방법 논문

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

DOI:

10.3791/59690

⸱

2019년 7월 11일

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

초록

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파킨슨병(PD)은 복부 메센팔론(VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트카(SNpc)에서 도파민성(DA) 뉴런의 변성에 의해 유발된다. 세포 대체 요법은 PD의 치료에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 최근, 유도 신경 줄기 세포 (iNSCs)는 종양 형성의 감소 위험과 가소성으로 인해 세포 대체 요법의 잠재적 인 후보로 부상했다. 지역별 뉴런및 신경교세포. iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs) 및 세포의 각종 그밖 모형과 같은 자가 체세포 근원에서 재프로그래밍될 수 있습니다. 체세포의 다른 유형과 비교하여, PBMCMC는 배양에서 접근하고 확장하기 쉽기 때문에 매력적인 스타터 세포 유형입니다. 센다이 바이러스(SeV)는 RNA 비통합 바이러스로, 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함한 재프로그래밍 인자를 인코딩하여, 통합되지 않는 부정적인 감각, 단일 가닥, 비분별 게놈을 가지고 있습니다. 호스트 게놈, 그러나 감염된 세포의 세포질에서만 복제, 재프로그래밍을 위한 효율적이고 안전한 차량을 제안하. 이 연구에서는, 우리는 iNSC가 PBMNCs를 다시 프로그래밍하여 얻어지고, 2단계 방법에 의해 전문화된 VM DA 뉴런으로 분화되는 프로토콜을 기술한다. 이어서 DA 전구체는 PD의 치료에 대한 안전성 및 효능을 평가하기 위해 일방적으로 6-히록시도파민(6-OHDA) 병변형 PD 마우스 모델로 이식된다. 이 방법은 생체외 및 생체 내에서 환자 특이적 DA 신경 세포의 기능 및 치료 효과를 조사하는 플랫폼을 제공한다.

서론

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파킨슨 병 (PD)은 복부 메센셀론 (VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트 (SNpc)에서 도파민성 (DA) 뉴런의 퇴화로 인한 일반적인 신경 퇴행성 질환으로, 60 세 이상의 인구에서 1 % 이상의 유병률을 가지고 있습니다. 1개 , 2. 지난 10 년 동안 퇴행성 또는 손상된 세포를 대체하거나 퇴행성 뉴런 주변의 미세 환경을 영양화하기위한 세포치료는 PD 3의 치료에 잠재력을 보여주었습니다. 한편, 리프로그래밍 기술은 대체요법을 위한 유망한 세포 공급원을 제공하는 4. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs) 및 배아 줄기 세포(ESCs)는 쥐및 비인간 영장류 PD 모델로 이식할 때 생존, 교화 및 모터 기능을 개선할 수 있는 DA 신경 세포로 분화할 수 있는 것으로 입증되었습니다5 ,6,7,8. iPSCs는 세포 재프로그래밍 기술의 이정표를 나타내며 세포 이식에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나, 불완전하게 분화된 세포에서 종양 대형의 리스크에 관하여 아직도 우려가 있습니다. 세포 이식을 위한 대체 세포 공급원은 불안정한 중간체에서 파생될 수 있는 유도된 신경 줄기 세포 (iNSCs)와 같은 직접적인 재프로그래밍을 통해 얻은 혈통-커밋된 성인 줄기 세포, 다능성을 우회하는 것입니다 단계9,10,11.

iPSCs와 iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMcCs) 및 다양한 다른 유형의 세포12,13,14와같은 자가 세포 공급원에서 다시 프로그래밍 할 수 있으므로 이식 된 세포의 면역 원성은 큰 정도입니다. 더욱이, iPSCs에 비해, iNSCs는 종양 형성 및 계보 커밋된 가소성의 감소된 리스크에 내재되어 있으며, 단지 뉴런과 글리아11로분화할 수 있다. 초기 연구에서, 인간 또는 마우스 iPSCs 및 iNSCs는 피부 생검으로부터 얻은 섬유아세포로부터 생성되었고, 이는 침습적 절차14,15이다. 이와 관련하여, PBMCCS는 덜 침습적 샘플링 과정때문에 매력적인 스타터 셀 소스이며, 확장 시간16의짧은 기간 내에 많은 수의 세포를 얻을 수 있다. 초기 리프로그래밍 연구는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 통합 전달 시스템을 사용했으며, 이는 많은유형의 세포에서 효율적이고 구현하기 쉬운 17; 그러나, 이들 전달 시스템은 잔류 트랜스유전자의 돌연변이 및 재활성화를 유발할 수 있으며, 이는 임상 치료 목적으로 안전성 문제를 제시한다12. 센다이 바이러스(SeV)는 숙주 게놈에 통합되지 않고 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 부정적인 감각의 단일 가닥 게놈을 가진 비통합 RNA 바이러스로, 18을 다시 프로그래밍하기 위한 효율적이고 안전한 차량을 제공합니다. ,19. 재조합 SeV 벡터는 그들의 개방 판독 프레임에서 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함하는 재프로그래밍 인자를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 또한, SeV 바이러스 벡터는 온도에 민감한 돌연변이를 도입함으로써 더욱 개선될 수 있으며, 배양 온도가 20°C로 상승될 때 이를 빠르게 제거할 수 있다. 이 문서에서는 SeV 시스템을 사용하여 PBMC를 iNSC로 다시 프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다.

