방법 논문

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

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DOI:

10.3791/59721

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2019년 6월 8일

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1Center for Genetic Medicine, Children's National Health System, 2Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 3Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Neurology, University of California San Francisco, 5DIPG Centre of Expertise Zurich, Universitats-Kinderspital Zurich

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

초록

선행 및 반복 외과 조직 샘플링과 관련되었던 합병증은 치료에 종양 반응의 분자 하위 분류 및 시간적 모니터링이 가능한 최소 침습 적 플랫폼에 대한 필요성을 제시한다. 여기에서, 우리는 세포 자유로운 DNA (cfDNA)에 있는 종양 체세포 돌연변이의 검출을 위한 우리의 dPCR 기지를 둔 방법을 기술합니다, 참을성 있는 생체 유체에서 쉽게 이용 가능. 각 분석법에서 시험될 수 있는 돌연변이의 수는 제한적이지만, 이 방법은 높은 수준의 민감도 및 특이성을 제공한다. MAF에 의해 계산된 돌연변이 풍부의 감시는, 치료에 종양 반응의 평가를 허용하고, 방사선 사진 화상 진찰에 많이 필요한 보충을 제공하.

서론

분자 분석을 위한 종양 조직의 가용성의 한계로 인해, 혈장, 혈청 및 뇌척수액(CSF)을 포함한 환자 생체 유체에서 종양 체세포 돌연변이를 검출할 수 있는 매우 민감한 방법의 개발이 필요합니다. . 예를 들면, 소아 확산 미드라인 신경교종 (DMGs)는 그들의 신경 해부학적인 위치 때문에 도전을 제출합니다. 지난 10 년 동안, DMG 조직 표본의 분자 프로파일링은이 종양 유형 1에서 드라이버 돌연변이를 발견하고 돌연변이의 공간적 및 시간적 이질성을 밝혀, 질병 내에서 환자를 특성화하는 데 필요한 생검을 만들기 서브 그룹 및 분자 표적치료를 촉진 2. 이와 같이, 임상 시험은 선행 진단 3,4,5,6에서종양 분자 프로파일링을 위한 외과 생검을 통합하기 위한 옹호합니다. 치료 중, DMg에서 치료 반응의 모니터링은 MRI로 제한됩니다, 이는 작은 변화 또는 종양 게놈 진화를 감지하는 감도 부족. MRI는 또한 화상 진찰에 참된 진행을 모방하고 종양 반응7의 해석을 잘못 알릴 수있는 종양의 사이트에 의사 진행, 일시적인 염증을 검출하는 경향이 있습니다. 따라서, DMGs는 종양 돌연변이를 검출하고 임상 반응을 모니터링하는 대안, 최소 침습적 수단에 대한 높은 필요성을 가진 종양 유형을 나타낸다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 중질 질라8을 가진 아이들의 혈장, 혈청 및 CSF에서 cfDNA에 있는 종양 돌연변이를 검출하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발하고 최적화했습니다. 어린 시절 DMGs를 자주 감안할 때 (>80%) 히스톤 변이체 H3.1(H3.1K27M, 20%의 경우) 또는 H3.3(H3.3K27M, 60%의 경우)의 위치에서 체세포 리신-메티오닌 돌연변이를 항만1,이들 및 기타 DMGs의 특징(즉, ACVR1, PIK3R1)을표적으로 하였다. cfDNA8을사용하여 돌연변이 알레일 정량화. 이 분석은 서열 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 다른 종양 유형에서 핫스팟 돌연변이를 검출하도록 맞춤화될 수 있다. 이 접근의 다양성은 cfDNA 기지를 둔 진단 공구 및 치료 감시의 통합에서 유익할 암의 다양한에 적용합니다.

cfDNA에서 낮은 말기 유전자 순도 돌연변이를 민감하게 검출하기 위해, 우리는 액적 디지털 PCR (dPCR) 기반 접근법을 사용합니다. 이 방법에서, PCR 반응 혼합물은 dPCR 플랫폼(예를 들어, RainDance)을 사용하여 이론상 최대 1,000만 방울로 분할되고, PCR당 7-9백만 방울은 일반적으로 실험적으로 잘 볼 수 있다. 높은 수준의 샘플 분할로 인해, 각 액적에 1~2개의 DNA 분자만 존재할 수 있다. PCR 증폭 및 서열별 형광 프로브 혼성화는 각 액적에서 발생할 수 있으며, 따라서 수백만 개의 반응이 일어난다. 이것은 감도를 최대화하고 그렇지 않으면 야생형 DNA의 배경에 대하여 검출되지 않을 지도 모르다 희소한 돌연변이 대틀기의 탐지를 가능하게 합니다. 잠긴 핵산(LNA) 프로브의 활용은 불일치 혼성화를 제한하고정확한 돌연변이 검출9,10,11을지원함으로써 분석의 특이성을 향상시킨다. 여기에서는 시료 처리, cfDNA 추출, 표적 대금 류의 사전 증폭, dPCR 및 데이터 분석 방법을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 샌프란시스코 대학교의 기관 검토 위원회(캘리포니아 주 샌프란시스코) 승인되었습니다. IRB #14-13895) 및 어린이 국립 보건 시스템 (워싱턴 D.C.; IRB #1339). 표본은 환자 또는 환자의 보호자로부터 통보된 동의를 얻은 후에 수집되고 연구되었습니다.

1. 생물학적 표본의 수집 및 저장을 위한 IRB 프로토콜에 따라 환자에 대한 동의

  1. 각 환자 또는 환자의 보호자로부터 서면 통보된 동의를 얻은 후 환자 샘플을 수집하여 임상 시험에 참여하거나 각 기관 검토 위원회의 승인을 받은 생물 저장소에 참여합니다.
    1. 본 연구에 포함된 환자는 뇌종양을 방사선촬영으로 진단받았다. 제외 기준이 사용되지 않았습니다. 표본은 환자 또는 환자의 보호자로부터 통보된 동의를 얻은 후에 수집되고 연구되었습니다.

