방법 논문

고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

DOI:

10.3791/60849

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2022년 5월 27일

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1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 싱크로트론 기반 X선 흡수 분광법 실험을 위한 생물학적 냉동 샘플을 준비하기 위한 상세한 절차를 제시합니다. 우리는 암 및 식물성 플랑크톤 세포를 사용한 프로토콜의 예를 통해 샘플 준비 및 냉동 보존을 최적화하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 방법은 샘플 냉동 준비의 보편적 인 표준을 제공합니다.

초록

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X 선 흡수 분광법 (XAS)을 가진 원소에 대한 연구는 생물학적 시스템에서 금속의 역할을 연구 할 때 특히 중요합니다. 샘플 준비는 특히 생물학적 샘플의 경우 중요하고 종종 복잡한 절차입니다. X선 종분화 기술이 널리 사용되고 있지만, 이 기술의 사용자를 위한 상세한 프로토콜은 아직 보급되지 않았다. 또한, 화학적 상태 변형이 우려되며, 냉동 기반 기술은 세포 또는 조직의 화학적 완전성의 최대 보존을 제공하기 위해 그들의 거의 자연적인 수화 상태에서 생물학적 샘플을 분석하는 것이 좋습니다. 여기에서, 우리는 냉동 보존 샘플에 기초한 세포 준비 프로토콜을 제안한다. 그것은 암세포에서 셀레늄에 대한 높은 에너지 분해능 형광 검출 X 선 흡수 분광법 연구와 식물성 플랑크톤의 철분 연구에서 입증되었습니다. 이 프로토콜은 조사에 의해 손상될 수 있는 다른 생물학적 샘플 및 다른 X선 기술과 함께 사용될 수 있다.

서론

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필수 또는 독성 요소의 세포 생물 변환에 대한 연구는 높은 감도의 종분화 기술을 필요로하며 종종 화학 종의 변형되기 쉬운 샘플 준비 단계를 최소화해야합니다.

셀레늄 및 철과 같은 생리 원소는 복잡한 화학, 셀레늄 또는 철 종의 다양한 안정성, ppm (mg / kg) 또는 심지어 ppm 이하 범위의 낮은 농도로 인해 지정하기가 특히 어려운 것으로 알려져 있습니다. 따라서 XAS에 의한 이러한 요소의 종분화에 대한 연구는 매우 어려울 수 있습니다. 싱크로트론 XAS 및 특히 매우 낮은 신호 대 배경 비율1을 허용하는 고에너지 분해능 형광 검출 XAS (HERFD-XAS)는 싱크로트론 소스에서 복잡한 생물학적 매트릭스 2,3에서 고도로 희석된 원소를 지정하기 위해 사용할 수 있다. 기존의 형광-XAS 측정은 유럽 싱크로트론 방사 시설(ESRF)4의 CRG-FAME 빔라인에서 에너지 대역폭이 150–250eV에 달하는 에너지 분해 고체 상태 검출기(SSD)를 사용하여 수행할 수 있으며, HERFD-XAS 측정에는 ESRF2

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프로토콜

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1. 셀레늄 종분화를 위한 인간 PC-3 및 OVCAR-3 암세포 펠렛의 제조

참고: 다음 프로토콜은 Weekley et al.10에서 채택되었습니다. 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 생물 안전 레벨 2 조건 및 제한 하에서 세포 배양 후드 하에서 수행되어야합니다.

  1. Malassez 셀 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계수하십시오. PC-3 세포주를 위해 플라스크 당 150,000-200,000 세포를 시드하고 OVCAR-3 세포주에 대해 300,000 세포를 시드한다.
  2. T-75 플라스크 내의 종자 세포(삼중을 갖기 위해 조건 당 3개의 플라스크)를 층류 후드 하에 적절한 세포 배양 배지(표 1)에 넣는다.
  3. 세포 배양물을 80% 합류에 도달할 때까지 37°C의 인큐베이터 및 5%CO2 로 가습된 분위기에서 성장시키도록 방치한다. 일반적으로 PC-3 전립선암 세포주는 24시간 후에 두 배, OVCAR-3 난소암 세포주는 72시간이 걸립니다. 플라스크는 인큐베이터에 두어야합니다.
  4. 한편, 처리에 사용된 Se-NPs를 세포독성 평가를 위한 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디....

