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방법 논문

타입-1 당뇨병에 대 한 의약품 후보 백신의 빨간 사탕 과도 식

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59298

⸱

2019년 3월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 선물이 식용 식물에 타입 1 당뇨병에 대 한 경구 백신 후보자를 생산 하는 프로토콜.

초록

식물 분자 농업 관심사의 분자를 생산 하는 식물의 사용 이다. 이 관점에서 식물 사용할 수 있습니다 모두 생물 반응 기 생산 및 최종 제품의 후속 정화 및 분리 단백질의 직접 구두 전달에 대 한 식용 식물을 사용 하는 경우. 이 작품에서는, 우리는 진공 침투 전달 deconstructed 식물 바이러스-기반 재조합 DNA 기술을 사용 하 여 식용 식물 시스템에 타입-1 당뇨병 (T1D)에 대 한 후보 구강 백신의 개발 제시. 우리의 결과 빨간 사탕 T1D T1D 백신으로 유망한 후보 간주에 관련 된 인간의 파생된 autoantigen 과도 표현 위한 적합 한 호스트 보여줍니다. 위 소화에에 그들의 저항, 잔류 세균의 존재 및 사용 가능성에 대 한 프로세스 생산의 개요를 제공의 2 차 대사 프로필 있는 autoantigen 생산 잎 특징 철저 하 게 했다 분리 단백질의 직접 구두 전달 식물. 우리의 분석 시뮬레이션된 위 소화, 식물 유래 갓 백신의 제조에서 캡슐화 전략 필요 하다는 것을 제안에 따라 동결된 후보 구강 백신의 거의 완전 한 저하를 보였다.

서론

식물 분자 생물학 혁명 1980 년대에서 이후 바이오의 생산을 위한 공장 기반 시스템 미생물 및 포유류 세포1에 따라 기존 시스템의 대 안으로 여겨질 수 있다. 식물은 확장성, 비용 효율성 및 안전2가장 관련성이 높은 되 고 여러 장점이 전통적인 플랫폼을 표시 합니다. 재조합 제품 변형 된 식물 조직에서 정화를 다음 관리, 중 parenterally 또는 구두와, 또한, 변형 된 식용 식물 직접 구두 전달에 대 한 사용할 수 있습니다. 구강 경로 동시에 점 막 및 조직 면역을 촉진 하 고 그것은 바늘과 전문된 의료 인력에 대 한 필요성을 제거. 또한, 구두 전달 일반적으로 재조합 단백질3의 총 제조 비용의 80%를 차지 하는 복잡 한 다운스트림 처리를 제거 합니다. 그 모든 장점은 생산, 공급 및 노동 세계 인구의 대부분을 저렴 한 약을 만드는 각 복용량의 비용 절감으로 번역 될 수 있다.

여러 가지 전략, 모두 안정적인 변환 및 과도 식, 식물에서 재조합 단백질의 생산을 위해 개발 되었다. 그들 가운데, 높은 수율 deconstructed 식물 바이러스-기반 식 시스템 (예: magnICON) 상대적으로 짧은 날짜 표시줄4이상의 재조합 단백질의 높은 수익률을 선도 하는 우수한 성능을 제공 합니다. 과도 식 Nicotiana benthamiana 식물에서 식물 바이러스-기반 식 시스템을 사용 하 여의 많은 예제, 표준 생산 호스트 되 고 보고 됩니다. 그러나,이 모델 식물은 알 카 로이드 및 그것의 잎에 축적 된 다른 독성 대사 산물 식용 종으로 간주 되지.