2. 혈장 또는 혈청의 혈액 수집 및 분리

  1. 10.0 mL 을 사용하여 혈액 샘플을 채취튜브로 채취한다. 혈장 혈액을 수집하는경우 K2 - 또는 K3-EDTA 튜브, 헤파린 또는 cfDNA 혈액 수집 튜브를 사용하십시오. 혈청에 대한 혈액을 수집하는 경우, 혈전 활성제와 젤을 포함하는 젤 장벽 튜브를 사용하여 세럼을 분리하십시오.
    참고: 복제 실험을 활성화하려면 10mL를 권장하지만 최소 3mL로 충분합니다.
  2. 수집 튜브를 10회 조심스럽게 반전하여 혈액 샘플을 수집 튜브 시약과 혼합합니다.
  3. 혈청이 실온에서 30 분 동안 수집될 혈액 샘플을 남겨 두어 혈액이 응고될 수 있도록하십시오. 혈장을 얻기 위해 혈액을 처리하는 경우, 즉시 2.4 단계로 진행한다.
    참고: 플라즈마를 위해 처리되는 샘플은 원심분리 전에 최대 2시간 동안 얼음 위에 보관될 수 있다. 그러나, 혈액 무승부에서 처리로의 급속한 전환은 cfDNA 저하를 최소화합니다.
  4. 원심분리기 혈액 수집 튜브를 2,000 x g에서 15분 동안 원심분리기에서 4°C로 설정하여 백색 및 적혈구 층으로부터 혈장 또는 혈청을 분리한다.
  5. 백혈구 층 (혈장 / 혈청 층과 포장 된 적혈구의 하부 층 사이의 얇은 선을 형성하는) 혈액 세포를 방해하지 않도록주의, 파이펫 플라즈마 / 혈청의 상단 층 (이는 명확 할 수있다, 노란색, 또는 색상 핑크) 동등하게 1 mL aliquots 멸균 폴리프로필렌 스크류 캡 극저온으로.
  6. 피험자 식별 번호, 시편 유형(플라즈마 또는 혈청) 및 수집 날짜를 저온 라벨에 기록합니다.
  7. 사용 전까지 -80°C 냉동실에 저온 극저온을 보관하십시오. -80°C 냉동고를 사용할 수 없는 경우, 샘플을 -20°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.

3. CSF 수집 및 처리

  1. 션트, 요추 천자 또는 수술에서 CSF를 수집합니다.
    참고: 이러한 절차는 임상의가 필요하다고 판단하는 경우에만 수행되어야합니다. 임상 사용에 필요한 그 이상의 추가 샘플 연구 목적을 위해 사용할 수 있습니다.
  2. 수집 된 CSF의 볼륨을 측정하고 색상 (피 묻은, 노란색, 명확한)을 기록합니다.
  3. 수집 튜브를 10,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 포동포동한 이물질을 펠렛한다.
  4. 500 μL aliquots에서 CSF 상급체를 폴리프로필렌 스크류 캡 cryovials로 동등하게 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮기자.
  5. 피험자 식별 번호, 표본 유형 및 표본 수집 날짜를 cryovials 라벨에 기록합니다. 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

