방법 논문

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

DOI:

10.3791/60616

⸱

2020년 3월 8일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

초록

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지질은 물에서 불용성 구조적으로 다양한 양과 성 분자입니다. 지질은 생물학적 막의 조직과 기능에 필수적인 기여자, 에너지 저장 및 생산, 세포 신호, 단백질의 포식 수송, 세포 생체 발생, 및 조절 된 세포 사멸. 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae는 철저한 분자 분석을 할 수 있는 단세포 진핵생물이기 때문에, 모형 유기체로 의 사용은 진핵 세포 내의 복잡한 생물학 프로세스에 지질 물질 대사 및 세포내 수송을 연결하는 기계장치를 밝히는 것을 도왔습니다. 효모 세포 내의 주요 지질 류의 강력하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법의 가용성은 이러한 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의 주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 설명된 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 그것은 10 개의 지질 클래스의 각각 내에서 수많은 종 (다른 등심 또는 이소성 형태 포함)의 식별 및 정량화를 가능하게합니다. 이 방법은 민감하고 0.2 pmol /μL의 낮은 농도에서 일부 지질 종의 식별 및 정량을 허용합니다. 이 방법은 전체 효모 세포와 정제 된 소기관의 지질 을 평가하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법에서 전기 분무 이온화 질량 분광법에 대한 대체 이단 첨가제의 사용은 일부 지질 종에 대한 이온화의 효율을 증가시킬 수 있으며 따라서 그들의 식별 및 정량을 향상시키는 데 사용될 수 있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

증거의 몸은 지질, 생체 분자의 주요 클래스 중 하나, 진핵 세포 내에서 많은 중요한 프로세스에 필수적인 역할을 나타냅니다. 이러한 프로세스는 세포 소기관을 둘러싼 혈장 막과 막을 구성하는 지질 이중층의 조립, 세포막을 가로지르는 소분자의 수송, 세포외 환경및 세포내 신호 전이의 변화에 대한 반응, 에너지의 생성 및 저장, 다른 세포기관에 국한된 단백질의 생성 및 수출, 내막 시스템 및 단백질 분비내의 단백질의 반응 인신매매, 여러 세포 세포 분비, 및 단백질 분비의 수강용 인신, 및 여러 세포 세포 내 단백질의 인신 매매를포함합니다. 2,3,4,5,6,7,8,9,10.

신생 효모 S. cerevisiae,단세포 진핵 생물, 성공적으로 이러한 중요한 세포 과정에서 지질의 필수 역할의 기초메커니즘의 일부를 발견하는 데 사용되었습니다4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae는 포괄적인 생화학적, 유전적, 세포 생물학적, 화학적 생물학적, 시스템 생물학적, 및 미세유체 해부 분석21,22,23,24,25를사용할 수 있기 때문에 이러한 메커니즘을 밝히는 귀중한 모델 유기체이다. 지질 대사와 세포내 수송이 이러한 중요한 세포 과정에 기여하는 이해 메커니즘의 추가 진전은 세포 지질의 정량적 특성화에 대한 민감한 질량 분석 기술을 필요로하며, 지질학 분자 복잡성을 이해하고, 정량적 지질학을 시스템 생물학1,2,3,26의다분야 플랫폼으로 통합합니다. 27,28,29,30.

다른 진핵 생물의 효모 세포 및 세포의 질량 분광법 보조 양적 지질학에 대한 현재 의 방법은 충분히 다재다능하거나, 견고하거나, 민감하지 않다. 더욱이, 이들 현재 사용되는 방법은 서로 다양한 등바성 또는 이소성 지질 종을 분화할 수 없다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 허용하는 다재다능하고, 견고하고, 민감한 방법을 기술합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 효모 배양용 멸균제 준비

  1. 1%(vv) 효모 추출물과 2%(vv) 박토펩톤을 함유한 완전한 YP 배지 90 mL를 준비합니다.
  2. 아미노산이 없는 0.67%(w/v) 효모 질소 염기를 함유하는 합성 최소 YNB 배지 90 mL, 20 mg/L-히스티딘, 30 mg/L L-류신, 30 mg/L L-리신,20 mg/L-라이신, 20 mg/L 우라실을 준비합니다.
  3. 전체 YP 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45mL)로 균등하게 나눕니다.
  4. 합성 최소 YNB 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45 mL)로 나눕니다.
  5. 사용하기 45분 전에 15 psi/121°C에서 YP 및 YNB 용지로 플라스크를 오토클레이브합니다.