많은 연구는 다양한 방법을 사용하여 인간 ESCs 또는 iPSCs에서 DA 뉴런의 유도를보고했다6,8,21. 그러나, 세부 사항에 iNSC에서 DA 뉴런의 분화를 설명 하는 프로토콜의 부족. 이 프로토콜에서는 2단계 방법을 사용하여 iNSC에서 DA 뉴런의 효율적인 생성을 설명합니다. DA 뉴런 전구체는 안전성 및 효능 평가를 위해 PD 마우스 모델의 줄무늬로 이식될 수 있다. 본 기사는 센다이 바이러스에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생성, DA 뉴런으로의 iNSC 분화, 마우스 PD 모델 의 확립, DA 전구체의 이식에 이르기까지 다양한 단계를 포괄하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. PD 모델의. 이 프로토콜을 사용하여 환자와 건강한 기증자로부터 iNSC를 생성하고 세포 이식 목적으로 안전하고 표준화 가능하며 확장 가능하며 균질한 DA 뉴런을 도출하거나 접시에서 PD를 모델링하고 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 근본적인 질병 개시 및 발달.

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프로토콜

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모든 절차는 제도적 인간연구윤리위원회의 지침을 따라야 한다. 통보된 동의는 혈액 수집 전에 환자 또는 건강한 지원자로부터 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 동물의 관리 및 사용에 대한 기관의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. PBMC의 수집, 격리 및 확장

  1. PBMC의 컬렉션
    1. 헤파린 방부제 바이알을 사용하여 기증자의 말초 정맥 혈액 10-20 mL을 수집합니다.
      참고: 혈액 샘플은 실온(RT)에서 보관하거나 배송해야 합니다. 24 시간 이내에 혈액 샘플을 처리합니다.
  2. 배양 배지의 준비
    1. 세럼 프리 배지(SFM)를 준비하여 이스코브의 변형된 덜베코 배지(IMDM), 햄 F-12 240 mL, 인슐린 트랜스퍼린 셀레늄-X 보충제 5mL(ITS-X), 100x 글루타민 스톡 용액 5mL(테이블 재료),화학적으로 정의된 지질 농축액 5 mL, 태아 소 혈청 2.5 g, 아스코르브산 0.025 g 및 1 티오글리세롤 9 μL. 매체를 걸과 4°C에 보관합니다.
      주의: 아스코르브산과 1-티오글리세롤은 피부 접촉과 흡입에 의해 독성이 있습니다.
    2. 단핵 세포 (MNC) 매체를 준비하려면 SFM 배지를 10 ng/mL 인간 인터류키핀 3 (IL-3), 2 U/mL 에리스로포이에틴 (EPO), 100 ng/mL 인간 줄기 세포 인자 (SCF), 40 ng/mL 인간 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1), 100μg/mL 홀로 페더린으로 보충하십시오. μM 덱사메타손. 매체를 걸과 4°C에 보관합니다.
      참고: 사용하기 직전에 매체를 준비하십시오.
  3. PBMC의 격리
    1. 사용하기 전에 깨끗한 벤치를 자외선 살균하십시오. 75% 알코올로 모든 표면과 장비를 살균하십시오. 오토클레이브를 사용하여 모든 팁을 살균하십시오.
    2. 말초 혈액 (PB)을 50 mL 원엽 튜브로 옮기고 멸균 된 덜베코의 인산 완충 식염수 (D-PBS)와 동일한 부피로 PB를 희석하십시오.
