약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

요약

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

초록

G 단백질 결합 된 수용 체 사이 상호 작용 (GPCRs) 그리고 β-arrestins는 매우 중요 한 생리적 의미와 중요 한 과정. 현재, β-arrestins 및 그밖 cytosolic 단백질과의 상호 작용을 향해 새로운 약의 특성은 GPCR 편향된 agonism의 연구 도중 특히 GPCR 약 발견의 필드에서 극단적으로 귀중합니다. 여기서, 우리는 실시간 살아있는 시스템에서 수용체-β-레체아핀 상호작용을 정확하게 모니터링하기 위한 새로운 구조적 보완 분석법의 적용을 보여준다. 이 방법은 간단하고 정확하며 관심 있는 임의의 GPCR까지 용이하게 확장될 수 있으며 또한 각 벡터 시스템에 존재하는 낮은 발현 프로모터의 존재로 인해 비특이적 상호작용을 극복할 수 있다는 장점이 있다. 이 구조적 보완 분석법은 수용체-β-arrestin 상호 작용의 정확하고 정확한 모니터링을 허용하는 주요 기능을 제공하여 GPCR 시스템의 편향된 작용뿐만 아니라 GPCR c-종단 '인산화의 연구에 적합합니다. 다른 GPCR 키나아제 (GRKs)와 수용체 β-arrestin 복합체를 안정화하거나 불안정하게 하는 체포의 번역 후 수정에 의해 작성된 코드.

서론

GPCR은 현재 시중에서 약품의 약35%를 대상으로 하고 있으며, 이들의 약리학에 대한 명확한 이해는 새로운 치료제 의 개발에 매우 중요하다 ^3. GPCR 약 발견에 있는 중요한 양상의 한개는, 특히 편향된 작용제의 발달 도중 수용체 β-arrestin 상호 작용⁴ 및 β-arrestin 상호 작용과 같은 그밖 cytosolic 단백질을 향한 새로운 리간드의 특성입니다 클래트린⁵.

β-arrestin 의존성 신호는 양극성 장애, 주요 우울증 및 정신 분열증 6과 같은 신경 장애에 중요한 역할을 하며 모르핀7과 같은 일부 약물에서도 심각한 부작용을 가지고 있다는 것이 문서화되었다.

이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 사용되는 현재의 방법은 일반적으로 연구에서 단백질의 실제 내인성 수준을 나타내지 않으며, 어떤 경우에는 약한 신호, 광표백및 GPCR에 따라 8을 설정하는 것이 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이러한 새로운 구조적 보완 분석법은 내인성 생리학적 수준을 모방하기 위해 낮은 발현 프로모터벡터를 사용하고 현재 방법 9에 비해 높은 감도를 제공한다. 이러한 접근법을 사용하여, 갈라닌 수용체-β-arrestin1/2 및 또한 β-arrestin2-클라트린 상호작용^10을쉽게 특성화할 수 있었다. 이 방법론은 β-arrestins가 중요한 생리기능을 재생하거나 그들의 신호가 몇몇 질병에서 관련있는 특정 관심사의 어떤 GPCR든지에 널리 이용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 프라이머 디자인 전략

1. pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 벡터에 관심 있는 유전자를 소개하는 프라이머를 디자인합니다.
2. 도 1^11에도시된 바와 같이 멀티클로닝 부위를 분할하는 인프레임 스톱 코돈의 존재로 인해 방향 성 클로닝에 필요한 두 가지 독특한 제한 효소 중 하나로서 이들 3개 부위 중 적어도 하나를 선택한다.
3. 표 1에 나타낸 바와 같이 프라이머내로 뉴클레오티드 서열을 통합하여 표 2^11에적색으로 표시된 링커 잔기를 인코딩한다.
4. pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 벡터의 경우, 5' 프라이머에 ATG 코돈과 강력한 코자크 합의 서열(GCCGCCACC)이 포함되어 있는지 확인합니다.
5. pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 벡터의 경우 3' 프라이머에 스톱 코돈이 포함되어 있는지 확인합니다.
   참고: 각 벡터는 비특이적 연관성을 최소화하고 실험 적 아티팩트를 감소시키기 위해 HSV-TK 프로모터를 포함하며, 또한 각 벡터는 박테리아에서 암피실린 저항성을 위한 발현 카세트를 갖는다.