2. 효모 변형

  1. 야생 형 변형 BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)를사용합니다.

3. 포도당으로 완전한 YP 배지에 효모를 배양하십시오.

  1. 사용 하기 전에 45 분 동안 15 psi/121 °C에서 포도 당의 20% (w/v) 스톡 용액을 오토클레이브.
  2. 멸균 YP 배지를 함유한 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 멸균 20% (w/v) 스톡 용액 5 mL을 추가하여 최종 농도2% 포도당(w/v)을 추가합니다.
  3. 미생물 루프를 사용하여 포도당으로 YP 배지를 함유하는 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 야생형 균주 BY4742의 세포를 접종하였다.
  4. 200 rpm에서 회전 흔들림으로 30°C에서 밤새 세포를 배양하였다.
  5. 효모 문화의 알리쿼트. 혈세포계를 사용하여 배양 mL 당 총 효모 세포 수를 결정합니다.

4. 효모를 포도당으로 합성 최소 YNB 배지로 옮기고 배양하십시오.

  1. 멸균 된 YNB 배지를 함유 한 두 개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 멸균 20 % (w / v) 스톡 용액 5 mL을 최종 농도2 % 포도당 (w / v)에 추가하십시오.
  2. 멸균 피펫을 사용하여 총 5.0 x 107 세포를 포함하는 하룻밤 효모 배양액을 포도당과 함께 YNB 배지를 함유하는 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 전달한다.
  3. 200 rpm에서 회전 흔들림으로 30°C에서 적어도 24 시간(또는 실험이 필요한 경우 이상)에 대해 세포를 배양합니다.

5. 지질 추출을위한 시약, 실험실 용품 및 장비 의 준비

  1. 준비: 1) 고등급(>99.9%) 클로로포름; 2) 고급 등급(>99.9%) 메탄올; 3) 28 % (v / v) 나노 순수에서 수산화 암모늄 용액; 4) 유리 비드 (산 세척, 425-600 μM); 5) 적절한 어댑터가있는 소용돌이; 6) 폴리테트라플루오로에틸렌 라이닝 캡을 가진 15 mL 고속 유리 원심분리기 튜브; 7) 17:1 및 2:1 클로로포름과 메탄올의 혼합물; 8) 0.1% 수산화 암모늄 (v/v)와 클로로포름 / 메탄올 (2 :1) 혼합물; 9) ABC 용액 (155 mM 암모늄 중탄산염, pH = 8.0); 10) 표 1에나타낸 바와 같이 클로로포름과 메탄올의 2:1 혼합물로 제조된 내부 지질 표준의 혼합물; 및 11) 세포 지질의 추출을위한 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 줄 지어 캡 2 mL 유리 샘플 바이알.

6. LC용 시약, 실험실용품 및 장비 준비

  1. 다음을 준비: 1) 아세토니트릴/2-프로판/나노 순수 (65:35:5) 혼합물; 2) 적절한 어댑터가있는 소용돌이; 3) 초음파 초음파 검사기; 4) 웰 플레이트용 인서트가 있는 유리 바이알; 5) 이진 펌프, 탈기, 및 자동 샘플러가 장착 된 LC 시스템; 6) C18 역상 컬럼(2.1 mm; 75 mm; 기공 크기 130 Å; pH 범위 1-11)을 프리 컬럼 시스템에 결합; 7) 혼합물 A: 아세토니트릴/물 (60:40); 및 8) 혼합물 B: 이소프로판올/아세토니트릴 (90:10).