이 작품에서는, 우리는 두 식용 식물 시스템, 레드 비트 간의 비교 설명 (베타 vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (Spinacea 올레라케아 이력서 산업), 글루탐산의 65 kDa isoform의 두 후보 형태의 표현에 대 한 decarboxylase (GAD65), 바이러스-기반 식물에 의해 실시5벡터 스 GAD65 타입-1 당뇨병 (T1D)에 관련 된 주요 autoantigen 이며 그것은 현재를 방지 하거나 허용 오차6유도 T1D 지연 인간 임상 시험에서 조사를 받고 있다. GAD65의 생산 공장에서 광범위 하 게 모델 식물 종에서 Nicotiana tabacum 고 명 benthamiana4,5,,67로 공부 했다. 여기, 우리가 직접 구두 납품을 위해 의미 될 수 있다 조직에 분자의 생산을 위한 식용 식물의 사용을 설명 합니다. 기술적인 관점에서 우리는 공부 하 고 다른 매개 변수를 평가 하 여 공장 agroinfiltration에 대 한 시스템 및 GAD65 생산을 위한 식용 식물 플랫폼 선택: 재조합 형 단백질 표정 수준, 식물에서 잔여 미생물 충전 조직 구두 전달, 위 소화를 GAD65의 저항 및 야생 유형으로 변형 된 식물의 bioequivalence에 대 한 의미.

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프로토콜

1. 붉은 사탕 무 우와 시금치 재배

  1. 붉은 사탕 무 우 성장 (B. vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (S. 올레라케아 이력서 산업) 식물 성장 챔버에 각각 23/21 ° C에서의 빛의 강도, 65% 상대 습도, 명암 주기 12 h 150 µE를 사용 하 여.
  2. 씨앗 발 아 후 거 름 식물 상용 비료 (자료 테이블)의 1 g/L 해결책으로 일주일에 두 번. Agroinfiltration에 대 한 5 주 된 시금치 및 6 주 오래 된 빨간 무 우 식물을 사용 합니다.