    3. 다른 50 mL 원엽 튜브에 멸균 밀도 그라데이션 매체 (재료테이블)의15 mL을 준비합니다.
      참고: PBMC를 더 잘 격리할 수 있도록 RT에서 밀도 그라데이션 매체와 PB를 유지합니다.
    4. 밀도 그라데이션 매체를 포함하는 원점 튜브를 45° 각도로 기울인 다음 천천히 조심스럽게 30 mL의 희석 된 PB를 밀도 그라데이션 매체에 놓습니다.
      참고: 주의하고 PB가 원유관의 측면을 천천히 밀도 그라데이션 배지 층으로 실행하도록 하십시오. 적혈구는 관의 바닥에 침전됩니다. 튜브를 조심스럽게 기울여 레이어 인터페이스의 중단을 최소화합니다.
    5. RT에서 15분 동안 800 x g의 튜브를 원심분리하고 원심 분리기 브레이크를 "꺼짐" 위치에 설정합니다. 노란색, 상부 플라즈마 층을 흡인하고 폐기. 그런 다음 10 mL 파이펫이 있는 MTO를 포함하는 흰색 흐린 박막 층을 새로운 50 mL 원엽 튜브로 전송합니다.
      참고: MNC의 격리에는 원심분리기 브레이크 오프가 중요합니다.
    6. MTOC와 원심분리기로 튜브에 30 mL의 D-PBS를 넣고 4°C에서 10분 동안 600 x g에 추가합니다. 상급체를 버린 다음 45 mL의 D-PBS를 추가하여 세포를 다시 일시 중단합니다. 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 원심 분리기.
      참고: 원심분리기 브레이크는 이 단계와 다음 원심분리 단계를 위해 켜져 있어야 합니다. 세포 펠릿이 조밀해지면 D-PBS 1-2 mL을 추가하여 펠릿을 부드럽게 다시 현탁한 다음 D-PBS를 45 mL에 추가합니다.
    7. 상판을 버리고 D-PBS의 5 mL로 세포를 다시 중단하고 trypan 파란색 배제 방법으로 라이브 셀을 계산합니다.
    8. 확장에 필요한 MMC를 따로 떼어 놓은 후, 나중에 사용할 수 위해 나머지 셀을 동결합니다.
      참고: 적어도 5 x 106 MNC는 1 mL의 동결 매체 (재료 표)로 한 바이알에 동결 될 수 있습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  4. MNC 의 확장
    1. 14일째에, 종자 MNC는 미리 온난화(37°C) MNC 배지의 1.5 mL를 가진 6웰 플레이트 중 하나에서 밀리리터당 2-3 x 106 세포의 밀도로. 37°C에서 배양하고, 2일 동안 5% CO2를 배양한다.
    2. 11일째에 멸균된 피펫으로 세포 및 배지를 수집하고 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮김을 전달한다. RT에서 5분 동안 250 x g에서 세포를 원심분리하고 상류를 버리고 미리 온난(37°C) MNC 배지의 1 mL에서 세포를 다시 현탁시한다.
    3. 트라이판 블루로 실행 가능한 세포를 계산합니다. MNC를 미리 온난된 MNC 배지에서 밀리리터당 1 x 10 6셀의 밀도로 시드하고 37°C에서 배양하고, 3일 동안 5% CO2를 배양한다.
      참고: 일 -11에 총 셀 수가 감소할 것으로 예상됩니다.
    4. 1.4.2-1.4.3단계를 반복하고 3일 동안 세포를 배양한다.
    5. 4일째에, 1.4.2-1.4.3단계를 반복하고 3일 동안 세포를 배양한다.
      참고: 14일 의 문화가 유지된 후에도 동등하거나 더 많은 수의 MBC가 문화권에 남아 있어야 합니다.