7. 효모 세포에서 지질 추출

  1. 효모 문화의 알리쿼트. 혈세포계를 사용하거나 OD600을 측정하여 배양 mL당 총 효모 세포 수를 결정합니다.
  2. 총 5.0 x 107 셀(3.3 단위 OD600)을포함하는 효모 배양량을 취한다. 이 배양량을 미리 냉각된 1.5 mL 미세원원지 튜브에 넣습니다.
  3. 4 °C에서 1 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 수확하십시오. 상급제는 버리십시오.
  4. 얼음 차가운 나노 순수 1.5 mL을 추가하고 4 °C에서 1 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 씻으하십시오. 상급제는 버리십시오.
  5. 1.5 mL의 얼음 차가운 ABC 용액을 추가하고 4 °C에서 1 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 씻으하십시오. 상급제는 버리십시오. 세포 펠릿은 지질 추출 전에 -80°C에서 보관할 수 있다.
  6. 지질 추출을 시작하려면 얼음에 세포 펠릿을 해동하십시오.
  7. 200 μL의 얼음 차가운 나노 순수에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액을 폴리테트라플루오로에틸렌 라이닝 캡으로 15 mL 고강도 유리 나사 상부 원심분리관으로 옮김을 옮김. 이 튜브에 다음을 추가하십시오: 1) 클로로포름/메탄올(2:1) 혼합물로 제조된 내부 지질 표준의 혼합물의 1) 25 μL; 2) 425-600 μM 산 세척 유리 구슬의 100 μL; 및 3) 클로로포름/메탄올(17:1) 혼합물 600 μL.
  8. 실온(RT)에서 5분 동안 고속으로 튜브를 소용돌이치며 세포를 방해한다.
  9. 지질의 추출을 용이하게하기 위해 RT에서 1 시간 동안 저속으로 튜브를 소용돌이.
  10. 단백질 침전을 촉진하고 수성 및 유기 상을 서로 분리하기 위해 얼음에 15 분 동안 샘플을 배양하십시오.
  11. RT에서 5 분 동안 3,000 x g의 임상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다. 이 원심 분리 단계는 모든 지질 클래스를 포함하는 하부 유기 상으로부터 상부 수성 상을 분리 할 수 있습니다.
  12. 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하여 하부 유기상(~400 μL)을 폴리테트라플루오로에틸렌 라이닝 캡이 있는 다른 15mL 고강도 유리 나사 상부 원심분리관으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 더합니다. 이러한 이송 중에 유리 구슬 또는 상부 수성 상을 방해하지 마십시오. 질소 가스의 흐름 아래 낮은 유기 상을 유지합니다.
  13. 300 μL의 클로로포름-메탄올(2:1) 혼합물을 남은 상부 수성 상에 첨가하여 스핑크고지질과 PA, PS, PI 및 CL. 소용돌이튜브를 RT에서 5분 동안 힘차게 추출할 수 있도록 한다.
  14. RT에서 5 분 동안 3,000 x g의 임상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다.
  15. 보로실리케이트 유리 피펫을 사용하여 원심분리 후 형성된 하부 유기상(~200 μL)을 단계 7.13에서 수집된 유기상으로 이송한다.
  16. 질소 가스의 흐름을 사용하여 결합된 유기 상에서 용매를 증발시보입니다. 질소 가스의 흐름 하에서 지질 막을 포함하는 튜브를 닫습니다. 이 튜브를 -80 °C에 보관하십시오.