2. 과도 식 deconstructed 식물 바이러스 기반 기술을 통해

  1. 공장 식 벡터의 건설
    1. 벡터-5' 모듈 (pICH20111), 3' 모듈 (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut 및 pICH7410.eGFP), 앞에서 설명한1,,27, 준비 및 integrase 모듈 (pICH14011)-소개 Agrobacterium tumefaciens GV3101 변형 표준 기술을 사용 하 여. 28 ° c.에 2 일 동안 50 μ g/mL 리 팜 피신과 적절 한 벡터 특정 항생제 (50 μ g/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011 및 pICH7410.eGFP), pICH31070에 대 한 50 μ g/mL 대를 포함 하는 파운드 매체에 성장
    2. 식민지 각 벡터에 대 한 다음과 같은 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 식민지 화면: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3', 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' 모듈 pICH31070.GAD65mut 및 pICH31070.∆87G65mut, 55 ° C의 어 닐 링 온도 110의 신장 시간 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3', 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 세 번째 3' 모듈 pICH7410.eGFP, 53 ° C의 어 닐 링 온도와 30의 신장 시간에 대 한 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3', 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' 53 ° C의 어 닐 링 온도와 20 s와 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3의 신장 시간 5' 모듈 ' 및 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' 57 ° C의 어 닐 링 온도와 45의 신장 시간 integrase 모듈에 대 한 s.
    3. 다음 특정 반응 주기를 사용 하 여 20 μ의 전체 볼륨에 PCR 반응을 수행: 5 분 초기 변성 95 ° C에서 30의 35 주기 s 95 ° C, 30에서 어 닐 링 온도 72 ° C에서 신장 단계에서 s (어 닐 링 온도 신장 시간을 다시 각 뇌관 커플에 대 한 특정) 및 72 ° c.에 7 분의 최종 신장 단계
  2. 주사기 agroinfiltration
    1. 3 A. tumefaciens transformants 파운드 중간 포함 50 μ g/mL 리 팜 피신 및 다음 적절 한 벡터 특정 항생제의 50 mL에 접종: A. tumefaciens pICH20111와 변형에 대 한 50 μ g/mL carbenicillin pICH14011 또는 pICH7410.eGFP, 또는 50 μ g/mL 대 A. tumefaciens pICH31070와 변형에 대 한. 28 ° c.에 하룻밤 떨고에 의해 성장
    2. 20 분 동안 4500 x g 에서 원심 분리 하 여 하룻밤 세균성 문화를 작은 고 10 m m 4-morpholineethanesulfonic 산 (MES, pH 5.5)을 포함 하는 침투 버퍼의 100 mL (또는 초기 세균성 문화의 두 개의 볼륨)에 그들을 resuspend 및 10 m m MgSO4, 마약을 고려 하지 않고600. 실 온 (RT) 3 h에서 정지를 품 어.
    3. 모듈 중 하나는 3, GAD65mut, ∆87GAD65mut 또는 eGFP 3', 5' 모듈 모듈과 integrase 모듈을 포함 하는 세균성 정지의 동등한 볼륨 믹스. 서 스 펜 션 믹스를 사용 하 여 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎의 주사기 침투에 대 한.
    4. 바늘 없는 주사기에는 서 스 펜 션의 5 mL을 배치 합니다. 시금치와 붉은 사탕 무 우 식물, 나뭇잎의 밑면에 대 한 주사기의 끝을 누르고 한편 잎의 다른 쪽에 부드러운 counterpressure을 적용.
    5. 각 식물에 대 한 정점에서 시작 처음 세 완전히 확장 된 잎을 침투 하 고 잎 줄기에 종이 태그와 agroinfiltrated 잎 레이블을 지정 합니다. 표준 조건 하에서 성장 챔버에 식물을 반환 합니다.
      참고: 건강과 안전 이유를 위한 착용 장갑과 눈 보호 침투 과정.
    6. 수집 agroinfiltrated 14 일 게시 감염 (dpi) 액체 질소에서 그들을 고정 하는 4에서 출발 한다. -80 ° c.에 게 식물 조직
  3. 진공 agroinfiltration
    1. 28 ° c.에서 밤새 흔들어 파운드 매체 50 μ g/mL 리 팜 피신 및 적절 한 벡터-특정의 50 mL에 별도로 3 A. tumefaciens transformants 항생제 성장
    2. 20 분에 4500 x g 에서 원심 분리 하 여 펠 릿 하룻밤 세균성 문화 침투 버퍼 0.35의 OD600 의 1 L에 펠 릿을 Resuspend 고 3 h에 대 한 실시간에 정지를 품 어.
    3. 각 정지에 (폴 20) 세제의 0.01 %v / v를 추가 합니다. 모듈 중 하나는 3, GAD65mut, ∆87GAD65mut 또는 eGFP 3', 5' 모듈 모듈과 integrase 모듈을 포함 하는 세균성 정지의 동등한 볼륨 믹스.
    4. 삽입 한 공장 (6 주 오래 된 빨간 사탕 무 공장, 섹션 1을 참조) 소유자에서. 홀더를 반전 하 고 침투 목욕 잠수함 침투 정지에서 잎 (2 패)를 포함 하는 비 커 위에 배치 합니다.
      주: 모든 나뭇잎 세균 현 탁 액에 담근 완전히는 확인 하십시오. 필요한 경우 추가 침투 정지의 추가 레벨을 올립니다.
    5. 침수 식물 침투 목욕 침투 실로 전송 하 고 그것을 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 침투 챔버에 진공 흡입구 밸브를 엽니다.
    6. 일단 90 mbar 침투 약 실에 있는 압력 감소 했다, 계속 3 분 출시에 대 한 진공 진공 45에 대 한 s. 침투 챔버는 대기압에 반환에, 일단 챔버를 열고 욕조에서는 세균 침투 식물을 제거 합니다.
    7. 표준 조건 하에서 성장 챔버에 식물을 반환 합니다.
    8. 재조합 단백질에 따라 최대 식 dpi에서 agroinfiltrated 잎을 수집 하 고 액체 질소에 그들을 동결. -80 ° c.에 게 식물 조직