4. 액체 견본에서 cfDNA의 추출

  1. cfDNA 추출 키트 핸드북12의지침에 따라 cfDNA 추출 프로토콜을 수행합니다.
    1. 10% 표백제와 70% 에탄올로 벤치 공간과 장비를 청소하십시오.
      참고: 프로토콜의 모든 단계에서 PCR 후드의 사용, 장갑의 정기적 인 변경 및 10 % 표백제 와 70 % 에탄올벤치 공간 및 장비의 빈번한 오염 제거는 샘플 오염을 방지하는 것이 중요합니다.
    2. 교차 오염을 방지하기 위해 추출 키트에서 세척 버퍼와 같은 시약의 aliquots를 준비합니다.
  2. 추출을 시작하기 전에 얼음에 환자 샘플을 해동. 플라즈마/혈청의 경우, 샘플의 1 mL aliquot를 해동합니다. CSF의 경우, 샘플의 500 μL aliquot를 해동합니다.
    참고: 추출 프로토콜의 용해 단계(4.5-4.8)는 혈장/혈청과 CSF 간에 다르지만, 4.9단계 이후부터 는 두 종류의 생체 유체모두에 대해 프로토콜이 동일하다.
  3. 용해 단계(4.6) 동안 사용하기 위해 가열 블록을 60°C로 설정한다.
  4. 12개 샘플당 5.6 μL의 담체 RNA 및 0.9 mL의 라시스 버퍼를 첨가하여 15 mL 튜브에 라시스 완충액 및 담체 RNA 혼합물을 준비한다.
  5. 혈장/혈청의 경우, 표지된 2.0 mL 튜브에 4.4단계에서 제조된 용해 완충/담체 RNA 혼합물 100 μL, 1 mL의 샘플 및 0.8 mL의 용해 버퍼/담체 RNA 혼합물을 추가합니다. 고속12에서30 s에 대 한 펄스 소용돌이에 의해 혼합.
    1. CSF의 경우, 시료의 125 μL proteinasase K, 500 μL, 용해 완충/담체 RNA 혼합물 1 mL, 250 μL 조직 용해 완충호를 2.0 mL 튜브에 추가합니다. 1x 인산완식염수(PBS)의 125 μL을 추가하여 최대 2 mL까지 전체 부피를 가져옵니다. 고속12에서30 s에 대 한 펄스 소용돌이에 의해 혼합.
  6. 가열 블록(12)에서 60°C에서 30분동안 샘플을 인큐베이트한다.
  7. 가열 블록에서 샘플을 제거하고 온도를 56 °C로 낮춥시다. 샘플을 벤치로 되돌리고 매서를 라벨이 붙은 새로운 15mL 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 넣습니다.
  8. 플라즈마/혈청의 경우, 1.8 mL의 핵산 결합 버퍼와 펄스 와류12에의해 30s믹스를 추가합니다.
    1. CSF의 경우, 3.6 mL의 핵산 결합 버퍼를 추가하고 펄스 와류12에의해 30 s용으로 혼합합니다.
  9. 얼음12에5 분 동안 인큐베이션 샘플.
  10. 열을 진공 커넥터에 삽입합니다. 컬럼을 열고 20 mL 튜브 익스텐더를 컬럼(12)에 삽입합니다.
  11. 15 mL 튜브의 내용물파이프 익스텐더의 바닥에 직접 파이펫을 하여 튜브 익스텐더의 벽에 물방울을 남기지 않도록 합니다.
  12. 진공 커넥터의 스위치를 닫은 후 진공 펌프를 켭타. 압력이 900mbar로 구축되면 진공 커넥터의 밸브를 엽니다. 이제 샘플이 열을 통해 흐르게 됩니다.
  13. 모든 용해기가 컬럼에서 배출되면 펌프를 끄고 트랩도어를 진공 커넥터로 열어 압력 구배를 완화합니다. 압력이 0mbar에 도달하면 진공 커넥터와 트랩도어의 밸브를 닫습니다.
  14. 20mL 튜브 익스텐더를 제거하여 시료를 교차 오염시킬 수 있기 때문에 한 열의 익스텐더를 인접한 컬럼위로 전달하지 않도록 주의하십시오. 튜브 익스텐더를 폐기합니다.
  15. 열(12)에 첫 번째 세척버퍼의 600 μL을 추가합니다.
  16. 튜브 뚜껑을 열고 진공 펌프를 켭니다. 압력 게이지가 900mbar에 도달하면 진공 커넥터의 스위치를 열린 위치로 돌려 열을 통해 세척 버퍼를 그립니다.
  17. 진공 펌프를 끄고 트랩도어를 열어 압력을 해제하고 압력을 0 mbar로 완화합니다. 진공 커넥터의 밸브를 닫힌 위치로 돌립니다.
  18. 열에 750 μL의 두 번째 세척 버퍼를 추가하고 4.16-4.1712단계를 반복합니다.
  19. 기둥에 MB 등급 에탄올 750 μL을 추가하고 4.16-4.1712단계를 반복합니다.
  20. 기둥의 뚜껑을 닫고 컬럼을 새 2.0mL 컬렉션 튜브 안에 넣습니다. 진공커넥터(12)를폐기합니다.
  21. 실온12에서3 분 동안 20,000 x g의 컬럼으로 튜브를 원심 분리합니다.
  22. 컬럼을 새 컬렉션 튜브에 넣고 튜브 뚜껑을 엽니다. 실험실 조직을 위에 놓고 56 °C에서 10 분12동안 배양하십시오.
  23. 컬럼을 깨끗한 1.5 mL PCR 클린 튜브및 파이펫 100 μL의 용출 완충제(또는 분자 생물학 등급 H2O(MB H2O)))에 직접 컬럼의 중앙에 놓습니다. 파이펫 팁으로 컬럼을 만지지 마십시오. 뚜껑을 닫고 실온에서 3분 동안 그대로 둡니다.
  24. cfDNA12를용해시키기 위해 실온에서 20,000 x g의 원심분리기.
  25. 용활을 다시 컬럼으로 파이펫하고 실온에서 3 분 동안 배양합니다.
  26. 원심분리를 최고 속도로 1분 간 반복하여 cfDNA를 두 번째로 용해하여 수율을 높입니다(제조업체의 권장 사항에 따라).
  27. 라벨이 부착된 DNase/RNase 프리 PCR 클린 튜브에 cfDNA를 4°C로 저장하거나 5단계로 직접 진행합니다.

5. cfDNA의 진공 농도

  1. 용출된 cfDNA가 함유된 튜브를 진공 농축기의 홀더에 삽입하고 균형을 맞추십시오. 튜브 뚜껑을 엽니다. 진공 농축기의 온도를 23°C로 설정합니다.
  2. 진공 농축기의 켜기, 다음 증기 트랩을 켭니다. 40 분 동안 또는 10.5-11 μL의 최종 부피에 도달 할 때까지 원심 분리기 샘플.
    1. 부피가 10.5 μL 미만이면 DNA 현탁액 버퍼 또는 MBH2O를 추가하여 최종 부피 10.5 μL에 도달합니다.
  3. 튜브 의 벽을 따라 전체 볼륨을 파이펫 잔여 DNA 조각을 제거합니다.
  4. 테이블 탑 원심분리기에서 샘플을 간략하게 원심분리하여 튜브 벽에 방울을 수집합니다.
  5. 전암화 단계(단계 8)로 직접 진행하거나 샘플을 4°C에서 저장합니다.
    1. 나중에 사용하기 위해 보관하는 경우 오염을 피하기 위해 실험실 필름에 튜브 뚜껑을 감쌉니다.

