화성 Hindlimb 내리기와 쥐에 베어링 부분 무게를 사용 하 여 우주 임무를 흉내 낸

달과 화성 등 외계 목표는 인간의 우주 탐사의 미래를 대표 하지만 모두 지구 보다 상당히 약한 중력. Musculoskeletal 시스템에 무중력의 결과 우주 비행사^1,2,3,,45 와 설치류^6, 에서 광범위 하 게 공부는 하는 동안 ^{7 , 8 , 9}, 후자의 기초가 hindlimb 언로드 (HLU) 모델¹⁰, 덕분에 아주 작은 부분 중력의 효과 대 한 알려져 있다. 화성 중력 지구의의 38% 이며이 행성 장기 탐사¹¹;의 초점이 되었다 따라서,이 설정에서 발생할 수 있는 근육 변경 이해 결정적 이다. 이렇게 하려면, 우리는 쥐¹², 쥐^6,13, 근육과 뼈의 결과 사용 하 여 유효성이 검사 된이 이전 작업에 따라 부분 체중 베어링 (PWB) 시스템을 개발. 그러나, 화성 탐사 microgravity, 우리의 앞에서 설명한 모델¹²에서 해결 되지 않은의 연장된 기간 선행 될 것 이다. 따라서, 본이 연구에서는 우리 화성 여행 모방을 우리의 모델을 변경, 총 hindlimb 내리기의 첫 번째 단계 그리고 구성 부분 체중 베어링 일반 로드의 40%에서의 두 번째 단계 바로 뒤에.

대부분 HLU 모델과 달리 우리 하기로 골반 하네스 (게 외.⁹에서 설명 하는 것에 기반)를 사용 하 여 꼬리 현 탁 액 개선 동물의 편안 하 고 원활 하 게 이동할 수을 대신 하 고 여유롭게 PWB에 HLU에서 몇 분만. 함께, 우리는 감 금 소 및 서 스 펜 션 장치 이전 개발 하 고 광범위 하 게¹²설명 우리가 사용. 신뢰할 수 있는 일관 된 데이터를 제공 하, 우리는 또한 이전 막대의 중심에 서 스 펜 션 시스템의 고정된 첨부 점을 이동, 정리, 수 유, 또는 마시는 동물을 방지 하지 않았다 설명 했다. 이 문서에서 (모두 완전히 그리고 부분적으로) 동물의 뒷 다리 사지를 언로 드, 힘 및 젖은 근육 질량 결과 근육 변경 그립을 사용 하 여 기능적으로 평가 하는 방법으로, 뿐만 아니라 그들의 달성된 중력 레벨을 확인 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델은 연구원은 이미 손상 된 근육 골격 체계에 부분적인 중력 (인공 또는 여분-지상파)의 결과 조사 하고자 되므로 생물에 적응 하는 방법을 조사 하기 위해 그들에 매우 유용할 것 이다 부분 로드 해, 그리고 인간 spaceflight 전후 동안 건강을 유지 하기 위해 개발 될 수 있는 대책의 발달을 위해.

여기에 설명 된 모든 메서드는 프로토콜 번호 067-2016 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터에 의해 승인 되었다.

참고: 남성 Wistar 쥐 세 기준선 (0 일)에서 14 주 사용 됩니다. 쥐 새 환경 순응에 대 한 수 있도록 사용자 지정 케이지 24 h 이전 기준에서 개별적으로 지 내게 됩니다.

1. Hindlimb 내리기

참고: 골반 마구 마 취 또는 깨어 동물에 넣을 수 있습니다. 여기, 프로토콜의 묘사는 마 취 동물에 주어진 다. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 동물을 처리 하기 위해 착용 하십시오.

1. 3.5 %isoflurane 2 L/min의 산소 흐름 마 취 상자에 쥐를 놓습니다.
   참고: 적절 한 anesthetization의 후방 발 회사 핀치 반응을 유도 하지 않는 때 확인 된다.
2. 일단 동물 완전히 마 취, 마 취 가스 2 %isoflurane 1.5 L/min의 산소 흐름 nosecone에서 오는 벤치에 쥐를 놓습니다.
3. 경향이 위치에 쥐를 놓고 rostro 꼬리 운동에서 골반 하네스를 입었다.
4. 부드럽게 벤드 아늑한 수 있도록 골반 하네스 주의 하는 동안 적합 하지 찰과상과 불편을 방지 하기 위해 hindlimbs를 짠 다.
5. 후크는 꼬리의 기지에 연결 된 골반 마구의 상단에 회전 걸쇠와 스테인리스 체인을 연결 합니다.
6. 마 취에서 쥐를 제거 하 고 최대 확장 체인 동물에 사용자 지정 장소.
7. 일단 쥐 완전히 깨어 및 모바일, 뒷 다리 사지 수 더 이상 바닥에 도달할 때까지 상위 회전 버클을 사용 하 여 체인을 단축.
8. 완전히 언로드되지 남아 그것의 안락을 평가 하 고 있는지 전혀 시간, 두 뒷 다리 사지를 몇 분 동안 동물을 관찰 합니다.