3. 재조합 형 단백질 표정 분석

  1. 총 수용 성 단백질 (TSP) 추출
    1. 주사기를 갈기 또는 진공 침투 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎, 2.2.6 단계와 단계에서 2.3.8, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 액체 질소에 정밀한 분말을 수집 합니다. 15 mL 플라스틱 튜브로 분말을 전송 하 고-80 ° c.에 있는 자료를 저장
    2. 잎 가루 300 밀리 그램을 추출 버퍼 (50 m m 인산 나트륨 pH 8.0, 20mm 나트륨 metabisulphite)의 900 µ L를 추가 합니다.
      참고: 버퍼 볼륨 (µ L)으로 식물 조직 무게 (mg) 사이의 선택한 비율 1:3입니다.
    3. 1 분에 대 한 vortexing에 의해 혼합 균질 다음 4 ° c.에 40 분 30000 x g 에서 원심
    4. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 수집 하 고-80 ° c.에 그것을 저장합니다
  2. 식물 eGFP 시각화 및 정량화
    1. EGFP 96 잘 접시에 잎, 3 개의 기술 복제, 표현에서 얻은 각 TSP 추출의 100 µ L를 로드 합니다.
    2. 96 잘 접시를 형광 판독기에 넣고 측정 시작. 485/535 nm 필터 eGFP 형광 검출에 필요한 설정 사용.
    3. 절대 정량화에 대 한 같은 접시에 준비 보정 곡선 로드 다른 수량 (62.5, 125, 500, 750, 1000 ng) 순화 eGFP의.
  3. TSP 정량화에 대 한 Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과
    1. (자료 테이블) 50 부분의 시 약 A 1 부분 시 약 B (자료 테이블)의 혼합. 샘플 분석 되 고 교정 표준에 대 한 충분 한 양의 신선한 BCA 작업 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 각 샘플에 필요한 BCA 작업 솔루션의 볼륨은 1.9 mL. 9 표준 (를 포함 하 여 빈) 표준 절차, BCA 작업 솔루션의 17.1 mL이 필요 합니다.
    2. 각 표준 (를 포함 하 여 빈), 그리고 TSP 추출 물 이라는 관으로의 0.1 mL 플라스틱
      참고: 교정 표준으로 준비 신선한 집합이 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 샘플, 물 등으로 가급적 같은 희석제를 사용 하 여 10-1000 μ g/mL 범위에서. 교정 표준 및 샘플 준비에 사용 되는 희석제의 0.1 mL 빈에 의하여 이루어져 있다.
    3. 1.9 mL BCA 작업 솔루션을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 튜브를 커버 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    4. 실시간 측정 562에서 흡 광도를 튜브 쿨 10 분 이내 모든 샘플의 nm.
      참고: RT, 에서도 색상 개발 계속 됩니다. 10 분 이내 모든 튜브의 흡 광도 측정 한다면 상당한 오류를 소개 합니다.
    5. 표준과 TSP 추출의 판독에서 빈의 562 nm 흡 광도 값을 뺍니다.
    6. 플롯 빈 수정 562 nm의 농도에 각 표준에 대 한 읽기. 각 TSP 추출의 단백질 농도 결정 합니다.
  4. Gecchele 외8앞에서 설명한 대로 얼룩 Coomassie 젤을 수행 합니다.
  5. 서쪽 오 점 분석
    1. Gecchele 외8앞에서 설명한 서쪽 오 점 분석을 수행 합니다.
    2. 단백질 전기 이동 별거 후에 니트로 막 표준 기술을 사용 하 여 전송. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) pH 7.4에에서 4% 우유를 혼합 하 여 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 시간에 대 한 실시간에 차단 솔루션의 10 mL와 함께 막을 차단 합니다.
    3. 안티-GAD65/67 및 안티-LHCB2, 1:10,000 및 1:20,000 안티 eGFP 0.1% 세제로 차단 솔루션의 5 mL에 대 한 토끼 항 기본 체를 준비 합니다. 준비 된 1 차적인 항 체 솔루션 4 ° C에서 하룻밤 또는 일정 한 동요와 RT에 4 h 막 품 어.
    4. 1 차적인 항 체를 삭제 하 고 차단 솔루션 0.1% 세제를 포함 하 5 분에 대 한 3 번 막 씻어.
    5. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 준비-0.1% 세제 솔루션을 차단에 1:10,000에서 어원이 안티 토끼 항 체. 일정 한 동요와 RT에 1.5 h 막 품 어.
    6. 이차 항 체를 삭제 하 고 각 PBS-t (PBS 0.1% 세제로 보완) 5 분에 대 한 5 번 막 씻어.
    7. 제조업체의 지침에 따라 상용 luminol 솔루션 멤브레인을 품 어. 화학 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.