6. 프라이머 및 프로브의 설계 및 준비

  1. 관심 대상에 대해 전진 및 역프라이머, 야생형 및 돌연변이 LNA 프로브를 설계합니다. 상업적으로 동질성 프라이머 및 프로브를 주문합니다(재료 표 참조).
    참고: H3F3A p.K27M 및 소아 미드라인 글리오마에 대한 기타 표적 돌연변이를 대상으로 하는 프라이머 및 프로브에 대한 서열은 판디타라트나 외, 20188의보충표 3에서 확인할 수 있다.
  2. 효용화 프라이머 및 프로브를 열기 전에 튜브를 잠시 원심 분리합니다. 제품 사양 시트에 언급된 바와같이 DNA 현탁액 버퍼 또는 MB H2 O의 적절한 부피를 첨가하여, 100 μM의 농도로 동약화된 프라이머 및 프로브를 재중단시켰다.
  3. 부드럽게 소용돌이, 파이펫 을 위아래로 여러 번 혼합하고 잠시 원심 분리기 프라이머와 프로브탁탑 원심 분리기를 사용하여.
  4. DNA 현탁액 완충제 또는 MBH2O의 90 μL에 10 μM 스톡 10 μL을 추가하여 프라이머 및 프로브의 10 μM aliquots를 준비합니다.
  5. 1 μM aliquots의 전진 및 역방향 프라이머(프리앰블화에 사용됨)를 준비하여 DNA 현탁액 완충제 또는 MBH2O의 90 μL에 10 μL의 프라이머를 첨가한다.
  6. 프라이머와 프로브를 밀폐된 어두운 용기에 4°C로 보관하십시오. 오염을 방지하기 위해 뚜껑 주위에 실험실 필름을 감싸고 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 호일에 프로브를 덮습니다. 정기적으로 사용하지 않는 경우 장기 보관을 위해 -20°C에 프로브를 보관하십시오.

7. 긍정적 인 컨트롤의 선택

  1. 종양 조직 게놈 DNA(gDNA) 샘플(들)을 공지된 DNA 농도로 선택하며, 이는 양성 대조군으로서 사용될 것으로 알려진 알러지 주파수에서 관심 있는 돌연변이를 수용한다.
    1. 전암화 단계(단계 8)에서 양성 대조군 종양 조직 DNA의 0.025 ng를 사용한다.
      참고: 이 DNA 입력은 dPCR에 강력한 양성 신호를 제공합니다(H3F3A p.K27M 돌연변이를 품고 있는 종양 조직 gDNA의 직렬 희석을 수행하여 결정됨에 따라8)필요한 샘플의 양을 최소화하면서.

8. 표적 대열의 전암화

참고: 전암화 프로토콜은 잭슨 외, 201613.

  1. 10% 표백제와 70% 에탄올로 벤치 공간과 장비를 청소하십시오.
  2. 1 μM 전진 및 역방향 프라이머, cfDNA 샘플, gDNA 양성 대조군 및 DNA 폴리머라제 마스터 믹스를 얻고 얼음 위에 놓습니다.
  3. 단일 플렉스 또는 멀티플렉스 사전 증폭에 대해 원하는 수의 cfDNA 샘플 및 양성 제어를 전축하는 데 필요한 시약의 부피를 다음과 같이 계산합니다.
    1. 단일 플렉스 전암화 (관심있는 단일 돌연변이에 대한 야생형 및 돌연변이 대금 류를 전형 및 돌연변이 대엽을 하기 위해) 샘플13당 DNA 폴리머라제 마스터 믹스 17.5 μL 및 3.5 μL의 전진 및 역방향 프라이머 (100 nM)를 추가하여 PCR 반응 혼합물을 준비합니다.
    2. 멀티플렉스 프리앰블화(관심 있는 두 가지 돌연변이에 대해 두 세트의 야생형 및 돌연변이 대금 류를 프리앰프화하기 위해), 샘플당 17.5 μL의 DNA 폴리머라제 마스터 믹스와 1.75 μL의 전방 및 역방향 프라이머(50 nM)를 추가하여 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오. 13.
      참고 : 샘플 수와 파이펫팅 오류를 고려하여 10 % 추가에 대해 충분한 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오.
  4. 8웰 PCR 스트립 튜브(13)의 각 웰에 24.5μL의 PCR 반응 혼합물을 분배한다.
  5. DNA 샘플의 10.5 μL을 적절한 웰로 분배하여 총 반응량을 35 μL13으로가져온다. 전체 볼륨을 위아래로 10회 부드럽게 파이펫하여 섞어주세요.
  6. 3 분 동안 98 °C에서 PCR 증폭을 수행; 10초동안 98°C의 9사이클, 3분 동안 어닐링 온도, 30초동안 72°C; 및 2 분13에대한 72 °C에서 확장.
  7. 예환화된 제품의 전체 부피를 라벨이 부착된 DNase/RNase 프리 PCR 클린 튜브로 옮기고 140 μL TEDNA 현탁액 완충액(pH 8.0)에서 희석합니다 13.
  8. 실험실 필름에 튜브의 뚜껑을 감싸십시오. 미리 증폭된 제품을 4°C에서 보관하십시오. 장기간 보존을 위해 -20°C에 보관하십시오.