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결과

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이 제제의 주요 목적은 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)와 암세포 간의 상호 작용, 그리고 식물성 플랑크톤에서의 철 결합 및 격리를 조사하는 것이 었습니다.

초기 상태(BSA Se-NPs) 및 영양 배지에서 배양된 세포(BSA Se-NPs)에서의 셀레늄의 HERFD-XANES 스펙트럼(24시간 배양 후 BSA Se-NPs)은 도 10에 나타내었다. 결과는 초기 Se-NPs의 셀레늄이 Se(0)와 셀레나이트-유사 형태로 모두 존재하는 반면, PC-3 세포와의 상호작용 후 세포의 셀레늄은 주로 Se(0)으로 존재하여 세포에서 셀레늄 종의 변화를 입증하였다. 철의 경우, 참조의 HERFD-XANES 스펙트럼은 철 산화 상태에 따라 뚜렷한 엣지 위치를 보였으며, 감소된 철 종은 낮은 에너지 값으로 이동했습니다(그림 11). 규조류 펠릿의 동일.......

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토론

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이 프로토콜은 X선 흡수 분광법에 의해 생물학적 샘플에서 셀레늄과 철의 화학적 형태를 연구하는데 사용되었다. 생물학적 샘플 및 참조 화합물의 냉동 준비 및 저장뿐만 아니라 HERFD-XAS 측정에 중점을 둡니다.

Cryo-preparation and storage
벌크 생물학적 샘플 펠릿의 동결-준비는 샘플에 존재하는 종의 화학적 완전성의 보존을 허용한다. 이는 제제6을 위해 동결건조 또는 공기건조를 사용할 때 종분화 변화가 관찰되었기 때문에 매우 중요하다. 이 프로토콜은 측정을 위해 선택된 빔라인에 헬륨 냉동 스탯이 장착되는 즉시 사용해야 합니다.