8. LC에 의한 추출된 지질의 분리

  1. 7.16단계에서 얻은 지질 막을 함유하는 튜브에 아세토니트릴/2-프로판/나노 순수(65:35:5) 혼합물 500 μL을 첨가한다. RT에서 10초 동안 튜브 3x를 소용돌이치십시오.
  2. 15 분 동안 초음파 초음파 에 튜브의 함량을 주제.
  3. 튜브에서 샘플 100 μL을 가져 와서 웰 플레이트에 사용되는 인서트가있는 유리 병에 추가하십시오. 인서트에 기포를 제거한 후 웰플레이트에 넣습니다.
  4. LC 시스템을 사용하여 프리컬럼 시스템에 결합된 역상 C18 컬럼 CSH상에서 상이한 지질 종을 분리한다(재료 표참조). 분리 하는 동안, 55 °C에서 0.3 mL/min의 유량에서 컬럼을 유지 하십시오.
  5. 혼합물 A (아세토니트릴 / 물 [60 :40 [60 : 40 (v /v)])와 혼합물 B (이소 프로판올 / 아세토니트릴 [90 :10 (v / v)]]로 구성된 이면을 사용하십시오. 전기 분무 이온화(ESI) 이온 소스를 사용하여 생성된 모이온의 검출의 양수 모드의 경우, ESI(+) 모드, 이머지 A 및 B는 최종 농도 10 mM에서 암모늄 포메이트를 함유한다. 모이온 검출의 음의 모드의 경우, ESI(-) 모드, 이동상 A 및 B는 10 mM의 최종 농도에서 암모늄 아세테이트를 함유한다.
  6. ESI(+) 및 ESI(-) 모드모두에 주입할 때 10 μL의 샘플 볼륨을 사용하십시오.
  7. 다음 LC 구배를 사용하여 LC에 의해 상이한 지질 종을 분리: 0-1 분 10% (상 B); 1-4 분 60 % (단계 B); 4-10 분 68 % (단계 B); 10-21 97% (단계 B); 21-24 분 97 % (단계 B); 24-33 분 10 % (단계 B).
  8. 추출 공백을 첫 번째 샘플, 4개 샘플 마다 및 마지막 샘플로 실행합니다. 데이터를 정규화하려면 배경을 뺍니다.
  9. 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 지질의 LC/MS 데이터로부터의 대표적인 총 이온 크로마토그램은 도 1에나타내었다.

9. LC에 의해 분리된 지질의 질량 분광 분석

  1. HESI(가열된 전기 분무 이온화) 이온 공급원이 장착된 질량 분석기를 사용하여 LC로 분리된 지질을 분석합니다. 표 2에제공된 설정을 사용합니다.
  2. 푸리에 변환 분석기를 사용하여 60,000D의 해상도와 150-2,000 Da의 질량 범위 내에서 모이온(MS1)을 검출합니다.
  3. 표 3에 제공된 설정을 사용하여 이차 이온(MS2)을 검색합니다.

10. LC-MS/MS의 원시 데이터 처리를 통해 다른 지질 등급 및 종의 식별 및 정량화

  1. 원시 LC-MS/MS 파일에서 다른 지질의 식별 및 정량을 수행 하려면 소프트웨어에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 이 소프트웨어는 150만 개 이상의 지질 이온 전구체(MS1)와 예측 된 단편 이온 (MS2)을 포함하는 가장 큰 지질 데이터베이스를 사용합니다. 이 소프트웨어는 또한 지질 정량에 대한 MS1 피크와 지질 식별MS2를 사용합니다. 두 개의 이소메릭 포스파티딜세린 형태(34:0)의 대표적인 크로마토그램은 m/z 값이 동일하지만 유지 시간은 다르지만 MS1 및 MS2 스펙트럼은 각각 그림 2, 그림 3및 그림 4에나타내었습니다.
  2. 전체 스캔 MS1 데이터 및 데이터 의존 MS2 데이터를 포함하는 LC-MS 원시 파일을 무료로 검색 (비에스테르화) 지방산 (FFA), 카디오리핀 (CL), 피토스핑고신 (PHC), 피토스핑고신 (PHS), 포스파티딜콜린 (PC), 포스파디딜렌 olamine (PE), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티딜리노시톨 (PI), 포스파티딜세린 (PS), 트리아실글리세롤 (TAG) 지질 클래스는 전구체 이온에 대해 5 ppm의 m/z 허용 오차를 사용하고 제품 이온의 경우 10 ppm입니다. 다른 검색 매개 변수는 표 4에나와 있습니다. 소프트웨어 사용 설명서에 제공된 지침을 따르십시오. 특이한 지방산 조성을 가진 내부 지질 표준 및 지질 종의 정체성은 수동으로 확인될 필요가 있습니다.
  3. 지질 검색 소프트웨어에 대해 자유롭게 사용할 수 있는 오픈 소스 대안의 도움으로 다양한 지질 클래스 및 종을 식별하고 정량화하려면 지질 데이터분석기(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine2(http://mzmine.github.io/)또는 XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) 소프트웨어를 사용하여 LC-MS/MS에서 원시 데이터를 처리합니다.