2. PCR

1. 1단계에서 설계된 프라이머를 사용하여 관심 유전자의 삽입 DNA를 증폭시키기 위해 PCR 반응을 설정하고 실행한다. 고충실도 DNA 폴리머라제는 돌연변이를 최소화하는 것이 중요하다.
2. 정확히 다음 순서를 사용하여 50 μL의 PCR 반응을 준비하십시오. 증류수 35.5μL, 10x 폴리머라제 완충액 5μL, dNTP 혼합물 5μL(각각 2.5mM), 플라스미드 템플릿 1μL(200 ng/μL), 1.25μL의 전진 및 역방향 프라이머(10 μM) 및 고충실도 폴리머(5 U/L)를 추가합니다.
3. 열사이클러를 사용하여 다음과 같은 DNA 증폭 프로그램을 설정한다.
   1. 95 °C에서 5 분 동안 변성.
   2. 다음 열 주기를 25회 반복합니다: 30s에 대해 95°C, 1분 동안 60°C, 1kbp당 2분 동안 72°C를 증폭한다.
   3. 최종 연장을 72°C에서 10분 동안 실행합니다.
   4. 열순환기 내에서 샘플을 4°C에서 유지합니다.
      참고: 긴 서열의 증폭 중에 발생하는 점 돌연변이를 최소화하기 위해 고충실도 폴리머라제(polymerase)를 사용하는 것이 좋습니다. 앰플리온이 길어지면 DNA 복제의 정확도 정도가 감소합니다. PCR 반응을 위해, 올리고스가 프라이머의 모든 서열이 아닌 DNA 템플릿과 직접 혼성화되는 영역의 용융 온도에 따라 어닐링 온도를 선택합니다.
4. PCR 제품 정제
   1. 기본 설정^12의제조 업체에서 키트를 사용 하 여 PCR 반응의 나머지 부분에서 PCR 제품을 분리. 이제 PCR 제품이 제한 소화를 할 준비가 되었습니다.

3. DNA 소화

1. PCR 생성물 소화를 위해 소화 반응의 50 μL을 다음과 같이 준비한다.
   1. 1.5 mL 튜브를 사용하여 증류수 12 μL을 추가합니다.
   2. 두 제한 효소와 최상의 호환성으로 10x 버퍼의 5 μL을 추가하십시오.
   3. 2.4 단계에서 PCR 제품의 30 μL추가
   4. 마지막으로, 각 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다.
   5. 소용돌이에 의해 간략하게 혼합하고 밤새 37.5 °C에서 배양합니다.
2. 수용자 플라스미드 소화를 위해 다음과 같이 소화 반응의 50 μL을 준비합니다:
   1. 1.5 mL 튜브를 사용하여 23 μL의 증류수를 추가합니다.
   2. 두 제한 효소와 최상의 호환성으로 10x 버퍼의 5 μL을 추가하십시오.
   3. 15 μL의 수신자 플라스미드(200 ng/μL)를 추가합니다.
   4. 각 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다.
   5. 소용돌이에 의해 간략하게 혼합하고 밤새 37.5 °C에서 배양합니다.
      참고: DNA 아가로오스 겔 정제 후 충분한 물질을 얻기 위해서는 3 μg의 수용자 플라스미드를 사용하는 것이 중요하다. 그것은 또한 높은 복제 효율을 얻기 위해 두 효소를 사용 하 여 하룻밤 DNA 소화를 두고 관련.

4. DNA 아가로오스 젤 정제 및 복제

1. 1% 아가로즈 겔을 준비하여 소화된 DNA 플라스미드 및 삽입을 실행하고 해당 밴드를 절단진행한다. 해당 벡터 및 삽입 밴드가 정제되면12, 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정한다.
2. DNA 결찰을 수행하여 인서트를 수용자 플라스미드에 융합시다.
3. 플라스미드 벡터의 50 ng를 포함하여 총 DNA의 약 100 ng의 결찰 반응을 준비한다.
4. 약 1:3의 수신자 플라스미드 인서팅 비율을 설정; 벡터 삽입^{계산기(13)를}사용하여 계산할 수 있습니다.
5. 네거티브 컨트롤을 병렬로 설정합니다. 예를 들어, 어떤 삽입없이 수용자 플라스미드 DNA의 결찰은 소화되지 않거나 자가 결찰 받는 사람 플라스미드가 존재하는 얼마나 많은 배경에 대한 정보를 제공할 것이다.

5. 클론의 변환

1. 냉동고에서 유능한 DH5α 세포의 튜브를 -80°C에 놓고 즉시 얼음에 20분 간 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다.
2. 그 시간 후, DH5α 유능한 세포의 55 μL을 취하고 4 μL의 결찰 반응을 추가하고 튜브를 가볍게 두어 혼합하고 얼음에 45 분 동안 저장합니다.
3. 이전에 42 °C에서 48초 동안 데운 수조에 튜브를 놓고 즉시 튜브를 얼음에 다시 3 분 동안 다시 가져옵니다.
4. 이전에 37.5 °C에서 데운 루리아 국물 (LB) 배지 600 μL을 넣고 200 rpm에서 1 시간 동안 흔들어 서 배양하십시오.
5. 200 μL을 암피실린 100 μg/mL이 함유된 한천 판에 옮기고 액체가 대부분 흡수되어 표면에 부드럽게 퍼질 수 있습니다.
6. 다음날 아침 식민지를 보기 위해 밤새 접시를 배양합니다. 인서트 플레이트상에 있는 수용자 플라스미드는 수용자 플라스미드 단독 플레이트보다 훨씬 더 많은 콜로니를 가져야 한다.