9. dPCR을 이용한 표적 DNA 의 검출 및 정량화

  1. 10% 표백제와 70% 에탄올로 벤치 공간과 장비를 청소하십시오.
  2. 얼음에 10 μM 프라이머 및 프로브, 게노티핑 마스터 믹스 및 DNA 샘플을 설정합니다. 액적 안정화 오일을 실온에서 보관하십시오.
  3. 부드럽게 소용돌이및 액적 안정화 오일을 제외한 모든 시약을 잠시 원심 분리.
  4. 액적 발생 기기및 정량화 기기(표)에 부착된 압축 질소가스 실린더가 90psi로 설정되어 있는지 확인합니다.
  5. 계기 소프트웨어로 낙하 발생 계측기와 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어를 실행하고 초기화 시작을 클릭합니다.
    1. 1주일 이상 사용하지 않은 경우 낙하 발생 기기에서 고압 플러시를 실행합니다.
  6. PCR 스트립 튜브 8웰에 대해 dPCR 반응 혼합물을 준비하고 10% 추가, 220 μL의 유전형 마스터 믹스, 8.8 μL의 10μM 야생형 및 돌연변이 프로브, 각각 10 μM 전진 및 역방향 프라이머 39.6 μL, 방울방울 안정화 오일 17.6 μL을추가합니다.
  7. 전체 부피를 10-20회 위아래로 파이펫팅하여 dPCR 반응 혼합물을 부드럽게 섞습니다. 액적 안정화 오일이 반응 혼합물에 첨가된 후 와류 또는 원심분리기를 사용하지 마십시오.
  8. PCR 8웰 스트립 튜브를 구하고 각 웰14의바닥에 직접 38 μL의 dPCR 반응 혼합물을 분배한다. 깨끗한 파이펫 팁으로 거품을 제거합니다.
    참고: 연동되거나 단단히 포장된 PCR 스트립 튜브는 정전전하를 일으켜 dPCR 데이터를 분석할 때 유착 및 시끄러운 신호를 유발할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, aliquot 스트립 튜브는 별도의 생물학적 위험 가방에, 가방을 과도하게 포장하지 않도록하고, 함께 마찰에서 튜브를 유지합니다.
  9. PCR 스트립 튜브의 적절한 웰에 12 μL의 미리 증폭된 DNA 샘플을 추가합니다. 네거티브 컨트롤의 경우 MB H2O의 12 μL을 추가합니다.
    참고: 복제 우물에서 cfDNA 샘플을 분석합니다. CSF의 경우, 적어도 중복으로 분석하고, 플라즈마/혈청은 트리플리케이트의 각 샘플을 분석합니다.
  10. 반응 혼합물을 DNA 샘플과 혼합하기 위해 전체 부피를 10회 위아래로 부드럽게 피펫합니다.
  11. PCR 스트립 튜브의 웰 1-8에서 칩의 해당 채널 A-H로 새 액적 발생 계기 칩 및 파이펫 전체 부피를 가져옵니다. 파이펫 팁으로 채널 바닥을 만지지 마십시오.
  12. 새로운 깨끗한 PCR 스트립 튜브를 구하고 액적 생성 기기에 삽입하십시오. 계기 컴퓨터의 소프트웨어에 액적 생성 계기 칩 ID를 스캔하거나 수동으로 입력합니다. 8개 채널 각각에 대한 이름을 입력합니다. 실행 시작을 클릭하여 샘플 을 드롭하기 시작합니다.
  13. 물방울화가 완료되면 PCR 스트립 튜브를 제거하고 스트립 튜브 캡을 적용합니다.
  14. 스트립 튜브를 열 사이클러로 옮기고 웰당 80 μL의 물을 함유한 다른 스트립 튜브로 균형을 조정합니다.
  15. 열 순환 조건14를 10분 동안 95°C로 프로그래밍합니다. 2 개의 온도의 45 사이클: 95 °C 에 대 한 30 s와 2 분 동안 어닐링 온도; 10 분 동안 98 °C; 10°C에서 유지합니다.
    1. 램프 속도를 0.5 °C /s로 설정하고 샘플 볼륨을 80 μL14로설정합니다.
  16. 열 순환이 완료되면 스트립 튜브를 제거하고 정량화 기기로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다. PCR 스트립 캡을 제거하고 고속 캡으로 교체하십시오.
  17. 계측기 소프트웨어로 정량화 기기와 연결된 컴퓨터를 켭니다. 계측기 소프트웨어를 실행하고 실행 설정을클릭합니다.
  18. 스트립 튜브를 정량화 기기에 넣습니다.
  19. 새로운 정량화 계기 칩을 구하고 스캔하거나 기기에 칩 ID를 수동으로 입력합니다. 칩을 기기에 삽입합니다.
  20. 금속 실드를 칩 위에 놓고 기기 뚜껑을 닫습니다.
  21. 컴퓨터 소프트웨어에서 dPCR 실행 및 각 8개 채널(A-H)에 대한 이름을 입력합니다. 고속 모드(고속 캡과 함께 사용해야 하는 모드)를 선택하고 시작을 클릭하여 정량화를 시작합니다.
  22. 정량화가 완료되면 금속 실드를 제거하고(저장 및 재사용) PCR 스트립 튜브와 칩을 폐기합니다. 계측기 컴퓨터에서 실행 로그에는 각 실행에 대한 결과 파일이 포함됩니다. 각 샘플에 대한 .fcs 파일을 사용하여 분석가 소프트웨어로 분석합니다.

10. 데이터 분석

  1. 분석가 소프트웨어를 실행하고 .fcs 파일을 열어 원시 스펙트럼 데이터를 분석합니다. 분석 뷰에서 그대로를 선택합니다. 샘플 보기에서 각 상자에 확인 표시가 표시되도록 8개 샘플 의 각 옆에 있는 상자를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 x-및 y 축을 따라 돌연변이(FAM) 및 야생형(HEX) 대/소동에 대한 신호를 각각 플롯합니다.
  2. 계산된 매트릭스 함수를 사용하여 제조업체의 지침15에따라 그대로 물방울에 대한 스펙트럼 보정을 적용합니다.
  3. 축 옵션 에서 축 설정을 조정합니다. x축을 최소 0및 최대 30,000으로 설정하고 y축을 최소 -5,000 및 최대 10,000으로 설정합니다. 액적 클러스터가 식별되면 축을 조정하여 그래프의 빈 공간을 줄입니다.
    참고: 돌연변이 및 야생형 클러스터의 위치는 사용된 프로브, 형광소및 그 농도에 따라 달라집니다.
  4. 양성 대조군 종양 조직 gDNA에 대응하는 샘플을 선택하여 음의(기원에 가장 가까운 클러스터), 돌연변이체(x축에 가장 가까운 클러스터), 및 야생형(y축에 가장 가까운 클러스터) 게이트를 설정한다. 성공적인 분석에서 클러스터가 뚜렷하고 쉽게 식별되도록 합니다.
  5. 양수 제어 샘플을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택한 샘플에 모든 설정을 적용하는 옵션을 클릭하여 모든 샘플에양수 제어에 대한 게이트 설정을 적용합니다.
  6. 그래픽 보기에서 여러 샘플 탭을 클릭하여 선택한 모든 샘플의 플롯을 봅니다. 이미지를 로 내보냅니다. TIF 파일.
  7. 화면 왼쪽 상단의 작업 영역 탭에서 내보내기 분석(csv)을 선택하고 분석된 데이터 파일을 .csv 파일로 저장합니다.
  8. 스프레드시트 소프트웨어에서 .csv 파일을 열어 각 샘플에 대한 음수, 와일드타입 및 돌연변이 액적 수를 확인합니다. 푸아송 보정 돌연변이 액적 수를 각 샘플에 대한 푸아송 보정 돌연변이 및 야생형 액적 수의 합계로 나누어 MAF를 계산합니다.
    참고: 푸아송 통계는 양성 액적이 표적 DNA의 단일 사본 이상을 포함할 수 있다는 사실을 설명하기 때문에 푸아송 보정 카운트를 사용하므로 양수 액적을 합산하면 정확한 카운트16을산출하지 못할 수 있습니다.