2. 부분 체중 베어링

참고:이 단계는 깨어 있고 마 취 동물에 실현 될 수 있다.

1. 스테인리스 체인 및 다시 로드 이루어진 삼각형 모양 부분을 추가 하 여 PWB 정지에 HLU 서 스 펜 션 장치를 변환 합니다.
2. HLU (1.1 및 1.2 단계)에 대 한 자세한 동일한 절차에 따라 동물 anesthetize
3. 쥐 (쥐 400 g 위의 무게 L 이하로 400 g의 쥐에 대 한 M)의 앞 발에 적절 한 크기의 밧줄 재킷을 놓고 다시 브래지어 extender를 사용 하 여 닫습니다.
4. 다시 브라 익스텐더 및 꼬리의 기지에 골반 마구에 있는 연결에 반대 걸쇠에 있는 후크를 삼각형 모양 부분의 한 버클을 연결 합니다.
5. 감 금 소에 마 취에서 회복 하기 위해 동물을 수 있습니다. 일단, 체인을 단축 하 고 필요한 경우 하단의 받침 걸쇠의 위치를 수정 하 여 정지 앞 발에는 hindlimbs 같은 인지 확인 합니다.
   참고:이 단계는 또한 실현 될 포스 플레이트를 사용 하 여 모든 사지에 동등한 로드를 확인 하.
6. 체인을 단축 하지 않고 규모 즉, "로드" 몸 무게를 기록 하는 동물 및 전체 기구의 무게 위에 쥐를 놓습니다.
7. 눈금 표시 레코드는 달성된 하 고 "로드" 몸 무게의 40% 될 때까지 체인을 단축 중력 수준 (내려진된 무게와 로드 중량 비로 표시).
8. 내려진된 무게 안정 하 고 쥐는 모든 사지에 동등 하 게 로드 되도록 동물을 관찰 합니다.
9. 막대를 사용 하 여 규모에서 전체 기구를 제거 하 고 다시 그것의 감 금 소에에서는 쥐를 배치.

3. 평가 hindlimb의 그립 힘

1. 한 손으로 앞 발 밑을 배치 하 여 전통적인 구속으로 쥐를 잡으십시오. 두 번째 손으로 꼬리 잡고 부드럽게.
2. 후방 발 그립 바 접근 하 고 두 발 완전히 바에 쉬고 있는지 확인 하십시오.
   참고: 쥐 바 완전히 그립 하지 않습니다 또는 자발적인 창과의 증거를 표시 하지 않습니다, 경우 약간 감을 놓습니다. 이 성공 하지 않으면, 그것의 감 금에 쥐를 반환 하 고 몇 분 후 다시 시도 하십시오.
3. 부드럽게 당겨 쥐 직선 그립 출시 때까지. 최대한 힘 변환기에 표시를 기록 합니다.
4. 측정 및 반복 테스트 3 번 사이 대기 약 30 s.
5. 피로 대 한 계정에, 점수 3 측정의 평균을 계산 합니다.

4. 녹음 근육의 질량을 젖은

1. CO₂ 안락사 챔버에 쥐를 놓습니다. IACUC AVMA 지침에 따라 적절 한 시간 후, 호흡의 부족의 시각적 관찰에 의해 안락사를 확인 합니다.
2. 경향이 위치에서 해 부 테이블에 쥐를 놓고 작은 해 부가 위를 사용 하 여 발목 근처 incising에 의해 모피와 피부를 제거 합니다. 손을 사용 하 여 피부 층을 떼어낼 수 있습니다.
3. 작은 해 부가 위를 사용 하 여 부드럽게 근육 근 막에 휴식 하 고 calcaneus 힘 줄을 분리.
   참고: calcaneus 힘 줄은 모두는 soleus gastrocnemius 근육의 부착점.
4. 족집게의 작은 쌍 calcaneus 힘 줄을 잡고, 위에 있는 팔 뚝 femoris에서 gastrocnemius와 soleus 근육을 분리 해 부가 위를 사용 합니다.
5. 일단 절연, 오 금 지역에서 gastrocnemius와 soleus 근육의 부착점을 잘라.
6. 부드럽게 당겨는 gastrocnemius 멀리 soleus 고 calcaneus 힘 줄을 절단 하 여 그들을 분리.
7. 부정사 위치에 쥐를 놓습니다. 조심 스럽게 근을 제거 하 고 상승 운동에 발목에서 앞쪽에 tibialis 껍질.
8. 앞쪽에 tibialis 우수한 부착 지점에서 잘라.
9. 각 삭제 근육 tared 정밀 규모와 무게 보트를 사용 하 여 정확한 젖은 대량의 기록 합니다.

