 강도, 65% 상대 습도, 명암 주기 12 h 150 µE를 사용 하 여.
2. 씨앗 발 아 후 거 름 식물 상용 비료 (자료 테이블)의 1 g/L 해결책으로 일주일에 두 번. Agroinfiltration에 대 한 5 주 된 시금치 및 6 주 오래 된 빨간 무 우 식물을 사용 합니다.

2. 과도 식 deconstructed 식물 바이러스 기반 기술을 통해

1. 공장 식 벡터의 건설
   1. 벡터-5' 모듈 (pICH20111), 3' 모듈 (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut 및 pICH7410.eGFP), 앞에서 설명한^1,,27, 준비 및 integrase 모듈 (pICH14011)-소개 Agrobacterium tu....

결과

이 작품에서 식용 식물 조직에서 구강 백신의 개발에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 이 작품의 초점은 식용 호스트 식물 종에 대상 단백질의 표현과 잠재적인 구강 백신의 특성 이다.

첫 번째 단계는 식용 식물 시스템에서 재조합 단백질을 생산 하는 식물 바이러스-기반 식 기술의 적합성의 평가 참여. 이 목표를 위해 우리가 먼저 사용는 eGFP 모델 단백질으로 하 고 우리 두 식용 잎이 많은 식물 시스템으로 표현: 붉은 사탕 무 우와 시금치. 식물은 수동으로 A. tumefaciens eGFP 재조합 식 벡터 운반의 정지 된 agroinfiltrated 이었다. 형광 단백질 표정 서쪽 오 점 분석 (그림 1A, B, D, E)에 의해 구상 되었고 자외선에서 계량. 결과 최대 eGFP 수준 (113.4 ± 0.3 µ g/g F.......

토론

이 연구에서 우리는 자기 면역 당뇨병에 대 한 후보 구강 백신의 설계에 대 한 예비 분석을 보였다. 이 실험에 대 한 대상 단백질 돌연변이 형태의 인간의 65 kDa 조미료 Decarboxylase, 어떤 생산 및 기능은 쉽게 감지 하 고 측정 가능한¹²했다. 다른 식용 식물 조직에 그것의 식⁵벡터는 아주 짧은 시간 프레임에서 재조합 단백질 생산의 높은 수준에서 중재 중재 했다. 붉은 사탕 무 우에 eGFP 식에 따라 식용 호스트 수행한 최고의 후보 식물의 선택 하 고 수동 agroinfiltration에 의해 시금치 잎. 이 단계 수동 agroinfiltration의 시간이 걸리는 절차 및 시금치 잎 조직 침투에 경도 산업을 위한 중요 한 수 있습니다.