결과

그림 1은 DMG를 가진 2명의 아이들로부터 미리 증폭된 플라즈마(위 쪽 패널) 및 CSF(오른쪽 상단 패널) cfDNA에서 H3F3A p.K27M 돌연변이의 성공적인 검출을 위한 대표적인 결과를 나타낸다. cfDNA 샘플은 복제로 분석되었지만 각 샘플 유형에 대해 하나의 대표 그래프만 표시됩니다. dPCR 플롯은 PCR 당 7-9백만 방울의 성공적인 액적 생성을 보여줍니다 (대부분은 표적 DNA를 포함하지 않는 부정적인 액적입니다). PCR당 최소 7백만 방울은 성공적인 액적화를 나타내며, 700만 개 미만은 분석의 실패를 나타내며, 이 경우 사용자는 데이터 분석을 진행해서는 안 됩니다. 도 1은 각각 x축과 y축을 따라 돌연변이체와 야생형 군집 간의 명확한 분리를 나타낸다. 강력한 야생형 클러스터는 템플릿 DNA가 존재하기 때문에 cfDNA 추출이 성공했음을 나타냅니다. 돌연변이 클러스터는 혈장 및 CSF 샘플에 대해 각각 1.60% 및 39.92%의 MAF를 나타내며, 돌연변이의 양성 검출을 입증하였다. 이들 환자에 대해, dPCR 결과는 생검 종양 조직의 게놈 분석에 의해 확인된바와 같이 종양 돌연변이 상태에 따라 8. 음의 대조군(왼쪽 아래 패널)은 0개의 돌연변이체 및 0개의 야생형 방울을 나타내며, 이는 PCR 반응 혼합물의 오염이 없음을 나타낸다. 양성 대조군 종양 조직 gDNA(오른쪽 아래 패널)는 선택된 특정 종양 샘플에 대한 예상 된 대조군 주파수에서 검출되는 돌연변이를 나타낸다.

도2에서 대표적인 결과는 DMG를 가진 아이로부터의 혈장 cfDNA에서 관심 있는 돌연변이의 실패검출, H3F3A p.K27M에 대한 것으로 나타났다. 종양 조직의 게놈 분석에 의해 돌연변이상태를 확인하였다 8. 두 개의 복제 PCR 웰의 대표적인 결과가 도시됩니다(상단 패널). 음수 방울을 포함한 총 액적 수는 PCR 당 7-9백만 개사이이며 성공적인 액적화를 나타냅니다. y축을 따라 플롯된 야생형 클러스터는 혈장 cfDNA에 대해 PCR당 약 7-8,000개의 야생형 방울을 보여주며, 성공적인 cfDNA 추출을 나타냅니다(샘플에 표적 야생형 DNA가 있기 때문에). 그러나, 0 돌연변이 방울은 혈장 샘플에서 검출된다. 왼쪽 하단 패널은 야생형 또는돌연변이 액적없이 음의 대조군(MB H2 O)을 나타낸다. 및 오른쪽 하단 패널은 양성 돌연변이 검출을 가진 양성 대조군 전습화된 종양 조직 gDNA(0.025 ng)를 나타낸다. 이 도면에 도시된 바와 같이, 혈장내 돌연변이 검출의 부재는 반드시 환자가 관심의 돌연변이를 위한 야생형임을 의미하지않을 수 있으며, 거짓 부정이발생하는바와 같이 8. 일부 경우에, 선행 생검에서 수집된 혈장에서 돌연변이가 누락되면, 이후 시점8에서동일한 환자로부터 수득된 혈장에서 검출된다.

