방법 논문

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

DOI:

10.3791/60616

⸱

2020년 3월 8일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

이 논문에서

요약

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우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

초록

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지질은 물에서 불용성 구조적으로 다양한 양과 성 분자입니다. 지질은 생물학적 막의 조직과 기능에 필수적인 기여자, 에너지 저장 및 생산, 세포 신호, 단백질의 포식 수송, 세포 생체 발생, 및 조절 된 세포 사멸. 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae는 철저한 분자 분석을 할 수 있는 단세포 진핵생물이기 때문에, 모형 유기체로 의 사용은 진핵 세포 내의 복잡한 생물학 프로세스에 지질 물질 대사 및 세포내 수송을 연결하는 기계장치를 밝히는 것을 도왔습니다. 효모 세포 내의 주요 지질 류의 강력하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법의 가용성은 이러한 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의 주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 설명된 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 그것은 10 개의 지질 클래스의 각각 내에서 수많은 종 (다른 등심 또는 이소성 형태 포함)의 식별 및 정량화를 가능하게합니다. 이 방법은 민감하고 0.2 pmol /μL의 낮은 농도에서 일부 지질 종의 식별 및 정량을 허용합니다. 이 방법은 전체 효모 세포와 정제 된 소기관의 지질 을 평가하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법에서 전기 분무 이온화 질량 분광법에 대한 대체 이단 첨가제의 사용은 일부 지질 종에 대한 이온화의 효율을 증가시킬 수 있으며 따라서 그들의 식별 및 정량을 향상시키는 데 사용될 수 있다.

서론

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증거의 몸은 지질, 생체 분자의 주요 클래스 중 하나, 진핵 세포 내에서 많은 중요한 프로세스에 필수적인 역할을 나타냅니다. 이러한 프로세스는 세포 소기관을 둘러싼 혈장 막과 막을 구성하는 지질 이중층의 조립, 세포막을 가로지르는 소분자의 수송, 세포외 환경및 세포내 신호 전이의 변화에 대한 반응, 에너지의 생성 및 저장, 다른 세포기관에 국한된 단백질의 생성 및 수출, 내막 시스템 및 단백질 분비내의 단백질의 반응 인신매매, 여러 세포 세포 분비, 및 단백질 분비의 수강용 인신, 및 여러 세포 세포 내 단백질의 인신 매매를포함합니다. 2,3,4,5,6,7,8,9,10.

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프로토콜

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1. 효모 배양용 멸균제 준비

  1. 1%(vv) 효모 추출물과 2%(vv) 박토펩톤을 함유한 완전한 YP 배지 90 mL를 준비합니다.
  2. 아미노산이 없는 0.67%(w/v) 효모 질소 염기를 함유하는 합성 최소 YNB 배지 90 mL, 20 mg/L-히스티딘, 30 mg/L L-류신, 30 mg/L L-리신,20 mg/L-라이신, 20 mg/L 우라실을 준비합니다.
  3. 전체 YP 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45mL)로 균등하게 나눕니다.
  4. 합성 최소 YNB 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45 mL)로 나눕니다.
  5. 사용하기 45분 전에 15 psi/121°C에서 YP 및 YNB 용지로 플라스크를 오토클레이브합니다.

2. 효모 변형

  1. 야생 형 변형 BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)를사용합니다.

3. 포도당으로 완전한 YP 배지에 효모를 배양하십시오.

  1. 사용 하기 전에 ....

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결과

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LC-MS/MS의 도움으로 효모 세포 내의 주요 세포 지질의 정량적 평가를 위한 우리의 방법은 다재다능하고 견고했습니다. 처음에는 2% 포도당을 함유하는 합성 최소 YNB 배지에서 배양된 S. 세레비시아세포에서 10개의 상이한 지질 클래스를 식별하고 정량화할 수 있었습니다. 이러한 지질 클래스는 무료(비제스테레화) 지방산(FFA), CL, 피토세라미드(PHC), 피토스핑고신(PHS), PC, PE, PG, PI, PS 및TAG(보충표 1)를포함한다. 이들 클래스의 수많은 분자 종은 이 LC-MS/MS 방법을 사용하여 확인및 정량화되었다(보충표1).