4. 식물 소재 처리

  1. 수확 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 빨간 무 우 식 피크 (11 dpi)에서 나뭇잎과 액체 질소에 그들을 동결.
  2. 0.04 mbar-50 ° C에서 72 h에 대 한 냉동된 잎 lyophilize -80 ° c.에서 그들을 저장합니다
  3. 정밀한 분말을 잎을 갈기 고 수 분을 제외 하 실리 카 겔 컨테이너를 밀봉된에 RT에 저장 합니다.

5. 위 소화 시뮬레이션 및 셀 무결성 분석

  1. 위 소화 시뮬레이션
    1. 6 mL PBS (pH 7.4)에 resuspend 및 grinded 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램 무게.
    2. 6 M HCl와 2 샘플 pH를 조정 합니다.
    3. 10 m m HCl 1 mg/mL의 펩 신 최종 농도 또는 1:20 총 수용 성 단백질의 비율을 돼지 위 점 막에서 4 mg/mL의 펩 신을 추가 합니다. 120 분 동안 37 ° C에서 샘플을 흔들어.
    4. 비활성화는 펩 신을 1 M NaOH로 pH 8에 샘플을 조정 합니다.
    5. 20000 x g 4 ° c.에 20 분에 각 샘플의 750 µ L aliquots 원심 상쾌한 별도로 수집 하 고 버퍼를 로드의 표면에 뜨는 볼륨 하나에 펠 릿을 resuspend (1.5 M Tris HCl, pH 6.8, 3 %SDS, 15% 글리세롤, 및 4 %2-mercaptoethanol).
      참고: 건강과 안전 이유를 위해 장갑을 착용 하 고 샘플 준비에 대 한 증기 두건에서 작동.
    6. 서쪽 오 점 분석8여는 상쾌한와 resuspended 펠 릿을 분석.
  2. 셀 무결성 분석
    1. Grinded 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램의 두 샘플을 준비 하 고 6 mL PBS (pH 7.4)에 둘 다 resuspend.
    2. 하나는 6 M HCl. 흔들어 2 120 분 동안 37 ° C에서 두 샘플 샘플만의 pH를 조정 합니다.
    3. 20000 x g 4 ° c.에 20 분에 각 샘플의 750 µ L aliquots 원심 상쾌한 별도로 수집 하 고 버퍼를 로드의 표면에 뜨는 볼륨 하나에 펠 릿을 resuspend.
    4. 서쪽 오 점 분석은 상쾌한 및 resuspended 펠 릿을 분석 합니다.

6. Bioburden 분석 결과

  1. 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램 무게. 8 mL의 멸 균 PBS (pH 7.4)에 1 분 동안 소용돌이 분말 resuspend
  2. 항생제 또는 (i) 50 µ g/mL 리 팜 피신, 리 팜 피신과 carbenicillin의 각 (ii) 50 µ g/m l, (iii) 50 µ g/mL 각 리 팜 피신과 대, 또는 (iv) 50 µ g/mL 각 리 팜 피신, carbenicillin, 고 대를 포함 하지 않고 파운드 매체를 준비 합니다.
  3. 플레이트 5 선택적 파운드 미디어 중에서 각 동결된 잎 homogenate의 1 mL.
  4. 28 ° c.에 3 일 동안 모든 접시를 품 어
  5. 각 접시에 성장 Agrobacterium 식민지를 계산 합니다.
  6. 계산 하 고 동결된 잎 homogenate (CFU/mL)의 mL 당 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 수로 잔여 세균 전을 정의 합니다.