우리는 이전 설계 및 우리 hindlimb 내리기 (HLU, 그림 1)와 부분 체중 부하 (PWB, 스테인리스 체인 기반 정지 장치를 사용 하는 세부 사항12에 설명 된 새 감 금 소의 활용 그림 2). 우리의 디자인의 중요 한 장점은 다른 동물에 대 한 동일한 환경을 유지 하면서 분의 문제에서 내리기의 한 종류에서 갈 수 있습니다. 우리는 주문 품 골반 하네스 (그림 2A)의 HLU에 대 한 각 측에 회전 걸쇠와 함께 단일 주문 스테인리스 체인에 연결 된 사용. 이 서 스 펜 션 장치를 수정 하 고 PWB 달성, 삼각형 모양의 원피스의 스테인레스 스틸 체인 고정적인 다시 로드, 척추 (그림 3) 위에 그냥 앉아 하도록 설계 된 통합의 추가 유일한 요구 사항은 이다. 깨어 또는 마 취 동물에서 이러한 단계를 수행할 수 있습니다.

이 실험에서 제공 하는 다양 한 환경 우리가 성공적으로 어떤 합병증이 없이 7 일 동안 모든 우리의 동물 hindlimb를 언로 드 하 고 신속 하 게 그들의 정상적인 로드 (PWB40, 평균 달성의 40%에서 부분적인 중력에 노출 수 있습니다. 중력의 수준 0.4076 g ± 0.0036 g). 총 HLU의 첫 번째 주 동안 동물 표시 중요 한 몸 무게 감소 (그림 4A:-7.19 ± 0.87%, n = 9, p < 0.001),14, 고 우리에 관찰에서 크게 차이가 되지 않습니다 어떤 다른 목격 하고있다 같은 기간 PWB40에서 노출 하는 쥐 (-5.53 ± 1.44%, n = 10, p = 0.37). 그러나, 동물 이후 PWB40에 노출 되 고 하면서 무게를 잃는 계속 (-9.06 기준, p < 0.0001% ± 1.35%).

Hindlimb 그립 힘은 경도 사용할 수 있는 근육 기능의 표준 측정 (그림 4B). 우리는 그 1 주일 기준 (p < 0.0001)에 비해 50.16% ± 4.10%의 그립 힘에 있는 평균 감소에 지도 하는 총 역의 것으로 나타났습니다. 이후 일주일 후 정상적인 로드의 40%에 베어링 부분 체중의, 우리 어떤 변화 그립 힘에 관한 더 주의 하지 않았다 (-44.29 ± 4.67% 기준선, p < 0.0001에 비해). 모든 시간-포인트, 후방 발 그립 힘의 백분율 변화 했다 나이 일치 하는 컨트롤에서 크게 다른 (7 일 그리고 하루 14, np < 0.0001 = 11). 또한, 우리는 연구의 완료 후 총 역 뒤에 부분 체중 베어링 (HLU-PWB40) 받았다 동물 표시 PWB40 그룹에 비해 상당히 큰 그립 힘 손실 관찰 (p = 0.03).

