방법 논문

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

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DOI:

10.3791/60475

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2019년 12월 26일

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1Department of Oncology UNIL CHUV, Ludwig Institute for Cancer Research Lausanne, University of Lausanne, 2Swiss Institute for Experimental Cancer Research (ISREC), School of Life Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL), 3Center of Experimental Therapeutics, Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, 4Hematology Service, Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

초록

정지, 자기 재생 및 분화의 미세 한 균형은 조혈 줄기 세포를 보존하는 열쇠 (HSC) 풀과 모든 성숙한 혈액 세포의 평생 생산을 유지. 최근 몇 년 동안 세포 대사HSC 기능과 운명의 중요 한 레 귤 레이 트로 등장 했다. 우리는 이전에 미토콘드리아 대사의 변조가 HSC 운명에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 특히, 전자 수송 사슬을 화학적으로 분리함으로써 우리는 일반적으로 급속한 분화를 유도하는 배양 조건에서 HSC 기능을 유지할 수 있었습니다. 그러나, HSC 수를 제한하는 것은 수시로 HSC 물질 대사를 측정하고 그러므로 그들의 기능을 예측하기 위하여 표준 측정법의 사용을 배제합니다. 여기에서, 우리는 HSC와 같은 희소한 세포에 있는 미토콘드리아 막 전위 그리고 미토콘드리아 질량의 믿을 수 있는 측정을 허용하는 간단한 교류 세포 분석분석서를 보고합니다. 우리는 마우스 골수에서 HSC의 격리 및 미토 콘 드리 아 질량 및 막 잠재적인 포스트 생체 배양의 측정을 논의. 예를 들어, 우리는 대사 변조기로 치료를 통해 HSC에서 이러한 매개 변수의 변조를 보여줍니다. 더욱이, 우리는 인간 말초 혈액 유래 T 세포 및 인간 종양침투 림프구 (TILs)에 이 방법의 응용 프로그램을 확장하여 미토콘드리아 프로필에 극적인 차이를 보이며 아마도 다른 T 세포를 반영합니다. 기능. 우리는 이 분석이 다른 문맥에 있는 각종 세포 모형에 있는 미토콘드리아 물질 대사의 변조기를 확인하기 위하여 검열에서 채택될 수 있다는 것을 믿습니다.

서론

조혈 줄기 세포 (HSCs)는 유기체의 일생 내내 혈액 생산 및 항상성을 지키는 골수에 거주하는 세포의 작은 인구입니다. HSCs는 세포 분열및 잘 조율된 분화 단계1을통해 말단분화 된 성숙한 혈액 세포 혈통을 생성하는 선조를 초래함으로써 이러한 과정을 중재한다. 중요한 것은, HSC는 혐기성 glycolysis를 통해 그들의 에너지를 생성합니다. 대조적으로, 더 헌신적이고 적극적인 조혈 선조는 미토콘드리아 물질 대사를 향해 그들의 신진 대사를 전환2,3,4. 이러한 뚜렷한 대사 상태는 활성 미토콘드리아에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS)에 의해 가해지는 세포 손상으로부터 HSC를 보호하는 것으로 여겨지며, 이에 따라 생체 내에서 장기간 의 기능5,6,7,8을유지한다. HSC 대사 상태의 직접 측정은 그들의 제한된 수로 인해 도전적이고 종종 낮은 처리량입....

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프로토콜

원고에 기재된 모든 실험은 우리 기관의 지침을 따르며 동물 실험에 대한 스위스 법(승인: VD3194) 및 인간 시료와 관련된 연구에 따라 수행되었다(프로토콜: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. 조혈 줄기 세포 추출

  1. 야생 형 C57BL6/J 마우스를 구입하고 운송 관련 스트레스를 줄이기 위해 적어도 일주일 동안 동물의 집에 보관하십시오.
  2. 실험 당일,CO2 질식을 사용하여 마우스를 안락사시한다.
  3. 모피를 살균하고 뒷다리에서 대퇴골과 경골 뼈를 잘라 해부 가위와 집게와 같은 표준 수술 도구를 사용하여 뱃속에서 마우스를 잘라 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이.
  4. 부드러운 종이 타월을 사용하여 대퇴골, 경골 및 골반에 부착 된 근육을 제거하고 얼음에 1 mMEDA (완충제)가있는 PBS가 들어있는 50 mL 튜브에 깨끗한 뼈를 놓습니다.
  5. 박격포와 유봉에 70 % 에탄올을 뿌리고 세포 배양 후드에 놓습니다. 자외선으로 30분 동안 살균하십시오.
  6. 박격포에 약간의 완충액 (~ 10 mL)으로 깨끗한 뼈를 넣고 부드럽게 현탁액에서 골수를 얻기 위해 그들을 분쇄. 이제, 세포 현탁액을 수집하고 단일 세포 현탁액을 얻....