7. 대사 산물 추출

  1. 1 차 대사 산물 추출
    1. 저장-80 ° C의 30 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 2 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.
    2. 2 시간 동안-20 ° C에서 30 미 품에 대 한 차가운 70/30 (v/v) 메탄올/클로 프롬 및 소용돌이의 750 µ L를 추가 합니다.
      참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다.
    3. 새로운 2 mL 튜브에 냉 수와 10 분 수집에 대 한 17,900 x g 4 ° c에서 원심 분리기 및 전송의 600 µ L 위 hydroalcoholic 단계를 추가 합니다. 더 낮은 chloroformic 위상과 interphase를 삭제 합니다.
    4. 용 제 증발에 3 h에 대 한 진공 집중 장치에 샘플을 넣어.
    5. 50/50 (v/v) 이기/물 단계 7.1.4에서 300 µ L에서 얻은 펠 릿을 녹이 고 3 분에 대 한 샘플을 sonicate.
    6. 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 하 고는 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브에 넣어.
  2. 2 차 대사 산물 추출
    1. -80 ° C 저장의 300 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 15 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.
    2. 메탄올와 동 30의 3 개 mL를 추가 s, 그리고 15 분 동안 40 kHz에서 sonicate.
      참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다.
    3. 10 분 동안 4 ° C에서 4500 x g 에서 샘플 원심 고 새로운 15 mL 튜브는 supernatants 전송.
    4. 희석 100 µ L의 추출 물으로 1:3 (v/v) 하 고 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다.
    5. 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브로 솔루션을 넣어.
  3. 극 지 지질 추출
    1. 저장-80 ° C의 200 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 15 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.
    2. 물 200 µ L 그리고 메탄올의 2 개 mL를 추가 하 고 1 시간을 위한 얼음에 계속.
      참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다.
    3. 30 대 한 소용돌이 s와 15 분 동안 40 kHz에서 sonicate.
    4. 원심 25 분 수집 4 ° C에서 4500 x g 에서 샘플 및 전송 클로 프롬 단계 2 mL 튜브로. 위 hydroalcoholic 위상과 interphase를 삭제 합니다.
    5. 용 매 증발에 3 h에 대 한 진공 집중 장치에 샘플을 넣어.
    6. 단계 7.3.5 오디오 메탄올의 600 µ L에서에서 얻은 펠 릿을 디졸브.
    7. 희석 100 µ L 1:5 (v/v) 메탄올 추출 하 고 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다.
    8. 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브로 솔루션을 넣어.

8. 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 분석 및 데이터 처리

  1. 공급 업체에서 권장 하는 대로 LC-MS 시스템을 설정 합니다.
    참고: C18 열 (150 x 2.1 m m, 입자 크기 3 µ m) 앞 C18 가드 열 (75 x 2.1 m m, 입자 크기 5 µ m)의 2 차 대사 산물 및 극 지 지질 분석에 대 한 장착 HPLC 결합 한 autosampler LC 섹션 구성 반면 (150 x 2.1 m m, 입자 크기 2.7 µ m) HILIC 열 앞 HILIC 가드 열 (7.5 x 2.1 m m, 3 µ m). MS는 분무 이온화 (ESI) 또는 대기압 화학 이온화 (APCI) 소스와 함께 제공 되는 이온 트랩 질량 분석기 이다.
  2. HPLC 그라디언트에 대 한 적절 한 용 매를 준비 합니다. 주 대사 산물 분석에 대 한 사용 하 여 20 m m 염화 편대 용 매 a; 95% 이기, 5% 수 플러스 10 m m 염화 편대 용 매 b.로 2 차 대사 산물 분석 물 플러스 0.05% 개미 산 (A)와 이기 플러스 0.05% 개미 산 (B)를 사용 하 여. 극 지 지질 분석 물 플러스 0.05% 개미 산 (A) 및 100% 이기 (B)를 사용 하 여.
    참고: 용 제, 첨가제, LC-MS 학년 이어야 합니다.
  3. 대사 산물 차입에 대 한 표 1 에 보고 된 그라디언트를 사용 합니다. 반면 0.2 mL/분 주사 10 µ L의 2 차 대사 산물 및 극 지 지질, 각 샘플에는 흐름 속도 설정 기본 대사 산물에 대 한 5 µ L를 주사.
  4. 각 실험 조건의 대표적인 혼합 다른 샘플의 동등한 부분을 혼합 하 여 품질 관리 (QC) 샘플을 준비 합니다. 악기 효율성을 모니터링 하는 실험 중 QC 샘플을 분석. 특히, 각 10 샘플 배치 후 QC 샘플 분석을 삽입 합니다.
  5. 악기 기반 효과 피하기 위해 샘플을 무작위.
  6. 9 분석 후 청소 방법 및 빈 분석 열 삽입 후 즉시.
    참고: 강한 용 매의 높은 비율에 isocratic 차입과 두 용 매 사이 느린 그라데이션을 수행 합니다. 빈 순수한 메탄올의 주입으로 구성 됩니다: 다음 분석에 보존 시간 재현성을 향상 시키기 위해 물 (50/50, v/v).
  7. 표 2에 나열 된 매개 변수를 사용 하 여 다른 긍정적이 고 부정적인 이온화 모드에서 질량 스펙트럼을 취득 하는 악기를 설정 합니다.
    참고: 다른 매개 변수는 특정 플랫폼에 따라 달라 집니다.
  8. 달 산 외.9에 설명 된 대로 다음 데이터 처리를 수행 합니다.

