이 방법은 배양 된 세포 및 동물 조직에서 샘플 준비를 설명하고, 샘플에서 코엔자임 A의 추출 및 유도체화를 설명하고, 유도된 코엔자임 A의 정제 및 정량화를 위한 고압 액체 크로마토그래피를 흡광도 또는 형광 검출.
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이 논문에서
요약
초록
신흥 연구는 세포 코엔자임 A (CoA) 공급이 성장, 신진 대사 및 생존에 해로운 영향을 미치는 제한될 수 있음을 밝혔습니다. 세포 CoA의 측정은 상대적으로 낮은 풍부함과 무료 CoA를 CoA 티에스테르로의 동적 변환으로 인해 도전이며, 차례로 수많은 대사 반응에 참여합니다. 많은 생물 의학 실험실에서 사용하기에 적합한 검출의 넓은 선형 범위와 분석법을 산출하기 위해 샘플 준비 동안 잠재적 인 함정을 탐색하는 방법이 설명된다.
서론
코엔자임 A (CoA)는 모든 살아있는 유기체의 필수 보조 인자이며 판토테네이트 (판토테닉 산의 소금) 또는 비타민 B5라고도하는 판토테산산에서 합성됩니다. CoA는 아세테이트와 숙시네이트와 같은 짧은 사슬 산, 프로피오네이트 및 메틸말로네이트와 같은 분기 사슬 산, 팔미테이트 및 올레테이트와 같은 긴 사슬 지방산, 매우 긴 사슬 지방산과 같은 유기산의 주요 세포 내 담체입니다. 고도 불포화 지방산, 및 valproic 산과 같은 xenobiotics. 유기산은 CoA와 동위적으로 티오에스테르 연계를 형성하여 중간 물질 대사에서 100개 이상의 반응에서 기질로서의 사용을 가능하게 한다1. CoA 티에스터는 또한 알로스테릭 조절제 및 전사 활성제입니다. 그것은 지금 평가2 셀룰러 총 CoA 공급규제3,4; 따라서, CoA 가용성은 제한될 수 있고, CoA 결핍은 CoA생합성5에영향을 미치는 유전적 무질서에 의해 예시된 바와 같이 치명적일 수 있다. 판토테네이트 키나아제는 CoA 생합성의 첫 번째단계(도 1)와판....
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프로토콜
이 프로토콜에 언급 된 동물 절차는 프로토콜 323 및 556에 따라 수행되었으며 세인트 주드 어린이 연구 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 특별히 승인했습니다.
1. 솔루션 준비
참고: 모든 용액과 절차에 명시된 경우 초순수를 사용하십시오.
- 물에 1 mMM 수산화 칼륨 (KOH)을 준비합니다.
- 0.25 M KOH를 물에 준비하십시오.
- 물에 1 M Trizma-HCl을 준비하고 pH 8.0으로 조정합니다.
- 아세토니트릴(옵티마 그레이드)에서 100mMMMM모노브로모비마네(mBBr)를 준비합니다. mBBr의 스톡 솔루션은 빛에 노출되면 모노브로모비만을 바이마네26으로포토이즈할 수 있기 때문에 어둠 속에서 유지되는 경우 수개월 동안 -20°C에서 안정적이다.
- 고체 상 추출 (SPE) 컬럼을위한 세척 버퍼를 준비하십시오 : 50 % 메탄올 (옵티마 등급) + 2 % 아세트산.
- SPE 컬럼용 용출 완충제를 준비하십시오: 50 mM 암모늄 포메이트를 함유하는 95% 에탄올(HPLC 등급).
2.....
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결과
배양 된 세포 및 조직에서 총 CoA의 검출을위한 비교적 빠르고 신뢰할 수있는 방법은 mBBr을 사용하여 형광제에 CoA의 티올을 유도한 다음 역상 HPLC를 사용하여 유도 된 CoA-bimane을 정제함으로써 개발되었습니다. 표준 곡선이 먼저 생성되고, 여기서 CoA-bimane 표준의 알려진 양이 개별적으로 주입되고 CoA-bimane 크로마토그램의 피크 아래 영역이 입력 CoA-bimane의 함수로서 플롯됩니다(그림4). CoA-bimane은 λ393 nM에서 흡수 최대를 가지며 대표적인 HPLC 프로파일은 표 1의용출 프로그램을 사용하여 C18 HPLC 컬럼상에서 CoA-bimane 표준의 유지 시간을 나타낸다(그림3). 흡광도 또는 형광 단위를 측정하여 검출된 CoA-bimane의 대표적인 표준 곡선은 그림 4A
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토론
여기서 우리는 흡수 또는 형광 출력 검출기를 가진 HPLC가 있는 많은 실험실에서 접근할 수 있는 광범위한 선형 검출을 가진 세포 및 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 단계별 절차를 보여줍니다. 양자택일로, 질량 분석법은 CoA와 CoA 티에스테르를 평가하기 위한 일반적인 기술입니다, 그러나 계측의 비용 및 방법론의 발달 및 데이터의 해석을 위해 요구된 전문화한 지식 때문에 널리 이용되지 않습니다. 질량 분석법에서 자유 CoA의 정량화를 위한 내부 표준으로 사용하기에 적합한 동위원소 표지 CoA는 상업적으로 사용할 수 없으며, 무료 CoA는 아세틸-CoA와 같은 CoA 티에스테르와 동일한 감도를 가진 기기에 의해 검출되지 않습니다. 따라서 출력 데이터를 CoA 표준 교정 곡선과 비교하지 않는 한 자유 CoA 수준은 질량 분석법에 의해 과소 평가되는 경우가 많습니다.
우리는 우리의 실험실에서 이전에 사용 된 다른 방법으로 여기에 설명 된 방법을 비교하고 마.......
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공개 사항
MWF, CS 및 SJ는 논문을 썼고, MWF 및 CS는 데이터와 수치를 제공했으며, COR는 실험을 설계하고 원고를 비판적으로 검토했습니다. SJ와 COR는 이 문서에서 언급한 PZ-2891 화합물을 다루는 세인트 주드 어린이 연구 병원이 보유한 "판토테네이트 키나아제의 소분자 변조기"(PCT/US17/39037) 출원 중인 특허 출원에 대한 발명자입니다.
감사의 글
저자는 CoA 치료, Inc., BridgeBio LLC의 자회사, 건강 보조금 GM34496의 국립 연구소, 그리고 미국 레바논 시리아 관련 자선 단체에 의해 제공되는 후원 연구에 대한 자금을 인정.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-(2-피리딜)-에틸 실리카 겔 SPE 컬럼 | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| 코엔자임 A | Avanti 극성 지질 | 870700 | |
| 쌍둥이자리 C18 3 μ 남 100 Å HPLC 컬럼 | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| 모노브로모비만 ThermoFisher | Scientific | M-1378 | |
| 옴니팁 프로브 조직 파괴자 | Omni International | 32750H | |
| 파라필름 | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 전동 로터 고정자 균질기 | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X 원심분리기 튜브 필터 | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475, 형광 검출기 | Waters | 2475 | |
| Waters 2489, UV-Vis 검출기 | Waters | 2489 | |
| Waters e2695, 분리 모듈 | Waters | e2695 |
참고문헌
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
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재인쇄 및 허가