6. 완성 된 플라스미드의 절연

1. 3-10개의 개별 세균 성 콜로니를 선택하고 암피실린(100 μg/mL)을 함유한 1 mL의 LB 배지로 옮기고 6시간 동안 배양합니다.
2. 200 μL의 세균 현탁액을 취하고 6.1 단계에서와 동일한 암피실린 농도를 함유하는 LB 배지의 5 mL로 이송하고 200 rpm에서 흔들어 37.5°C에서 밤새 배양한다.
3. miniprep DNA 키트 정제를 사용하여, 제조자 지침^14에따라 하룻밤 재배 LB의 5 mL을 사용하여 미니프렙 DNA 정제를 수행한다.
4. 성공적인 결찰을 확인하기 위해, 제2 단계에서 얻은 DNA를 제1 PCR 동안의 제2항에서와 동일한 프라이머를 가진 템플릿으로 사용하여 섹션 2에서와 같은 방식으로 PCR 반응을 설정한다. 포지티브 클론은 해당 크기의 PCR 제품을 생산합니다.
5. 양성 클론의 큰 준비 DNA 정제 후, 복제 단계 동안 사용되는 효소와 함께 정제 된 DNA 의 500 ng의 진단 제한 소화를 실시하고 1 % 아가로즈 젤에 소화 된 제품을 실행합니다. 두 개의 밴드가 있어야합니다 : 하나의 벡터 크기와 새 삽입의 크기.
6. 다음 프라이머를 사용하여 시퀀싱하여 시퀀싱을 확인합니다: 포워드 5'- aaggtgacgtttttttttttaac-3'와 역5'-gcatttttcctttagtt-3'.
   참고: DNA가 PCR을 사용하여 복제될 때, 고충실도 폴리머라제를 사용하는 경우에도 증폭 중에 항상 오류가 발생할 가능성이 있으므로 최종 구문서열을 정하는 것이 매우 중요합니다.

7. 형질 감염 및 단백질 발현

1. 이전에 폴리-L-리신 코팅 화이트 96 웰 플레이트에서, 덜베코의 수정 된 독수리의 배지를 사용하여 잘 당 2.5 x 10⁴ 세포에서 형질전환 하기 전에 하루 세포 파종을 수행 10% 태아 소 소 세럼의 보충, 100 U/mL 페니실린 G, 그리고 100 μg/ mL 연쇄상 구균.
2. 60개의 내부 웰만 사용하여 증발로 인한 플레이트 및 엣지 효과전반에 걸친 열 그라데이션의 가능성을 최소화합니다. 36개의 외부 우물에 200 μL의 멸균 증류수를 추가하고 37.5°C및 CO2의 5%에서 하룻밤 동안 배양하는우물과 배양 사이의 공간에 150 μL을 추가합니다.
3. 다음날 아침 총 DNA 100 ng(각 구조50 ng)를 사용하여 형질혈을 수행한다.
4. 도 2b에따라 4개의 상이한 플라스미드 조합(receptor:β-arrestin)을 설정한다.
5. 각 플라스미드 조합에 대해 20 μL의 수정된 이글의 최소 필수 매체를 HEPES로 완충하여 웰당 0.3 μL의 지질 형질 전환 시약을 사용한다.
6. 20 μL의 지질 형질 전환 시약-DNA 혼합물을 각 우물에 넣고 10s동안 원형으로 접시를 섞습니다.
7. 37.5 °C 및 5 % CO2에서 6시간 배양 후 신선한 배지를 변경합니다.
8. 37.5 °C 및 5 % CO2에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