2. SeV 감염에 의한 iNSCs에 대한 PBMC의 재프로그래밍

  1. 솔루션 및 배양 배지 준비
    1. 100 mg의 H2 O로 100 mg의 PDL을 1 mg /mL의 농도로용해시킴으로써 폴리-D-리신 (PDL) 스톡 용액을 준비합니다. 1 mL aliquots에서 -20 °C에서 보관하십시오.
    2. 0.01 N HCl의 20 mL에서 100 mg의 인슐린을 5 mg /mL의 농도로 용해시킴으로써 인슐린 스톡 솔루션을 준비하십시오. 1 mL aliquots에서 -20 °C에서 보관하십시오.
    3. iNSC 기저 배지 200 mL을 준비하려면 DMEM-F12 96 mL과 기본배지 96 mL(재료 표)를 100x 글루타민 스톡 용액 2 mL, 불필요한 아미노산 2 mL(NEAA), N2 보충제 2 mL, B27 보충제 2 mL을 결합합니다. 사용하기 전에 10 ng/mL 재조합 인간 백혈병 억제 인자, 3 μM CHIR99021 및 2 μM SB431542를 추가하십시오. 매체를 걸과 4°C에 보관합니다.
      참고: 2주 이내에 배지를 사용하십시오. 재조합 인간 백혈병 억제 인자, CHIR99021 및 SB431542를 사용하기 직전에 추가하십시오.
  2. SeV 감염에 의한 iNSCs에 대한 PBMC의 재프로그래밍
    1. 사용하기 전에 깨끗한 벤치를 자외선 살균하십시오. 75% 알코올로 모든 표면과 장비를 살균하십시오. 오토클레이브를 사용하여 모든 팁을 소독합니다.
    2. 0일째에, MNC 배지에서 세포를 수집하고 15 mL 원추형 튜브로 옮김을 전달한다. 세포를 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 상월체를 흡인하고 미리 온난 한 MNC 배지의 1 mL로 세포를 다시 일시 중단합니다.
    3. 트라이판 블루로 실행 가능한 세포를 계산합니다. 미리 온난(37°C) MNC 배지로 세포를 24웰 플레이트에서 웰당 2 x 105 세포의 농도로 재증한다.
    4. -80°C 저장에서 SeV 튜브를 제거한 후, 37°C 수조에서 SeV를 함유하는 튜브를 5-10s동안 해동한 다음 RT에서 해동하도록 합니다. 해동되면 즉시 얼음 위에 놓습니다.
    5. 인간 Klf4, Oct3/4, SOX2 및 c-MyC를 10의 감염(MOI)의 복합성으로 우물에 인코딩하는 SeV를 추가합니다. 세포의 부착을 용이하게하기 위해 30 분 동안 1,000 x g의 플레이트가있는 원심 분리지 세포. 세포와 상급판을 접시에 남겨 둡니다. 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 인큐베이터에 놓습니다.
      주의: SeV와 관련된 모든 절차는 안전 캐비닛에서 수행해야 하며, 모든 팁과 튜브는 폐기 전에 에탄올 또는 표백제로 처리되어야 합니다.
    6. 1일째에 배지 및 세포를 15 mL 원심분리기로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 한다. MNC 배지 1mL로 우물을 헹입니다. 세포 현탁액을 200 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상판을 흡인하고 24웰 플레이트에 500 μL의 신선한 미리 온난화된 MNC 배지로 세포를 다시 현탁시한다.
      참고 : PDL / 라미닌에 도금하기 전에 모든 세포의 부착을 방지하기 위해 낮은 부착 24 웰 플레이트를 사용합니다.
    7. 2일째, 1 mL의 1 mg/mL PDL을 D-PBS 19 mL로 50 μg/mL의 농도로 희석합니다. RT에서 적어도 2 시간 동안 50 μg / mL PDL로 6 웰 플레이트를 코팅하십시오.
    8. 200 μL의 0.5 mg/mL 라미닌을 D-PBS 20 mL로 5 μg/mL의 농도로 희석합니다. 6 웰 플레이트에 PDL을 흡인하고 수직 클린 벤치에서 건조시다.
    9. 5 μg/mL 라미닌으로 6웰 플레이트를 코팅하고 37°C에서 4-6시간 동안 배양합니다. 사용하기 전에 D-PBS로 씻으시고 사용하십시오.
    10. 3일째에, PL/라미닌 코팅 된 6 웰 플레이트상에서 iNSC 배지에서 2.2.6 단계에서 수득된 트랜스듀스 셀을 플레이트.
      참고: 세포가 PDL/라미닌 코팅 플레이트에 놓인 후 필요한 경우 플레이트를 부드럽게 움직여 세포의 부착을 방해하지 않도록 하십시오.
    11. 5일째에, 6웰 플레이트에 미리 온난화(37°C) iNSC 배지 1 mL을 각 웰플레이트에 부드럽게 첨가한다.
      참고 : 세포가 과감한 죽음을 겪을 것으로 예상됩니다 (>60 %).
    12. 7일째에, 6웰 플레이트에 미리 온난화(37°C) iNSC 배지 1 mL을 각 웰플레이트에 부드럽게 첨가한다.
    13. 9일째부터 28일째까지, 소비된 배지를 매일 신선한 미리 온난(37°C) iNSC 배지로 대체하십시오. iNSC 식민지의 출현을 모니터링합니다. 약 2-3주 안에 확장을 위해 iNSC 클론을 선택하고 전송합니다. 연소된 유리 파이펫을 사용하여 적절한 형태를 가진 식민지를 선택하고 오염될 가능성이 있는 세포를 제외하고 200 μL 팁으로 식민지를 흡인합니다.
      참고: 특징적인 iNSC는 한 바이알에 2-5개의 콜로니와 함께 향후 사용하기 위해 동결될 수 있습니다. 동결 배지는 혈청 프리 기저 매질 (재료표) 및 디메틸 설폭사이드를 9:1의 비율로 혼합하여 포함하며, 이는 사용 직전에 제조되어야 한다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 도파민성 뉴런에 대한 iNSC의 분화