우리의 LC-MS/MS 방법도 민감했습니다. 실제로, 0.165 pmol/μL의 낮은 농도에서 지질의 분자 종의 식별 및 정량화를 가능하게 하.......

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토론

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여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 는 다음과 같은 예방 조치가 중요합니다.

1. 클로로포름과 메탄올은 독성이 있습니다. 실험실 플라스틱 제품 및 피부를 포함한 표면에서 다양한 물질을 효율적으로 추출합니다. 따라서 이러한 유기 용매는 클로로포름 및/또는 메탄올과 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 않고, 이러한 단계에 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하고, 사용하기 전에 엽록소와 메탄올로 피펫을 헹구어 주의하십시오.

2. 메탄올 /클로로 폼 (17 :1) 혼합물에 의한 지질 추출 중에 보로 실리 케이트 유리 파이펫을 사용하여 낮은 유기 상 (~ 400 μL)을 폴리테트라 플루오로에틸렌 줄 지어있는 15 mL 고강도 유리 나사 상단 원심 분리 튜브로 옮니다. 이러한 이송 중에 유리 구슬 또는 상부 수성 상을 방해하지 마십시오. 질소 가스의 흐름 아래 낮은 유기 상을 유지합니다.

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공개 사항

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저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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우리는 토론을 위해 Titorenko 실험실의 현재 및 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분석의 생물학적 응용 을위한 센터와 구조 및 기능 유전체학 센터 (모두 콩코르디아 대학에서) 뛰어난 서비스를 인정합니다. 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482) 콩코르디아 대학 의자 기금 (CC0113). K.M.은 콩코르디아 대학 공로상을 수상했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL 고속 유리 원심분리기 튜브(테플론 라이닝 캡 포함PYREX05-550
2mL 유리 시료 바이알(테플론 라이닝 캡 포함Fisher Scientific60180A-SV9-1P
2-프로판올Fisher ScientificA461-500
아세토니트릴Fisher ScientificA9554
Agilent 1100 시리즈 LC 시스템Agilent 기술G1312A
Agilent1100 웰플레이트Agilent TechnologiesG1367A
아세트산 암모늄Fisher ScientificA11450
중탄산 암모시그마9830
포름산 암모늄Fisher ScientificA11550
수산화 암모늄Fisher ScientificA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinAvanti Polar Lipids750332
Centra CL2 임상 원심분리기Thermo Scientific004260F
CeramideAvanti Polar Lipids860517
ChloroformFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944Pre-column 시스템
유리 지방산 (19:0)Matreya1028
유리 구슬 (산 세척, 425-600 μ M)Sigma-AldrichG8772
포도Fisher ScientificD16-10
혈구계Fisher Scientific267110
L-histidineSigmaH8125
지질 검색 소프트웨어(V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS 분석 소프트웨어
L-류신SigmaL8912
L-라이신SigmaL5501
메탄올Fisher ScientificA4564
포스파티딜콜린Avanti 극성 지질850340
포스파티딜에탄올아민Avanti 극성 지질850704
포스파티딜글리세롤Avanti 극성 지질
포스파티딜이노시톨Avanti Polar LipidsLM1502
포스파티딜세린Avanti Polar Lipids840028
역상 컬럼 CSH C18Waters186006102
SphingosineAvanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
트리실글리세롤, 라로단, 말뫼태그, 혼합 FA
초음파 초음파 발생기, Fisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
Vortex, Fisher Scientific2215365
효모 추출물Fisher ScientificBP1422-2
아미노산이 없는 효모 질소 염기, Fisher ScientificDF0919-15-3
효모 균주 BY4742DharmaconYSC1049
) ) 늄 당 840446, , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8)....

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재인쇄 및 허가

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