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결과

이 작품에서 식용 식물 조직에서 구강 백신의 개발에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 이 작품의 초점은 식용 호스트 식물 종에 대상 단백질의 표현과 잠재적인 구강 백신의 특성 이다.

첫 번째 단계는 식용 식물 시스템에서 재조합 단백질을 생산 하는 식물 바이러스-기반 식 기술의 적합성의 평가 참여. 이 목표를 위해 우리가 먼저 사용는 eGFP 모델 단백질으로 하 고 우리 두 식용 잎이 많은 식물 시스템으로 표현: 붉은 사탕 무 우와 시금치. 식물은 수동으로 A. tumefaciens eGFP 재조합 식 벡터 운반의 정지 된 agroinfiltrated 이었다. 형광 단백질 표정 서쪽 오 점 분석 (그림 1A, B, D, E)에 의해 구상 되었고 자외선에서 계량. 결과 최대 eGFP 수준 (113.4 ± 0.3 µ g/g F...

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토론

이 연구에서 우리는 자기 면역 당뇨병에 대 한 후보 구강 백신의 설계에 대 한 예비 분석을 보였다. 이 실험에 대 한 대상 단백질 돌연변이 형태의 인간의 65 kDa 조미료 Decarboxylase, 어떤 생산 및 기능은 쉽게 감지 하 고 측정 가능한12했다. 다른 식용 식물 조직에 그것의 식5벡터는 아주 짧은 시간 프레임에서 재조합 단백질 생산의 높은 수준에서 중재 중재 했다. 붉은 사탕 무 우에 eGFP 식에 따라 식용 호스트 수행한 최고의 후보 식물의 선택 하 고 수동 agroinfiltration에 의해 시금치 잎. 이 단계 수동 agroinfiltration의 시간이 걸리는 절차 및 시금치 잎 조직 침투에 경도 산업을 위한 중요 한 수 있습니다.

