이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.
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방법 논문
말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화
이 논문에서
요약
초록
파킨슨병(PD)은 복부 메센팔론(VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트카(SNpc)에서 도파민성(DA) 뉴런의 변성에 의해 유발된다. 세포 대체 요법은 PD의 치료에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 최근, 유도 신경 줄기 세포 (iNSCs)는 종양 형성의 감소 위험과 가소성으로 인해 세포 대체 요법의 잠재적 인 후보로 부상했다. 지역별 뉴런및 신경교세포. iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs) 및 세포의 각종 그밖 모형과 같은 자가 체세포 근원에서 재프로그래밍될 수 있습니다. 체세포의 다른 유형과 비교하여, PBMCMC는 배양에서 접근하고 확장하기 쉽기 때문에 매력적인 스타터 세포 유형입니다. 센다이 바이러스(SeV)는 RNA 비통합 바이러스로, 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함한 재프로그래밍 인자를 인코딩하여, 통합되지 않는 부정적인 감각, 단일 가닥, 비분별 게놈을 가지고 있습니다. 호스트 게놈, 그러나 감염된 세포의 세포질에서만 복제, 재프로그래밍을 위한 효율적이고 안전한 차량을 제안하. 이 연구에서는, 우리는 iNSC가 PBMNCs를 다시 프로그래밍하여 얻어지고, 2단계 방법에 의해 전문화된 VM DA 뉴런으로 분화되는 프로토콜을 기술한다. 이어서 DA 전구체는 PD의 치료에 대한 안전성 및 효능을 평가하기 위해 일방적으로 6-히록시도파민(6-OHDA) 병변형 PD 마우스 모델로 이식된다. 이 방법은 생체외 및 생체 내에서 환자 특이적 DA 신경 세포의 기능 및 치료 효과를 조사하는 플랫폼을 제공한다.
서론
파킨슨 병 (PD)은 복부 메센셀론 (VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트 (SNpc)에서 도파민성 (DA) 뉴런의 퇴화로 인한 일반적인 신경 퇴행성 질환으로, 60 세 이상의 인구에서 1 % 이상의 유병률을 가지고 있습니다. 1개 , 2. 지난 10 년 동안 퇴행성 또는 손상된 세포를 대체하거나 퇴행성 뉴런 주변의 미세 환경을 영양화하기위한 세포치료는 PD 3의 치료에 잠재력을 보여주었습니다. 한편, 리프로그래밍 기술은 대체요법을 위한 유망한 세포 공급원을 제공하는 4. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs) 및 배아 줄기 세포(ESCs)는 쥐및 비인간 영장류 PD 모델로 이식할 때 생존, 교화 및 모터 기능을 개선할 수 있는 DA 신경 세포로 분화할 수 있는 것으로 입증되었습니다5 ,6,7,8. iPSCs는 세포 재프로그래밍 기술의 이정표를 나타내며 세포 이식에 큰 잠재....
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프로토콜
모든 절차는 제도적 인간연구윤리위원회의 지침을 따라야 한다. 통보된 동의는 혈액 수집 전에 환자 또는 건강한 지원자로부터 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 동물의 관리 및 사용에 대한 기관의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. PBMC의 수집, 격리 및 확장
- PBMC의 컬렉션
- 헤파린 방부제 바이알을 사용하여 기증자의 말초 정맥 혈액 10-20 mL을 수집합니다.
참고: 혈액 샘플은 실온(RT)에서 보관하거나 배송해야 합니다. 24 시간 이내에 혈액 샘플을 처리합니다.
- 헤파린 방부제 바이알을 사용하여 기증자의 말초 정맥 혈액 10-20 mL을 수집합니다.
- 배양 배지의 준비
- 세럼 프리 배지(SFM)를 준비하여 이스코브의 변형된 덜베코 배지(IMDM), 햄 F-12 240 mL, 인슐린 트랜스퍼린 셀레늄-X 보충제 5mL(ITS-X), 100x 글루타민 스톡 용액 5mL(테이블 재료),화학적으로 정의된 지질 농축액 5 mL, 태아 소 혈청 2.5 g, 아스코르브산 0.025 g 및 1 티오글리세롤 9 μL. 매체를 걸과 4°C에 보관합니다.
주의: 아스코르브산과 1-티오글리세롤은 피부 접촉과 흡입에 의....
- 세럼 프리 배지(SFM)를 준비하여 이스코브의 변형된 덜베코 배지(IMDM), 햄 F-12 240 mL, 인슐린 트랜스퍼린 셀레늄-X 보충제 5mL(ITS-X), 100x 글루타민 스톡 용액 5mL(테이블 재료),화학적으로 정의된 지질 농축액 5 mL, 태아 소 혈청 2.5 g, 아스코르브산 0.025 g 및 1 티오글리세롤 9 μL. 매체를 걸과 4°C에 보관합니다.