figure-results-1
그림 1 : 성공적인 검출 H3F3A p.K27M 돌연변이는 미드라인 글리오마를 가진 아이들에게서 미리 증폭된 혈장 및 CSF cfDNA에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2 : 관심 있는 돌연변이를 품은 것으로 알려진 환자로부터 미리 증폭된 혈장 cfDNA 샘플의 분석에서 얻은 거짓 음성 결과, H3F3A p.K27M, 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에서 우리는 참을성 있는 액체 생검에서 cfDNA에 있는 종양 돌연변이의 eelic 주파수를 검출하고 정량화하기 위한 우리의 방법을 제시했습니다. 당사는 사전 분석 시료 처리, cfDNA 추출, PCR 분석 설계 및 데이터 분석을 포함하여 이 방법의 성공을 위한 중요한 단계를 강조합니다. 사용된 샘플 부피를 제한하기 위해 cfDNA는 1 mL의 혈장에서 추출되지만 CSF의 500 μL만 추출됩니다. CSF에서 추출할 때, 소변의 1 mL에서 추출하기 위한 프로토콜(cfDNA 추출 키트 핸드북12)은제조업체의 권고에 따라 사용된다. 혈장과 CSF 사이에서 요구되는 견본 양에 있는 다름은 뇌종양을 가진 환자의 CSF에 비교된 혈장에서 종양 특정 cfDNA의 더 낮은 수준 때문이, 돌연변이 검출을 위한 더 큰 견본 부피를 필요로하는8. 시료를 사용할 수 있는 경우, 1 mL 이상의 혈장으로부터 추출되어 더 높은 DNA 수율을 생성할 수 있다. 그러나 소아 환자의 경우, 혈액 채취와 같은 간단한 절차조차도 방사선 요법을 받는 소아 환자에게 는 피곤하기 때문에 가능한 한 사용되는 혈액의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 플라즈마의 1 mL aliquots에서 추출하는 것은 또한 분석이 반복될 수 있는 그런 복제 추출을 가능하게 합니다 (예를 들면, DNA 추출 또는 견본 오염에 있는 실패의 케이스).

반드시 필요하지 않은 샘플 사용을 줄이기 위한 노력의 일환으로 cfDNA는 일반적으로 정량화되지 않습니다. 그러나, 우리는 플라즈마와 CSF에 있는 0.2-2 ng/μL 및 0.6-13 ng/μL 사이 cfDNA 농도의 범위를 각각 찾아냈습니다. 낮은 양의 cfDNA와 종양 특이적 돌연변이 대집합체가 낮은 주파수로 존재한다는 사실을 감안할 때, dPCR에 사용되는 동일한 프라이머 세트를 이용한 사전 증폭 단계는 시료에서 표적 DNA의 양을 현저히 증가시키고, 돌연변이 검출8. DNA 서스펜션 버퍼에서 미리 증폭된 제품을 희석하면 기술 복제에 충분한 부피가 제공되어 진정한 긍정을 구별하는 데 도움이 됩니다. 돌연변이 방울의 수가 낮을 수 있기 때문에 (예를 들어, 혈장 샘플에서 0-2 돌연변이 방울 사이), 기술 복제의 포함은 돌연변이 상태를 해결하기위한 열쇠입니다. 하나의 PCR은 0개의 돌연변이 액적을 산출할 수 있지만, 다른 두 개는 삼중항으로 분석된 단일 혈장 샘플에 대해 1-2를 산출할 수 있습니다. 따라서 복제를 포함하면 돌연변이 상태를 결정할 때 더 높은 정확도를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 MAF는 복제 값의 평균으로 계산됩니다.

다중화 된 사전 증폭 (관심있는 두 가지 돌연변이의 전형 및 돌연변이 대문자)는 동일한 시작 물질이 두 개의 돌연변이를 테스트하는 데 사용될 수 있기 때문에 단일 샘플의 유용성을 증가시킵니다. 중요한 것은, 멀티플렉스 프리앰프 생성물은 여기에 설명된 바와 같이 더 큰 단순성을 위해 dPCR 동안 단일 플렉스에서 분석될 수 있다. 그러나, 전암화 PCR 및 dPCR 모두 다중화될 수 있다. 멀티플렉싱할 때 는 프라이머와 프로브 세트 모두에 대해 조건을 최적화해야 합니다: 프라이머 어닐링 온도는 PCR 증폭에서 함께 실행되도록 유사해야 하며, 프로브는 뚜렷한 클러스터를 생성하도록 설계되어야 합니다(형광 신호 및 강도)를 참조하십시오. 새로운 프라이머 및 프로브 세트를 검증할 때 어닐링 온도 그라데이션을 실행하여 제조업체가 제안한 범위에 따라 최적의 어닐링 온도를 결정합니다. 환자 cfDNA 견본에 프로브를 시험하기 전에, 다른 입력의 합성 DNA 구조물 및/또는 종양 조직 gDNA를 사용하여 그(것)들을 유효하게 합니다 (즉, 최대 10 ng).

표적 DNA에 대한 프로브의 혼성화에서 더 큰 특이성과 감소된 불일치를 가진 돌연변이 대문자의 검출을 위해, 잠긴 핵산(LNA) 프로브가 사용된다. LNA는 리보오스 링 9의 2'-산소 및 4'-탄소를 연결하는 메틸렌브리지를 가진 핵산 유사체이다. 메틸렌 브리지는 유연성을 제한하고 열 이중 안정성을 증가시키고 DNA10,18을대상으로 프로브 혼성화의 특이성을 향상시키는 단단한 bicyclic 변형으로 핵산을 잠그고있습니다. 19. LNA 프로브와 템플릿 DNA 사이에 단일 염기 불일치가 존재하는 경우 프로브와 표적 사이의 이중 형성이 불안정해집니다. 따라서 LNA 프로브는 프로브 결합의 특이성을 향상시키고 더 높은 신호 대 잡음 비11을초래합니다. 비 CNS 병에 걸린 소아 환자에서 플라즈마 와 CSF의 분석은 H3F3A p.K27M을 표적으로 하는 LNA 프로브를 사용하여 우리의 분석의 특이성을 확립했습니다, 0.001% 이하의 allelic 주파수가 거짓 양성으로 간주된다는 것을 결정하기 위하여 8.GC 함량, 앰플리콘 크기, 프로브 리포터 염료 및 퀴커스를 포함한 프로브 및 프라이머의 설계를 최적화하기 위한 추가 고려 사항은 dPCR 제조업체 지침14,17을참조하십시오. 우리의 방법은 RainDance 시스템과 함께 사용하도록 최적화되어 있지만 프로토콜은 다른 dPCR 플랫폼과 함께 사용하도록 조정 될 수 있습니다.