  1. 솔루션 및 배양 배지 준비
    1. DMEM-F12 192 mL과 100x 글루타민 스톡 솔루션 2 mL, NEAA 2 mL, N2 보충제 2 mL, B27 보충제 2 mL를 결합하여 iNSC 분화 기저 배지 200 mL을 준비하십시오.
      참고: 2주 이내에 배지를 사용하십시오.
    2. iNSC 분화 단계 I 배지를 1 μM SAG1 및 100 ng/mL FGF8b로 iNSC 분화 기저 배지를 보충하여 준비한다.
      참고: 2주 이내에 배지를 사용하십시오.
    3. iNSC 분화 단계 II 배지를 0.5 mM 순환 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 0.2 mM 아스코르브산, 10 μM DAPT, 10 ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 10 ng/mL 신경질성 신경증 인자(BDNF), 10 ng/mL 신경교세포성 증분매체를 보충하여 준비 중성영양 인자(GDNF) 및 1 ng/mL 형질전환 성장 인자 βIII(TGF-βIII).
      참고: 2주 이내에 배지를 사용하십시오.
  2. 문화 요리 코팅
    1. 사용하기 전에 깨끗한 벤치를 자외선 살균하십시오. 75% 알코올로 모든 표면과 장비를 살균하십시오. 오토클레이브를 사용하여 모든 팁을 소독합니다.
    2. PDL 코팅의 경우, 세포를 다시 도금하기 최소 하루 전에 1 mL의 1 mg/mL PDL을 D-PBS 19 mL로 50 μg/mL의 농도로 희석하십시오. 24웰 플레이트에서 75%의 알코올로 살균된 12mm 유리 커버슬립을 RT에서 50 μg/mL PDL로 최소 2시간 동안 살균합니다.
    3. 라미닌 코팅의 경우, 200 μL의 0.5 mg/mL 라미닌을 20 mL의 D-PBS로 5 μg/mL의 농도로 희석합니다. PDL을 흡인하고 깨끗한 벤치에서 우물을 건조시다. 12mm 커버슬립을 5 μg/mL 라미닌으로 코팅하고 37°C에서 4-6시간 동안 배양합니다. 사용하기 전에 D-PBS로 씻으시고 사용하십시오.
  3. 분화를 위한 통로 세포.
    1. 배양된 iNSCs의 합류가 70-90%에 도달하면 배양판으로부터 배지를 흡인하고, 세포를 세척하기 위해 D-PBS의 1 mL을 추가한다. 미리 온난화 (37 °C) 세포 해리 시약(재료의 표)의1 mL를 추가하고 세포를 해리하기 위해 3 7 °C에서 37 °C에서 배양.
    2. 3 분 동안 배양 한 후, 세포는 반 부동되고있다; 잘 당 미리 온난 (37 °C) DMEM-F12 배지의 3 mL를 추가하고, 단일 세포로 세포 펠릿을 해리하기 위해 위아래로 피펫 세포를 추가합니다.
    3. 세포를 15 mL 원엽 관으로 전달하고, 250 x g에서 3 분 동안 원심 분리를 초월체를 흡인하고, 세포 수에 따라 사전 온난화 (37 °C) iNSC 배지의 적절한 부피를 가진 세포를 다시 현탁시한다.
    4. trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 셀을 계산합니다. 플레이트 5 x 103 셀 당 12 mm 유리 커버 슬립 24 웰 플레이트및 37 ° C, 5 % CO2에서 배양.
  4. iNSC를 도파민성 뉴런으로 구분합니다.
    1. PDL/라미닌 코팅 커버슬립에 세포를 재도금한 후 24시간 분화를 시작합니다. 흡배배지는, D-PBS로 세포를 한 번 세척한 다음, 미리 온화된 분화 단계 I 배지를 24웰 플레이트에 잘 1개 첨가하고37°C, 5% CO2에서 배양한다.
    2. 분화의 첫 번째 단계에서 매일 매체를 1일째부터 10일째까지 변경합니다.
    3. 10일째에 배양배지를 흡인하고, D-PBS로 세포를 1회 세척한다. 600 μL의 미리 온화 (37 °C) 분화 단계 II 배지를 24 웰 플레이트에 잘 넣고 37 °C, 5 % CO2에서 배양하십시오.
    4. 분화의 두 번째 단계에서 11일째부터 25일째까지 격일로 매체를 변경합니다. 분화 된 세포는 분석을위한 상이한 시점에서 파라 포름 알데히드에 의해 고정 될 수있다.
    5. 면역형광 염색의 경우, 분화일 11~25일 이내에 선택한 시점에서 D-PBS로 세포를 3회 부드럽게 세척한다.
    6. 피펫 300 μL의 요오닉계면활성제(표)를 PBS의 100 mL로 하여 PBS에서 0.3% 요오닉 계면활성제를 만든다.
      주의: 난모 계면활성제는 피부 접촉 및 흡입에 의해 독성이 있습니다.
    7. RT에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 10 분 동안 고정하십시오. 그런 다음 PBS에서 0.3 %로 세 번 씻으하십시오.
      주의: 파라포름알데히드는 피부 접촉과 흡입에 의해 독성이 있습니다.
    8. RT에서 2 시간 동안 3 % 당나귀 혈청으로 세포를 차단하십시오.
    9. 1%의 당나귀 혈청을 적절한 농도로 1%로 희석하고 부드럽게 삼투액을 섞는다. 24웰 플레이트의 각 웰에 1차 항체 용액의 300 μL을 첨가한다. 세포를 밤새 4°C에서 배양합니다. PBS에서 0.3% 난비계면활성제로 세포를 3회 세척한다.
    10. 이차 항체를 적절한 농도로 1% 당나귀 혈청에 희석시키고 부드럽게 삼분화하여 혼합한다. 24웰 플레이트의 각 웰에 이차 항체 용액의 300 μL을 첨가한다. RT에서 2 시간 동안 세포를 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
    11. PBS에서 0.3% 난비계면활성제로 세포를 3회 세척한다. 1:500 희석으로 PBS로 4', 6-디아미디노-2-페니린돌레(DAPI)를 희석합니다. RT에서 15 분 동안 희석 된 DAPI 300 μL로 24 웰 플레이트의 각 우물에서 세포를 배양하고 빛으로부터 보호합니다. PBS에서 0.3% 난비계면활성제로 세포를 3회 세척한다.
    12. 부드럽게 집게와 접시의 우물에서 커버 립을 꺼내. RT. 마운트에서 하룻밤 동안 형광 현미경으로 건조한 상태입니다.