참조 화합물의 경우, 산화 상태를 보존하기 위해 산화 환원 민감성 요소를 사용할 때 무산소 분위기에서 작업해야합니다. 그런 다음 철 및 철 기준 화합물에 대해 표시된 바와 같이 스펙트럼 에지 위치의 변화로 .......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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우리는 CEMHTI (Orleans, France, ANR-13-BS08-0012-01) 및 Labex OSUG@2020 (Grenoble, France, ANR-10-LABX-0056)의 빔 라인 개발에 재정적 기여에 감사드립니다. FAME-UHD 프로젝트는 프랑스 "그랜드 엠프런트"EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG 컨소시엄 및 INSU CNRS 연구소가 재정적으로 지원합니다. 우리는 실험 중 특히 BM30B 및 BM16에서 일하는 모든 사람들에게 모든 기여에 감사드립니다. 저자들은 싱크로트론 방사선 빔타임의 제공을 위해 유럽 싱크로트론 방사선 시설을 인정한다. 우리는 또한 재정 지원을위한 PHYTOMET ANR 프로젝트 (ANR-16-CE01-0008) 및 재정 지원을위한 SEDMAC 프로젝트 (INCA-Plan cancer-ASC16019CS)를 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
질산암모늄Sigma-AldrichA3795NH4NO3, 2.66 mg/L의 milliQ 물
혐기성 챔버Coy Laboratory, 미국혐기성 모니터(CAM-12)를 갖춘
항생제 재고Sigma-AldrichA0166, 스트렙토마이신 황산염용 S9137milliQ 물 1mL/L(암피실린 나트륨 및 스트렙토마이신 황산염, 100mg/mL)
질화붕소 분말Sigma-Aldrich255475
세포 계수 챔버Neubauer 또는 Malassez
세포 스크레이퍼
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)GIBCO14190-094칼슘, 마그네슘, 페놀 제외
Red Eppendorf 튜브0.5 mL 및 1.5 mL
Falcon 튜브15 mL 및 50 mL
구연산철 Fe / 구연산염 = 1/20Sigma-AldrichF3388수용액 FeCl3 50 mM 및 Na-citrate 1M pH 6.5
소 태아 혈청GIBCOA31604-02Performance Plus, 인증 된 One Shot 형식, 미국 원산지
플라스크Sigma-AldrichZ707503TPP 150 cm2 영역
성장 챔버SanyoSanyo MLR-35220 °에서 ; C 및 12:12 라이트 (3,000lux) 다크 체제
HEPES 버퍼Sigma-AldrichH40341 g / L의 milliQ 물 HEPES
고급 serous, OVCAR-3ATCC, Rockville, MDHTB-161보관 온도 : 액체 질소 증기 온도
인큐베이터37 °C에서 인큐베이터; C,
소 췌장에서 5% CO2 인슐린 용액으로Sigma-AldrichI051625mM HEPES의 10mg/mL 인슐린, pH 8.2, BioReagent, 멸균 여과, 세포 배양에 적합
수동 유압 프레스Specac, 미국
해양 규조류 Phaeodactylum tricornutumRoscoff 배양 컬렉션RCC69http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
모르폴린프로판설폰산시그마-알드리치M3183걸레, 250mg/L의 milliQ 물(pH 7.3)
광학 현미경
PC-3ECCAC, 솔즈베리, 영국90112714보관 온도: 액체 질소 증기 온도
페니실린-스트렙토마이신시그마-알드리치P4333페니실린 10,000 단위 및 10mg 스트렙토마이신/mL로 안정화된 용액, 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합
Pipette-boy25mL-, 10mL- 및 5mL 멸균 플라스틱 피펫
플랑크톤 배양 제품, Mf 배지: Sea saltsSigma-AldrichS988340g/L의 milliQ 물. 구성: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
플라스틱 핀셋Oxford InstrumentAGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)GIBCOA10491-014.5 g / L D- 포도당, 1.5 g / L 중탄산 나트륨, 110 mg / L (1 mM) 피루브 산 나트륨, 2.388 g / L (10 mM) HEPES 완충액 및 연구 용
셀레늄 나노 입자 (Se-NP), BSA 코팅, 2 mg / mLNANOCS Company, 미국Se50-BS-1BSA 안정화 Se-NP 용액. 평균 크기는 약 30nm입니다. 4°deg에 저장; C 어둠 속에서 빛으로부터 보호됩니다.
셀레늄 나노 입자 (Se-NP), 키토산 코팅, 2 mg / mLNANOCS Company, 미국11. Se50-CS-1키토산 안정화 Se-NP 용액. 평균 크기는 약 30nm입니다. 4°deg에 저장; C 어둠 속에서 빛으로부터 보호됩니다.
메타규산 나트륨 수화물시그마-알드리치71746Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L 밀리큐 물
산나트륨시그마-알드리치S5022NaNO3, 75 mg/L 밀리큐 물
인산나트륨 일염기시그마-알드리치S5011NaH2PO4, 15 mg/L 밀리큐 물
T-75 플라스크
조직 배양 후드
미량 금속 원료Sigma-AldrichM5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 2298571 mL/L의 milliQ 물(MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20 mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)GIBCO15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드GIBCO25300-054
비타민 스톡Sigma-AldrichT1270, 비오틴에 대한 B4639, B12에 대한 V6629milliQ 물 1 mL / L (티아민 HCl 20 mg / L, 비오틴 1 mg / L, B12 1 mg / L)
수조 37 ° 씨
, 가습된 분위기 질성 티아민에 대한

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104(2012).
  2. Proux, O., et al.

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