여기에 제시된 방법은 cfDNA에 있는 희소한 종양 돌연변이를 검출하기 위한 선택의 발판으로 남아 있는 dPCR에 의해 달성된 높은 감도 및 표적 농축에서 힘을 그립니다. 강력하지만, dPCR은 단일 분석에서 시험될 수 있는 돌연변이의 수에 제한된다. dPCR에 대한 대안은 차세대 염기서열 분석(NGS)으로, 많은 유전자에 걸쳐 여러 돌연변이를 검출하여 단일 샘플의 유용성을 증가시킬 수 있습니다. NGS는 CSF와 뇌간 gliomas20를가진 환자의 혈장에서 돌연변이를 검출할 수 있습니다, 그러나, 현재 PCR 기지를 둔 접근에 있는 0.001%에 비교된 0.1-10% MAF의 검출 한계를 가진 cfDNA에 있는 종양 돌연변이를 검출에 dPCR 보다는 보다 적게 과민합니다21 . 또한 dPCR은 NGS보다 처리 시간이 단축되어 관심 있는 돌연변이를 신속하게 감지할 수 있습니다. PCR 접근은 암 모형에 걸쳐 적용가능하고 핫스팟 돌연변이 및 메틸화된 cfDNA22를검출하기 위하여 확장될 수 있습니다.

액체 생검은 실제로 그것의 초기 단계에 있고 특정 질병에 맞추기위한 추가 발달을 요구할 것입니다. 종양 진화의 맥락에서 종양 감시는 높은 감도를 가진 신흥 돌연변이를 검출할 수 있는 플랫폼이 요구될 다음 도전이 될 것입니다. 또한 다양한 생체 분자(펩티드, 사이토카인, RNA)를 검출할 수 있는 플랫폼은 치료에 대한 종양 반응을 평가하고 개인화된 임상 개입을 진행하는 데 매우 도움이 될 것입니다.

공개 사항

본 원고에 기재된 방법은 자바드 나자리안 & 에시니 판디타라트나에 의한 국제 특허 출원 "암 바이오마커 검출 방법"에 포함되어 있다.

감사의 글

저자는 모든 환자와 그 가족의 관대함을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 스매싱 호두 재단 (미들 버그, 버지니아), V 재단 (애틀랜타, GA), 가브리엘라 밀러 키즈 퍼스트 데이터 리소스 센터, 어린이 국립 임상 및 번역 과학 연구소의 자금 지원으로 지원되었다 5UL1TR001876-03), 무셀라 재단 (휴렛, NY), 매튜 라슨 재단 (프랭클린 레이크, 뉴저지), 소아 뇌암 연구를위한 라일라비 재단 (실버 스프링, MD), 어린 시절 뇌 종양 재단 (저먼 타운, MD), 어린이 뇌 종양 조직 컨소시엄 (필라델피아, PA), 그리고 소아 암 연구를위한 집회 재단 (애틀랜타, 조지아).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA 현탁액 버퍼 (pH 8.0)TeknovaT0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg 혈액 채취 튜브 (10 mL)Becton Dickinson 진단367525혈장 채취 용
BD Vacutainer 플라스틱 혈청 튜브 (10 mL)Becton Dickinson 진단367895혈청 수집 용
표백제일반 실험실 공급 업체
버퍼 ATLQiagen19076
무세포 DNA 채혈 튜브스트렉218961cfDNA 채혈 튜브 (선택 사항)
CentriVap 농축기Labconco7810010
Forward PrimerIntegrated DNA Technologies, Inc.맞춤형 디자인
MiniAmp Thermal CyclerThermofisher ScientificA37834
분자 생물학 등급 절대 에탄올(200 proof)일반 실험실 공급업체
돌연변이 프로브통합 DNA Technologies, Inc.맞춤형 설계
PAXgene Blood ccfDNA 튜브PreAnalytiX768115cfDNA 채혈 튜브(옵션)
PCR 8웰 스트립 튜브 캡VWR10011-786
PCR 8웰 스트립 튜브AxygenPCR-0208-C
피펫(p20, p200, p1000)일반 실험실 공급업체
피펫 필터 팁(p20, p200, p1000)일반 실험실 공급업체
Q5 핫 스타트 하이파이티 2x 마스터 믹스뉴잉글랜드 바이오랩스 IncM0494S
QIAamp 순환 핵산 핸드북;QiagencfDNA 추출 키트 핸드북 (2013년판)
QIAamp 순환 핵산 키트Qiagen55114cfDNA 추출 키트 (프로토콜 단계 4) 
QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트Qiagen57704소형 (< 또는 =200 µ L) 시료 부피
Qiavac 24 PlusQiagen19413QIAamp 순환 핵산 키트와 함께 사용 Raindance
소모품 키트Bio-Rad20-04411액적 생성 기기 칩, 정량화 기기 칩, 고속 캡을 포함한 PCR 스트립 캡 및 액적 안정화 오일을 포함합니다
Raindance Sense 기기 Bio-Rad정량화 기기(에서 사용됨) 프로토콜 단계 9)
Raindance Source InstrumentBio-Rad액적 생성 기기(프로토콜 단계 9에서 사용됨)
RainDrop Analyst II 소프트웨어데이터 분석에 사용되는 RainDance Technologies
Refrigerated Vapor TrapSavantRVT5105-115
Reverse PrimerIntegrated DNA Technologies, Inc.맞춤형 설계
Smartblock 2 mLEppendorf05 412 506
TaqMan Genotyping Master MixThermofisher Scientific4371353
Thermomixer CEppendorf14 285 562PM
WT ProbeIntegrated DNA Technologies, Inc.맞춤형 디자인
. Analyst 소프트웨어(프로토콜 단계 10)

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