4. 일방적 인 6-히록시도파민 (6-OHDA)-병변 PD 마우스 모델의 설립

  1. 세포 이식을 위한 PD 마우스 모형을 생성하기 위하여는, 6-OHDA 주입을 위한 20-25 g의 무게를 지는 성인 남성 SSCID-베이지 마우스를 이용하십시오.
  2. 수술을위한 약물의 준비
    1. 멸균 식염수 100 mL에 0.2 g의 아스코르브 산을 용해시켜 0.2 % 아스코르브 산 용액을 준비하십시오 (0.9%) 사용 전까지 -80°C에서 보관하십시오. 수술 당일, 0.2 % 아스코르브 산 용액을 10 배 희석하여 0.02 % 아스코르브 산 용액을 얻습니다.
      참고 : 아스코르브 산은 비활성 형태로 6-OHDA의 산화를 방지하기 위해 첨가됩니다.
    2. 6-OHDA 용액을 준비하려면, 살균된 1 mL 튜브에 6-OHDA의 적당량을 칭량한 다음 0.02% 아스코르브산을 첨가하여 5 μg/μL 6-OHDA 용액을 만듭니다. 혼합물이 용해될 때까지 소용돌이. 6-OHDA를 얼음 위에 놓고 사용할 때까지 놓습니다.
      참고 : 6-OHDA는 온도와 빛에 민감합니다. 사용 전에 용액을 빛으로부터 보호하고 얼음에 보관하십시오.
  3. 수술 전에 오토클레이브를 통해 멸균 수술 장비를 준비하십시오. 스테레오택 프레임을 설정할 때 에탄올로 모든 장비와 표면을 청소하십시오. 가열 램프 아래에 마우스 복구 케이지를 설정합니다.
  4. 일방적인 6-OHDA 병변 마우스 모델을 확립하기 위해 수술을 실시합니다.
    1. 각 마우스의 무게를 측정하고 체중을 기록하고 투여해야 하는 약물의 양을 계산합니다. 각 마우스는 0.5 mg/kg 아트로핀을 20분 전에 받습니다. 80 mg/kg 케타민과 10 mg/kg 자일라진으로 마우스를 마취시다.
    2. 관리 0.5 복 강 내 주입에 의해 mg/kg 아트로핀.
    3. 80 mg/kg 케타민과 10 mg/kg 자일라진으로 마우스를 복강 내 주사로 20 분 후에 마취시다.
    4. 닫힌 챔버에 마우스를 넣습니다. 3-5 분 후, 마우스는 뒷다리 핀치에 대한 반응없이 깊이 마취됩니다.
      참고 : 마취를 받은 마우스는 흥분 기간을 경험할 것으로 예상됩니다.
    5. 마우스의 머리를 면도하고 각막 궤양 개발로부터 보호하기 위해 마우스의 눈에 에리스로 마이신 눈 연고를 적용합니다.
    6. 마우스를 입체 전지 장치에 놓습니다. 먼저 절개 막대로 마우스를 수정합니다. 이어컵을 올바르게 삽입하여 마우스 헤드를 평평하고 안전한 위치에 놓습니다.
    7. 포비돈의 요오드와 이소프로필 알코올로 마우스의 머리를 살균하십시오. 메스 블레이드로 머리 피부에 시상 절개 (~ 1.5 cm)를 잘라 두개골을 노출. 앞니바와 이어바를 조정하여 브레그마와 람다의 높이 차이를 0.1mm 미만으로 줄입니다.
      참고 : 마우스 bregma는 관상 동맥 과 시상 봉합의 교차점에 위치하고, 람다 람도이드와 시상 봉합의 교차점에 있습니다.
    8. 천천히 이동하고 bregma쪽으로 바늘의 끝을 낮추고 제로 포인트로 bregma를 취급합니다. 팁을 bregma에 비해 A/P +0.5mm, M/L-2.1mm의 좌표가 있는 위치로 이동합니다. 팁을 철회하고 점을 표시합니다. 두개골에 약간의 구멍을 뚫어 보라고 합니다.
    9. 마이크로 시링게(재료표)에 5 μg / μL 6-OHDA 용액 2 μL을 추출합니다. 바늘을 표시된 지점으로 되돌리고 바늘을 D/V -3.2 mm에 삽입합니다.
    10. 2 μL 의 5 μg/μL 6-OHDA 용액 (총 10 μg)을 1 μL / min의 속도로 주입하십시오. 6-OHDA 주사가 완료된 후, 바늘을 5분 더 제자리에 둡니다. 그런 다음 주사 바늘을 천천히 철회하십시오.
    11. 봉합사로 절개를 닫고 마우스의 눈에 에리스로 마이신 눈 연고를 적용하십시오. 탈수를 방지하기 위해 피하적으로 0.5 mL 식염수를 전달하고, 봉합 된 피부에 직접 항생제 연고를 적용하십시오.
    12. 스테레오택시 장치에서 마우스를 제거하고 복구 케이지에 넣습니다. 마우스를 다시 넣고 의식이 회복 될 때까지 음식과 물에 액세스 할 수 있습니다. 매일 식수에서 진통제로 마우스를 치료 2-3 일 동안 수술 후, 이부프로펜의 권장 복용량은 0.03 하루 체중의 mg/g.
    13. 매일 수술 후 마우스를 검사합니다.