재조합 단백질에 대 한 최상위 재조합 단백질 축적을 주는 수확의 특정 dpi의 식별 중요 한 단계 이며 테스트 하 여 사건에-의해-사건을 기준.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2-&뮤; m Minisart RC4 멤브레인 필터	Sartorius-Stedim	17764
2– 메르캅토에탄올	Sigma	M3148	독성; 4 % 글리세롤, SDS 및 Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	부식성
아세토니트릴 LC-MS 등급	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	독성 – 0.1 M 재고 DMSO
한천 세균학 등급	Applichem	A0949	효모 추출물, NaCl 및 트립톤 포름산 암모늄으로 LB 매체 (pH 7.5, NaOH) 만들기 위해
	Sigma	70221
Anti-eGFP 항체	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 항체	Sigma	G5163
항-LHCB2 항체	Agrisera	AS01 003
브릴리언트 블루 R-250	시그마	B7920
C18 컬럼	그레이스	-	Alltima HP C18 (150mm x 2.1mm, 3 & m) 열
C18 가드 열	그레이스	-	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 & m) 가드  컬럼
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	비료
카르베니실린 디소듐	Duchefa Biochemie	C0109	독성
화학발광 이미징 시스템	BioRad	1708370	ChemiDoc 터치 이미징 시스템
클로로포름	시그마	C2432
세제	시그마	P5927	폴리소르베이트 20
형광 리더	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
글리세롤	Sigma	G5516	15 %는 Tris-HCl, SDS 및 2&ndash로 버퍼를 적재합니다. 메르캅토에탄올
GoTaq G2 중합효소	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	부식성
HILIC 컬럼	그레이스	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; 입자 크기 2.7 μ m) 컬럼
HILIC 가드 컬럼	그레이스	-	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μ m) 가드  칼럼
호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-conjugate anti-rabbit 항체	Sigma	A6154	너무 많이 얼리거나 해동하지 마세요
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	-	시스템 골드 508 오토샘플러
HPLC 시스템	벡크만 쿨터	-	System Gold 128 솔벤트 모듈 HPLC
이소프로판올	시그마	24137	가연성
카나마이신 설페이트	시그마	K4000	독성
KCl	시그마	P9541	2 g/L NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4 PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L(NaCl 포함), Na2HPO4 및 KCl을 사용하여 PBS
로딩 버퍼
루미놀 솔루션	Ge Healthcare	RPN2232	ECL Prime Western Blotting System 상용 키트
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
질량 분석기	Bruker를 사용하여 용액 준비 Daltonics	-	Bruker Esquire 6000; 질량 분석기는 ESI 소스로 장착되어 있었고 분석기는 이온 트랩이었습니다
메탄올	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
우유 차단 솔루션	Ristora		-3 % PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	NaH2PO4와 함께 사용하여 인산나트륨 완충액
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L KCl, Na2HPO4 및 KH2PO4 PBS 만들기;10 g/L 효모 추출물로 LB 매체(pH 7.5 NaOH) 만들기, 트립톤과 아가르 세균학 등급
NaH2PO4	Sigma	S8282	Na2HPO4와 함께 사용하여 인산나트륨 완충액을 만듭니다.
NaOH	Sigma	S8045
니트로셀룰라아제 멤브레인	Ge 헬스케어	10600002
	시그마	P7000
과산화효소 기질 ECL	GE 헬스케어	RPN2235	감광성 재료
펌프 진공 프레스	VWR	111400000098
시약 A	Sigma	B9643	이 시약의 50 부와 시약 B의 1 부를 사용하여 BCA 작업 용액을 준비하십시오
시약 B	그마	B9643	BCA 작업 용액을 준비하기 위해이 시약의 1 부를 시약 A의 50 부와 함께 사용하십시오
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	독성 – DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	의 25 mg / mL 재고가연성, 독성, 부식성 -10 % 주식; 3 %는 Tris-HCl, Glycerol 및 2&ndash로 로딩 버퍼를 만듭니다. 메르캅토에탄올
나트륨 메타중아황산염	시그마	7681-57-4
초음파 시스템	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; 주파수 40 kHz
주사기	Terumo	-
투명 고정 300-µ L 삽입 유리관	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	1N HCl로 pH를 조정하여 Tris-HCl 버퍼를 만들고 1,5M Tris-HCl (pH 6.8)을 사용하여 SDS, 글리세롤 및 2&ndash로 로딩 버퍼를 만듭니다. 메르캅토에탄올
트립톤	Formedium	TRP03	효모 추출물, NaCl 및 한천으로 LB 배지(pH 7.5, NaOH)를 만들기 위한 10g/L 세균학 등급
진공 농축기	Heto	3878 F1-3	Speed-vac 시스템
물 LC-MS 등급	Sigma	39253
효모 추출물	Sigma	Y1333	Tryptone, NaCl 및 한천을 사용하여 LB 매체(NaOH가 있는 pH 7.5)를 만들기 위한 5g/L

. 돼지 위 점막에서 PBS Pepsin을 만드는 14.4 g/L 시약 B를 준비하십시오 시약 B 시