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결과

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LC-MS/MS의 도움으로 효모 세포 내의 주요 세포 지질의 정량적 평가를 위한 우리의 방법은 다재다능하고 견고했습니다. 처음에는 2% 포도당을 함유하는 합성 최소 YNB 배지에서 배양된 S. 세레비시아세포에서 10개의 상이한 지질 클래스를 식별하고 정량화할 수 있었습니다. 이러한 지질 클래스는 무료(비제스테레화) 지방산(FFA), CL, 피토세라미드(PHC), 피토스핑고신(PHS), PC, PE, PG, PI, PS 및TAG(보충표 1)를포함한다. 이들 클래스의 수많은 분자 종은 이 LC-MS/MS 방법을 사용하여 확인및 정량화되었다(보충표1).

우리의 LC-MS/MS 방법도 민감했습니다. 실제로, 0.165 pmol/μL의 낮은 농도에서 지질의 분자 종의 식별 및 정량화를 가능하게 하...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 는 다음과 같은 예방 조치가 중요합니다.

1. 클로로포름과 메탄올은 독성이 있습니다. 실험실 플라스틱 제품 및 피부를 포함한 표면에서 다양한 물질을 효율적으로 추출합니다. 따라서 이러한 유기 용매는 클로로포름 및/또는 메탄올과 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 않고, 이러한 단계에 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하고, 사용하기 전에 엽록소와 메탄올로 피펫을 헹구어 주의하십시오.

2. 메탄올 /클로로 폼 (17 :1) 혼합물에 의한 지질 추출 중에 보로 실리 케이트 유리 파이펫을 사용하여 낮은 유기 상 (~ 400 μL)을 폴리테트라 플루오로에틸렌 줄 지어있는 15 mL 고강도 유리 나사 상단 원심 분리 튜브로 옮니다. 이러한 이송 중에 유리 구슬 또는 상부 수성 상을 방해하지 마십시오. 질소 가스의 흐름 아래 낮은 유기 상을 유지합니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 토론을 위해 Titorenko 실험실의 현재 및 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분석의 생물학적 응용 을위한 센터와 구조 및 기능 유전체학 센터 (모두 콩코르디아 대학에서) 뛰어난 서비스를 인정합니다. 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482) 콩코르디아 대학 의자 기금 (CC0113). K.M.은 콩코르디아 대학 공로상을 수상했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL 고속 유리 원심분리기 튜브(테플론 라이닝 캡 포함PYREX05-550
2mL 유리 시료 바이알(테플론 라이닝 캡 포함Fisher Scientific60180A-SV9-1P
2-프로판올Fisher ScientificA461-500
아세토니트릴Fisher ScientificA9554
Agilent 1100 시리즈 LC 시스템Agilent 기술G1312A
Agilent1100 웰플레이트Agilent TechnologiesG1367A
아세트산 암모늄Fisher ScientificA11450
중탄산 암모시그마9830
포름산 암모늄Fisher ScientificA11550
수산화 암모늄Fisher ScientificA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinAvanti Polar Lipids750332
Centra CL2 임상 원심분리기Thermo Scientific004260F
CeramideAvanti Polar Lipids860517
ChloroformFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944Pre-column 시스템
유리 지방산 (19:0)Matreya1028
유리 구슬 (산 세척, 425-600 μ M)Sigma-AldrichG8772
포도Fisher ScientificD16-10
혈구계Fisher Scientific267110
L-histidineSigmaH8125
지질 검색 소프트웨어(V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS 분석 소프트웨어
L-류신SigmaL8912
L-라이신SigmaL5501
메탄올Fisher ScientificA4564
포스파티딜콜린Avanti 극성 지질850340
포스파티딜에탄올아민Avanti 극성 지질850704
포스파티딜글리세롤Avanti 극성 지질
포스파티딜이노시톨Avanti Polar LipidsLM1502
포스파티딜세린Avanti Polar Lipids840028
역상 컬럼 CSH C18Waters186006102
SphingosineAvanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
트리실글리세롤, 라로단, 말뫼태그, 혼합 FA
초음파 초음파 발생기, Fisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
Vortex, Fisher Scientific2215365
효모 추출물Fisher ScientificBP1422-2
아미노산이 없는 효모 질소 염기, Fisher ScientificDF0919-15-3
효모 균주 BY4742DharmaconYSC1049
) ) 늄 당 840446, , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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