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결과

도 1에서 우리는 마우스 골수로부터 조혈 줄기 세포의 분리를 위한 게이팅 전략과 그들의 생체 배양에 대한 플레이트의 레이아웃을 보여준다. 도 1A는 SSC-A/FSC-A 플롯에서 림프구 분획의 식별을 나타낸다. 더블ts는 DAPI 신호의 부재에 의해 살아있는 세포의 식별에 이어 단일 게이트에서 제거되었다. 계보-Sca1+cKit+로정의된 LKS 집단이 확인되었다. 이 인구는 줄기와 전구 세포를 포함 하는 것으로 알려져 있다. HSC는 LKS 집단에서 세포의 약 5-10%를 형성하고 CD150+CD48-집단에 대한 게이팅에 의해 확인되었다. 도 1B는 생체 배양에 대한 96웰 플레이트의 레이아웃을 나타낸다. 정렬된 HSC는 서로 다른 .......

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토론

HSC 기능의 엄격한 조절은 유기체의 일생 동안 안정적인 조혈을 유지하는 것이 중요합니다. 본문에 다양 한 다른 세포 유형 처럼, HSC 기능의 조절에 기여 하는 주요 구성 요소는 세포 대사. 우리의 실험실에서 이전 연구9 그리고 다른사람 2,3 HSC에서 뚜렷한 대사 상태를 유지에 미토 콘 드리 아의 중요성을 연루 했다. murine 골수에서 분리 된 HSCs의 매우 낮은 수로 인해, 표준 대사 분석 (예를 들어, SeaHorse와 산소 소비)를 통해 그들을 분석 하기 어렵다. 우리의 이전 작업을 기반으로, 우리는 안정적으로 세포의 낮은 수 (즉, HSC)에서 미토콘드리아 질량과 막 전위 (활성에 대한 간접 판독)를 측정하기 위해 간단한 유세포 분석 분석. 이 분석법은 생존력을 손상시키지 않고 살아있는 세포에 대한 측정을허용합니다 9,사용.......

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공개 사항

이 작품의 일부 요소는 유럽 특허청에 P1828EP00의 출원으로 제출되었습니다.

감사의 글

우리는 UNIL 흐름 세포 분석 코어 시설의 지원에 특히 로메인 베델 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 N.V와 O.N.에 크리스티안 게르하르트 제브슨 재단 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5 mL FACS 튜브, Falcon352235시료 준비
96-U 바닥판Corning3799세포 배양
AutoMACS 프로 분리기Miltenyi Biotec,자동 세포 분리
BD FACS, AriaIII, Becton및 Dickinson세포 분류
BD, IMag 마우스, 조혈전구 세포 농축 키트BD558451계통 고갈
BD, LSRIIBecton 및 DickinsonFACS 수집 기계
BD-DIVABecton 및 Dickinson수집 소프트웨어
CD150 PEBiolegend115904항체 염색 믹스
CD150, PE-Cy5Biolegend115912항체 염색 믹스
CD48 PBBiolegend103418항체 염색 믹스
Centrifuge- 5810REppendorfCentrifugation
Ckit PeCy7Biolegend105814항체 염색 혼합물
Flow joFlowJo LLCFACS 분석 소프트웨어
GraphPad-PrismGraphPad그래프로 데이터 플로팅
Mitotracker GreenInvitrogenM7514미토콘드리아 질량을 측정하기 위한 녹색 형광 미토콘드리아 염색; 작업 농도 = 100 nM; 재고 농도 = 1 mM
니코틴아미드 리보시드 (NR)집에서맞춤형 대사 조절제;작업 농도 = 500 &마이크로; M; 스톡 농도 = 50 mM
PBSCHUV완충액 준비; 작업 농도 = 1x; 스톡 농도 = 1x
Pen-Strep (P/S)생명 기술15140122생체 외 배양; 작업 농도 = 1x; 스톡 농도 = 1x
RBC 용해 버퍼Biolegend420301Lysing Red blood Cells; 작업 농도 = 1x; 스톡 농도 = 10x
재조합 마우스 Flt-3 리간드 (FLT3)RnD427-FL-005 / CFEx vivo 배양; 작업 농도 = 2 ng / mL; 재고 농도 = 10 µ g/mL
재조합 마우스 줄기 세포 인자 (SCF)RnD455-MC-010/CFEx vivo culture; 작업 농도 = 100 ng/mL; 재고 농도 = 50 &마이크로; g/mL
Sca1 APCThermo Fisher Scientific17-5981-82항체 염색 혼합물
StemlineII 조혈 줄기 세포 확장 매체SIGMAS0192Ex 생체 배양
Streptavidin Pac orangeLife TechnologiesS32365항체 염색 혼합물
Streptavidin Tx redLife TechnologiesS872항체 염색 혼합물
TMRMInvitrogenT668염색 미토콘드리아 막 전위; 작업 농도 = 200 nM; 스톡 농도 = 10 mM
초순수 EDTAInvitrogen15575-038버퍼 준비; 작업 농도 = 0.5 M; 스톡 농도 = 1 mM
, , , , , , , , , , , , , , , , 합성된 1000324

참고문헌

  1. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  2. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their l....

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재인쇄 및 허가

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태그

TMRMMitoTrackerFACS

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