5. 일방적 인 6-OHDA 병변 후 행동 평가

  1. 수술 후 2~3주, PD 증상을 추정하기 위한 행동 평가를 실시한다. 각 마우스의 무게, 자신의 무게를 기록하고 투여해야 하는 약물의 양을 계산 (0.5 mg / kg 아포모르핀 평가 하기 전에).
  2. 평가 하기 전에 피하 주입에 의해 0.5 mg/kg 아포몰핀을 관리하고 유리 실린더에 마우스를 놓습니다.
  3. 5 분 습관 기간 후, 분당 병변 측에 대한 반대 측 및 동측 회전의 수를 계산하고 비디오 카메라로 자신의 활동을 기록합니다.
  4. 반대측 에서 원소 측삭 회전을 뺀 마우스 >7 rpm/min은 성공적으로 병변으로 간주되고 세포 이식 실험의 후보로 선택됩니다. 30 분 휴식 후 하우징 케이지에 마우스를 반환합니다.
    참고: 마우스가 성공적으로 병변된 경우, 6-OHDA 주입 마우스는 DA 주작동근이 주로 병변 측의 초민감성 변질식 줄무늬를 활성화하기 때문에 반대측쪽으로 돌리는 데 더 큰 편향을 보일 것이다.
  5. 세포 이식 1주일 전과 2, 4, 6, 8, 12, 16주 전에 행동 평가를 실시한다.

6. DA 전구체의 세포 이식

  1. 이식을 위한 세포 현탁액을 준비하십시오. 세포 생착의 경우, D10 및 D13 DA 전구체에 혼합된 2 x 105 DA 전구체를 이식 완충액의 균형 잡힌 염용액(재료 표)에서 5 g L-1 포도당의 4 μL에서 1:7의 비율로 중단합니다.
  2. 6-OHDA가 DA 전구체 세포 현탁액 또는 완충액으로 대체된다는 점을 제외하고는 섹션 4.4에 기재된 절차에 따라 세포 이식 수술을 수행한다.
  3. 5항에 기재된 절차에 따라 DA 전구체의 세포 이식 후 행동 평가 2, 4, 6, 8, 12, 16주를 수행한다. 분당 병변 측에 상대적인 아포모르핀 유도 된 반대 측 회전의 수를 계산하고 비디오 카메라로 자신의 활동을 기록합니다.
    참고 : 이식 후, 반대 측 회전의 감소 속도는 향상된 운동 기능을 제안한다.
  4. 세포 이식 후 4, 8, 12 및 16 주에서 마우스의 몸이 뻣뻣해지고 마우스의 간이 창백해질 때까지 4 % 파라 포름 알데히드로 깊은 마취 하에 마우스를 정성합니다.
  5. 마우스의 뇌를 부드럽게 분리하고 밤새 4°C에서 4% 파라포름알데히드에 뇌를 넣습니다.
  6. 둘째 날에는 뇌가 바닥으로 가라앉을 때까지 탈수증을 위해 뇌를 30% 자당에 넣습니다.
  7. 동결 마이크로토메를 사용하여 40 μm 두께로 뇌를 슬라이스합니다.
  8. 단계 3.4.5-3.4.12에서 설명한 바와 같이 면역 염색을 수행합니다.