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결과
여기에서, 우리는 PD 모형을 취급하기 위하여 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 보고합니다. 첫째, PBMC는 분리되고 확장되었고, SeV 감염에 의해 iNSC로 다시 프로그래밍하였다. PBMNC 확장 및 iNSC 유도를 가진 절차의 개략적 표현은 그림1에 나와 있습니다. 14일째에, PBMMC는 밀도 그라데이션 배지(재료표)를 이용하여 단리되었다. 원심분리 전에, PBS및 밀도 구배 배지로 희석된 혈액을 2개의 층으로 분리하였다. 원심 분리 후, 4 개의 구배 층이 나타났다 (아래에서 위로): 아래층은 과립구와 적혈구를 포함; 두 번째 층은 밀도 그라데이션 매체를 포함; 세 번째는 PBMC (빨간색 화살표)를 포함; 상부 층에는 혈소판이 풍부한 혈강이 포함되어 있습니다 (그림2A). 14일간의 팽창 후, PBMNCs는 0일째로서 SeV에.......
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토론
여기에서 우리는 PD 모형을 위한 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 제출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 양상은 다음과 같습니다: (1) SEV 감염에 의한 PBMC의 분리 및 확장 및 INCCs로의 재프로그래밍, (2) DA 뉴런에 대한 iNCCs의 분화, (3) 일방적인 6-OHDA 병변 PD 마우스 모델 및 행동 평가, (4) DA 전구체 및 행동 평가의 세포 이식.
이 프로토콜에서 첫 번째 부분은 우선적으로 적혈구증을 확장하고 림프구 증식을 지원하지 않는 혈청이없는 배지 (MNC 배지)에서 PBMNC를 수집하고 확장하는 것을 포함합니다. 이전 연구에서는, 몇몇 체세포 모형이 iPSCs 또는 iNSCs12,13,14로다시 프로그램되었습니다. 체세포의 다른 유형과 비교하여, PBMMC는 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 사업은 줄기세포 및 번역 국가핵심프로젝트(2016YFA0101403), 중국국립자연과학재단(81661130160, 81422014, 81561138004), 베이징시 자연과학재단(5142005), 베이징 인재재단(2017000021223TD03), 제13차 5개년 계획(CIT 및 TCD20180333), 베이징 의료시스템 고급인재상(2015-3-063), 베이징시 립대학 고위교사 지원사업 시 보건위원회 기금(PXM 2018_026283_000002), 베이징 백, 천, 만 인재 기금 (2018A03), 베이징 시 립 행정 특별 기금 지원 (ZYLX201706), 및 로얄 소사이어티-뉴턴 고급 펠로우십 (NA150482).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15-ml 원뿔형 튜브 | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | 흡입 및 피부 접촉에 독성 |
| 24-웰 플레이트 | Corning | 3337 | |
| 50-ml 원뿔형 튜브 | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | 세포 해리 시약 |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | 피부 접촉에 독성이 있음 |
| B27 보충제 | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 뇌 유래 신경 영양 인자 |
| 헤파린 나트륨 | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | 태아 혈청 |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | PBMNC의 동결 매체로 사용 |
| 화학적으로 정의된 지질 농축액 | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| 당나귀 혈청 | 잭슨 | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | 인간 에리트로포이에틴 |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque 프리미엄 | GE 헬스케어 | 17-5442-02 | P=1.077, 밀도 구배 매체 |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial 유래 신경 영양 인자 |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × 글루타민 원액 |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced Salt 용액 |
| 인간 백혈병 억제 인자 | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth 요인 |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | 인간 인터루킨 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove의 변형된 Dulbecco의 매체 |
| 인슐린 | Roche | ||
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | 인슐린-트랜스페린-셀레늄-X 보충제 |
| Knockout 세럼 교체용 | Gibco | 10828028 | 세럼 프리 베이스 미디엄 |
| 라미닌 | 로슈; | ||
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 보충제 | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential 아미노산 |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | 기본 매체 |
| PDL | 시그마 - 알드리치 | P7280 | 폴리 -D- 라이신 |
| SAG1 | 엔조 | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | 유전자 작동 | 04-0010-10mg | -20에서 빛에서 저장? |
| 센다이 바이러스 | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | 혁신 성장 인자 β? |
| 트랜스페린 | R & D 시스템 | 2914-HT-100G | |
| 트리톤 X 100 | 바이아오셩케 | 비이온성 계면활성제 | |
| 트리판 블루 | Gibco | T10282 | |
| 자일라진 | 시그마-알드리치 | X1126 |
참고문헌
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to m....
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재인쇄 및 허가