재조합 단백질에 대 한 최상위 재조합 단백질 축적을 주는 수확의 특정 dpi의 식별 중요 한 단계 이며 테스트 하 여 사건에-의해-사건을 기준...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 공동 프로젝트 "자가 면역 당뇨병 식용 백신 (eDIVA)의 생산을 위한 식물의 사용"에 의해 지원 되었다 (프로젝트 ID: 891854) 베로나 대학 전화 2014의 프레임 워크에 의해 자금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2-&뮤; m Minisart RC4 멤브레인 필터Sartorius-Stedim17764
2– 메르캅토에탄올SigmaM3148독성; 4 % 글리세롤, SDS 및 Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)SigmaM8250pH 5.5
96-well plateSarstedt833924
Acetic acidSigma27221부식성
아세토니트릴 LC-MS 등급Sigma34967
AcetosyringoneSigmaD134406독성 – 0.1 M 재고 DMSO
한천 세균학 등급ApplichemA0949효모 추출물, NaCl 및 트립톤 포름산 암모늄으로 LB 매체 (pH 7.5, NaOH) 만들기 위해
Sigma70221
Anti-eGFP 항체ABCamab290
Anti-GAD 65/67 항체SigmaG5163
항-LHCB2 항체AgriseraAS01 003
브릴리언트 블루 R-250시그마B7920
C18 컬럼그레이스    -Alltima HP C18 (150mm x 2.1mm, 3 & m) 열
C18 가드 열그레이스    -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 & m) 가드  컬럼
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15비료
카르베니실린 디소듐Duchefa BiochemieC0109독성
화학발광 이미징 시스템BioRad1708370ChemiDoc 터치 이미징 시스템
클로로포름시그마C2432
세제시그마P5927폴리소르베이트 20
형광 리더Perkin-Elmer  1420-011VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS gradeSigma94318
글리세롤SigmaG551615 %는 Tris-HCl, SDS 및 2&ndash로 버퍼를 적재합니다. 메르캅토에탄올
GoTaq G2 중합효소PromegaM7841
HClSigmaH1758부식성
HILIC 컬럼그레이스    -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; 입자 크기 2.7 μ m) 컬럼
HILIC 가드 컬럼그레이스    -Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μ m) 가드  칼럼
호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-conjugate anti-rabbit 항체SigmaA6154너무 많이 얼리거나 해동하지 마세요
HPLC AutosamplerBeckman Coulter    -시스템 골드 508 오토샘플러
HPLC 시스템벡크만 쿨터    -System Gold 128 솔벤트 모듈 HPLC
이소프로판올시그마24137가연성
카나마이신 설페이트시그마K4000독성
KCl시그마P95412 g/L NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4 PBS
KH2PO4 SigmaP97912.4 g/L(NaCl 포함), Na2HPO4 및 KCl을 사용하여 PBS
로딩 버퍼
루미놀 솔루션Ge HealthcareRPN2232ECL Prime Western Blotting System 상용 키트
Lyophilizator5PascalLIO5P0000DGT
질량 분석기Bruker를 사용하여 용액 준비 Daltonics  -Bruker Esquire 6000; 질량 분석기는 ESI 소스로 장착되어 있었고 분석기는 이온 트랩이었습니다
메탄올Sigma32213
MgSO4SigmaM7506
우유 차단 솔루션Ristora    -3 % PBS
Na2HPO4SigmaS7907NaH2PO4와 함께 사용하여 인산나트륨 완충액
NaClSigmaS301480 g/L KCl, Na2HPO4 및 KH2PO4 PBS 만들기;10 g/L 효모 추출물로 LB 매체(pH 7.5 NaOH) 만들기, 트립톤과 아가르 세균학 등급
NaH2PO4SigmaS8282  Na2HPO4와 함께 사용하여 인산나트륨 완충액을 만듭니다.
NaOHSigmaS8045
니트로셀룰라아제 멤브레인Ge 헬스케어10600002
시그마P7000
과산화효소 기질 ECLGE 헬스케어RPN2235감광성 재료
펌프 진공 프레스VWR111400000098
시약 ASigmaB9643이 시약의 50 부와 시약 B의 1 부를 사용하여 BCA 작업 용액을 준비하십시오
시약 B그마B9643BCA 작업 용액을 준비하기 위해이 시약의 1 부를 시약 A의 50 부와 함께 사용하십시오
RifampicinDuchefa BiochemieR0146독성 – DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)SigmaL3771의 25 mg / mL 재고가연성, 독성, 부식성 -10 % 주식; 3 %는 Tris-HCl, Glycerol 및 2&ndash로 로딩 버퍼를 만듭니다. 메르캅토에탄올
나트륨 메타중아황산염시그마7681-57-4
초음파 시스템Soltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; 주파수 40 kHz
주사기Terumo    -
투명 고정 300-µ L 삽입 유리관Thermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT15031N HCl로 pH를 조정하여 Tris-HCl 버퍼를 만들고 1,5M Tris-HCl (pH 6.8)을 사용하여 SDS, 글리세롤 및 2&ndash로 로딩 버퍼를 만듭니다. 메르캅토에탄올
트립톤FormediumTRP03효모 추출물, NaCl 및 한천으로 LB 배지(pH 7.5, NaOH)를 만들기 위한 10g/L 세균학 등급
진공 농축기Heto3878 F1-3Speed-vac 시스템
물 LC-MS 등급Sigma39253
효모 추출물SigmaY1333Tryptone, NaCl 및 한천을 사용하여 LB 매체(NaOH가 있는 pH 7.5)를 만들기 위한 5g/L
. 돼지 위 점막에서 PBS Pepsin을 만드는 14.4 g/L 시약 B를 준비하십시오 시약 B 시

참고문헌

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  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

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