젖은 질량은 실험의 끝에 기록 하 고 데이터에 비해 근육의 정상적인 로드 2 주 또는 PWB40의 2 주 후 얻은 (그림 4C) 및 데이터 이전 우리의 그룹12출판. 우리는 발견 soleus (S), gastrocnemius (G)의 질량을 젖은 PWB40와 HLU-PWB40 그룹 크게 낮은 것 및 앞쪽에 tibialis (TA) 나이 일치 하는 컨트롤 (PWB100) 보다 근육. 실제로, 우리는 평균 soleus 질량 0.1681 g ± 동물에 대 한 우리의 이전 실험에서 2 주 동안 PWB100에 노출 하는 쥐 보다 훨씬 낮은 있던 0.007 g의 기록 (-24.60% ± 3.18%, p < 0.0001). Gastrocnemius, 우리 기록 2.192 g ± 0.096 g의 평균 젖은 질량 (-10.55% ± 3.93%, p = 0.038 vs PWB100)와 젖은 대량의 0.759 g ± 앞쪽에 tibialis 0.029 g (-14.40% ± 3.27%, p = 0.009 vs PWB100). 우리의 데이터 집합을 강조 표시 하는 동안 화성 임무 아날로그 (HLU-PWB100)에 노출 동물 했다 2 연속 주 동안 PWB40에 노출 하는 동물에 비해 gastrocnemius와 soleus 근육의 감소 젖은 질량 (-8.75% ± 3.84%와-5.85% ± 4.14%, 각각), 우리는 이러한 두 그룹 사이 상당한 차이 관찰 하지 않았다.

그림 1: 서 스 펜 션 장치의 설명 및 PWB HLU에서 변환 하는 방법. (A)을 바탕으로 우리의 이전 디자인, 안정적인 정지를 케이지 위에 앉아 알루미늄 막대 사용 키 링의 구성 장치 스테인리스 체인 (화살표 2), 막대 (화살표 1)의 센터에서 확보 하 고 2 회전 걸쇠 (화살표 3). (B) 변환 PWB, 삼각형 모양의 구조를 달성 하기 위해 서 스 펜 션 장치 하단 회전 버클을 사용 하 여 연결 합니다. 이 작품은 스테인리스 체인 및 쥐의 척추 (화살표 1) 위에 폴 리 염화 비닐 (PVC) 다시 로드 구성 됩니다. 다시 막대의 각 측에는 마구와 재킷, 각각 연결할 걸쇠 위치 (화살표 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 뒷 다리 골반 하네스를 사용 하 여 내리기. (A) 전면 및 측면 보기의 동물의 뒷 다리 사지를 지 원하는 데 사용 되는 하네스 구조 그림. (B) 골반 마구 쥐의 뒷 다리 사지 주위 snuggly에 맞게 설명 된 대로 배치 했다. 스테인레스 스틸 링크는 꼬리의 기초 위에 있고 회전 버클에 연결 된. 정확한 위치와 도구의 모양 동물 사이 다를 수 있습니다 하지만 쥐 편안 해야 하 고 그것은 그들의 뒷 다리 사지 결코 땅을 터치 필요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 부분 체중 베어링. 부분 내리기 동물 재킷의 정면 사지를 지원 하기 위해 필요 합니다. 재킷은 다음 다시 브라 익스텐더로 닫히고 후크는 견 사이 extender에 연결 되어. 재킷 및 골반 마구 뒤 막대의 양 끝에 있는 걸쇠에 연결 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 동물 다른 역 수준에 노출에 경도 후속 예. (A) 몸 무게 (BW) 변경. 동물 없이 마구 또는 자 켓과 체중 기록 된 주간 무게 했다. PWB100 = 일반 로드;에 베어링 부분 체중 PWB40 = 일반 로드;의 40%에 베어링 부분 체중 HLU-PWB40 = hindlimb 내리기 PWB40의 1 주일 뒤의 1 주일. Tukey의 포스트 hoc 테스트 2-웨이 누적된 ANOVA 다음의 결과으로 표시 됩니다 *: p < 0.05, * *: p < 0.01, * * *: p < 0.001, 그리고 * * *: p < 0.0001 대 PWB100. (B) 뒷 발 그립 힘에 변화. 주간, 후방 발 그립 힘을 측정 하 고 결과 각 동물에 대 한 기준선에서의 % 변화에 표현 했다. Tukey의 포스트 hoc 테스트 2-웨이 누적된 ANOVA 다음의 결과으로 표시 됩니다 * * *: p < 0.001과 * * *: p < 0.0001 vs PWB100, α: p < 0.05 대 PWB40. (C) 근육은 14 일 후 질량을 젖은. 근육 젖은 질량 정밀 규모에 14 일에 희생 후 즉시 기록 되었다. 결과 나이 일치 하는 제어 그룹 (PWB100)에서 얻은 젖은 질량의 %로 표시 됩니다. S = Soleus; G = Gastrocnemius; TA 앞쪽에 Tibialis =. Tukey의 포스트 hoc 테스트 다음 단방향 ANOVA 결과으로 제공 됩니다 *: p < 0.05, * *: p < 0.01, 그리고 * * *: p < 0.0001 대 PWB100. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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