8. HEK293 세포에서 수용체-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

1. 배지를 흡인하고 HEPES로 버퍼링된 수정된 독수리의 최소 필수 미디어 100 μL을 각각 잘 추가하고 플레이트가 RT에서 10분 동안 안정화하도록 합니다.
2. 1부부피의 100x 기판을 LCS 희석 완충제(20배 희석)(20배 희석)(11)와 결합하여후리마진 기판을 준비하고, 세포 배양 배지와 혼합하여 5배 스톡을 생성한다.
3. 각 우물에 25 μL의 5x 후리마진을 넣고 10s를 위해 원을 부드럽게 섞습니다.
4. RT에서 신호 안정화를 위해 발광을 10분 동안 측정합니다.
   참고 : 각 웰의 반응을 정상화하기 위해이 기준선 신호를 사용하여 잘 당 도금 된 셀 수의 차이, 형질 감염 효율의 차이 등으로 인한 변동성을 줄이는 데 도움이됩니다. 일단 계산되면, 주어진 약물 치료를 위해 복제 웰로부터의 정규화된 반응을 평균화한다.
5. HEPES로 버퍼링된 수정된 이글의 최소 필수 미디어에 13.5x 리간드 솔루션을 준비합니다.
6. 10 μL의 13.5x 리간드 첨가로 실온에서 실험하는 경우, 인젝터 또는 멀티 채널 파이펫을 사용하여 화합물을 추가하고 손으로 또는 궤도 셰이커 (200 rpm에서 20s)를 사용하여 플레이트를 혼합하십시오.
7. 37.5°C에서 13.5x 리간드를 첨가한 10 μL의 실험의 경우 인젝터를 사용하여 화합물을 분배하고 계측기 궤도 셰이커를 사용하여 혼합합니다. 인젝터를 사용하지 않는 경우, 발광계에서 플레이트를 제거하고, 리간드를 추가하고 손으로 또는 궤도 셰이커 (200rpm에서 20s)를 사용하여 플레이트를 혼합하십시오.
   참고: 검출 기기 내에서 인젝터와 셰이커를 사용하여 발광계에서 플레이트를 제거하는 것과 관련된 온도 변동을 최소화하십시오. 표준 벤치탑 발광계는 이 분석에 사용할 수 있습니다. 0.25-2s의 통합 시간을 사용합니다.

결과

여기에 제시된 절차를 사용하여, 프로토타입 GPCR과 2개의 β-arrestin 이소폼 사이의 상호작용을 모니터링했다. 글루카곤 유사 펩티드 수용체(GLP-1r) 컨스트럭트는 NheI 및 EcoRI 효소 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 만들어졌으며, β-레아핀의 경우 2개의 벡터를 추가로 pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-C [TK/SmBiT]로 복제하였다. β-arrestin2 및 NheI 및 XhoI의 경우 β-arrestin1의 경우 효소 제한 부위 BgIII 및 EcoRI를 사용하여 pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT]를 사용하였다. HEK293 세포는 N-1r-LgBiT/SmBiT 의 50 ng및 N-C-말단에서 LgBiT 또는 SmBiT로 태그된 β-레퍼틴 50 ng를 사용하여 형질감염되었다. 4개의 상이한 플라스미드조합을 스크리미큐어(도 3)하고 가장 높은 발광 신호를 가진 플라스미드 조합을 ...

토론

여기에 제시된 방법을 사용하여, 임의의 GPCR 및 β-arrestin1/2 사이의 상호작용은 이 GPCR-β-arrestin 구조적 보완 분석법을 사용하여 실시간 생활 시스템에서 모니터링될 수 있다. 이와 관련하여, 우리는 GLP-1r (프로토 타입 클래스 B GPCR)에 의해 두 개의 β-arrestin 이소폼 사이의 차동 β-arrestin 모집을 관찰 할 수 있었고, 우리는 또한 수용체 β-arrestin 복합체의 해리를 최대에 도달한 후 몇 분 후에 관찰했습니다. 발광 신호.

구조적 보완 분석 시스템에서 최고의 감도를 갖기 위해, 수용체와 각 β-arrestin 이소폼 사이의 4가지 공간 배향으로 스크리닝하였고, 가장 높은 발광 신호를 가진 것을 후방에 사용했습니다. 투여량 반응 자극 곡선과 같은연구 (그림 4). 이러한 방법론을 이용하여 당뇨병^15와같은 내분비학적 질환에서 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항생제 페니실린 스트렙토마이신	Welgene	LS202-02	페니실린/스트렙토마이신
세균 인큐베이터	JEIO Tech	IB-05G	인큐베이터(에어 재킷), 염기성
세포 배양 배지	Welgene	LM 001-05	DMEM 세포 배
양 배지	Gibco	31985-070	Optimem 1X 세포 배양 배지
CO2 인큐베이터	NUAIRE	NU5720	직접 가열 CO2 인큐베이터
디지털 수조	실험실 기술	LWB-122D	디지털 수조 실험실 기술
DNA 중합 효소 증명 판독	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA 중합 효소
DNA 정제 키트	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass 정제 키트 플라스미드 미니
DNA Taq 중합 효소	효소학	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
효소 제한 XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
광 현미경	Olympus	CKX53SF	CKX53 현미경 올림푸스
지질 형질주입 시약	Invitrogen	11668-019	리포펙타민 2000
광도계	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 다중 모드 마이크로플레이트 리더
NanoBiT 시스템	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS 스타터 시스템
나노루시페라제 기판	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler, Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma, Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
, Trypsin EDTA,	Gibco	25200-056	Trysin EDTA, 10X
White Cell culture, 96웰 플레이트	Corning	3917	Assay Plate, 96웰 플레이트

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