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결과

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여기에서, 우리는 PD 모형을 취급하기 위하여 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 보고합니다. 첫째, PBMC는 분리되고 확장되었고, SeV 감염에 의해 iNSC로 다시 프로그래밍하였다. PBMNC 확장 및 iNSC 유도를 가진 절차의 개략적 표현은 그림1에 나와 있습니다. 14일째에, PBMMC는 밀도 그라데이션 배지(재료표)를 이용하여 단리되었다. 원심분리 전에, PBS및 밀도 구배 배지로 희석된 혈액을 2개의 층으로 분리하였다. 원심 분리 후, 4 개의 구배 층이 나타났다 (아래에서 위로): 아래층은 과립구와 적혈구를 포함; 두 번째 층은 밀도 그라데이션 매체를 포함; 세 번째는 PBMC (빨간색 화살표)를 포함; 상부 층에는 혈소판이 풍부한 혈강이 포함되어 있습니다 (그림2A). 14일간의 팽창 후, PBMNCs는 0일째로서 SeV에...

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토론

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여기에서 우리는 PD 모형을 위한 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 제출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 양상은 다음과 같습니다: (1) SEV 감염에 의한 PBMC의 분리 및 확장 및 INCCs로의 재프로그래밍, (2) DA 뉴런에 대한 iNCCs의 분화, (3) 일방적인 6-OHDA 병변 PD 마우스 모델 및 행동 평가, (4) DA 전구체 및 행동 평가의 세포 이식.

이 프로토콜에서 첫 번째 부분은 우선적으로 적혈구증을 확장하고 림프구 증식을 지원하지 않는 혈청이없는 배지 (MNC 배지)에서 PBMNC를 수집하고 확장하는 것을 포함합니다. 이전 연구에서는, 몇몇 체세포 모형이 iPSCs 또는 iNSCs12,13,14로다시 프로그램되었습니다. 체세포의 다른 유형과 비교하여, PBMMC는 ...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 사업은 줄기세포 및 번역 국가핵심프로젝트(2016YFA0101403), 중국국립자연과학재단(81661130160, 81422014, 81561138004), 베이징시 자연과학재단(5142005), 베이징 인재재단(2017000021223TD03), 제13차 5개년 계획(CIT 및 TCD20180333), 베이징 의료시스템 고급인재상(2015-3-063), 베이징시 립대학 고위교사 지원사업 시 보건위원회 기금(PXM 2018_026283_000002), 베이징 백, 천, 만 인재 기금 (2018A03), 베이징 시 립 행정 특별 기금 지원 (ZYLX201706), 및 로얄 소사이어티-뉴턴 고급 펠로우십 (NA150482).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15-ml 원뿔형 튜브Corning430052
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145흡입 및 피부 접촉에 독성
24-웰 플레이트Corning3337
50-ml 원뿔형 튜브 Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6-well plateCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01세포 해리 시약
ApomorphineSigma-AldrichA4393
Ascorbic acidSigma-AldrichA92902피부 접촉에 독성이 있음 
B27 보충제 Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02뇌 유래 신경 영양 인자
헤파린 나트륨BD367871
BSAyisheng36106es60태아 혈청
cAMPSigma-AldrichD0627Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2ZENOAQ100mlPBMNC의 동결 매체로 사용
화학적으로 정의된 지질 농축액Invitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
CoverslipFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
덱사메타손시그마-알드리치D2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
당나귀 혈청잭슨017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UG인간 에리트로포이에틴
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque 프리미엄GE 헬스케어17-5442-02P=1.077, 밀도 구배 매체
GDNFPeprotech450-10Glial 유래 신경 영양 인자
GlutaMAXInvitrogen21051024100 × 글루타민 원액
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Balanced Salt 용액
인간 백혈병 억제 인자MillporeLIF1010
Human recombinant SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGHuman insulin-like growth 요인 
IL-3Peprotech200-03-10UG인간 인터루킨 3
IMDMGibco215056-023Iscove의 변형된 Dulbecco의 매체
인슐린Roche 
ITS-XInvitrogen51500-056인슐린-트랜스페린-셀레늄-X 보충제
Knockout 세럼 교체용Gibco10828028세럼 프리 베이스 미디엄
라미닌로슈;
MicrosyringeHamilton7653-01
N2 보충제 Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Non-essential 아미노산
NeurobasalGibco10888기본 매체
PDL시그마 - 알드리치P7280폴리 -D- 라이신
SAG1엔조ALX-270-426-M01
SB431542유전자 작동04-0010-10mg-20에서 빛에서 저장?
센다이 바이러스Life TechnologiesMAN0009378
Sucrosebaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36E혁신 성장 인자  β?
트랜스페린R & D 시스템2914-HT-100G
트리톤 X 100바이아오셩케비이온성 계면활성제
트리판 블루GibcoT10282
자일라진시그마-알드리치X1126
이 있습니다. 1258501411243217001

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