방법 논문

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

DOI:

10.3791/62023

⸱

2021년 5월 16일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

이 논문에서

요약

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조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.

초록

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심혈 관 질환은 전 세계적으로 사망률의 가장 널리 퍼진 원인이며 종종 변경 된 심장 기능으로 심실 강성 증가로 이어질 수있는 고조 된 심장 섬유증에 의해 표시됩니다. 심장 심실 섬유증의 이러한 증가는 상주 섬유아세포의 활성화에 기인하지만, 이러한 세포가 기준선 또는 활성화 후 3차원(3-D) 심장 내에서 어떻게 작동하는지 잘 이해되지 는 않는다. 섬유아세포가 심장 질환과 3D 심장의 역학에 어떻게 기여하는지 조사하기 위해, 전체 마우스 심장 내에서 형광으로 표지된 심장 섬유아세포를 보여주는 세련된 CLARITY 기반 조직 클리어링 및 이미징 방법이 개발되었습니다. 조직 거주자 섬유아세포는 Rosa26-loxP-eGFP 플로레스센트 리포터 마우스를 사용하여 Tcf21-MerCreMer 노크 라인을 표현하는 심장 섬유아세포와 교차하여 유전적으로 표지되었습니다. 이 기술은 건강한 마우스와 심장 질환의 섬유성 마우스 모델에서 전체 성인 왼쪽 심실전체에 걸쳐 섬유아세포 국소화 역학을 관찰하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 하나의 부상 모델에서, 심장 섬유아세포의 독특한 패턴은 수축 방향으로 포장 된 섬유의 밴드를 따라 부상당한 마우스 심장에서 관찰되었다. 허혈성 상해 모형에서, 섬유아세포 죽음이 생겼고, 광원 국경 지역에서 재인구에 선행되었습니다. 종합적으로, 이 정제된 심장 조직 명확히 기술과 디지털화된 화상 진찰 시스템은 조직 처리로 인해 손실된 형광을 둘러싼 항체 침투 실패 또는 이전 문제점의 제한 없이 심장에 있는 심장 섬유아세포의 3-D 시각화를 허용합니다.

서론

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심근 세포는 심혼에 있는 가장 큰 부피 분획을 포함하더라도, 심장 섬유아세포는 더 풍부하고 이 기관의 기준선 구조 및 배상 특징을 통제에 비판적으로 관련시게 관련시게 관련시다. 심장 섬유아세포는 이동성이 뛰어나고 기계적으로 반응하며, 활성화 정도에 따라 전형적으로 다양합니다. 심장 섬유아세포는 세포외 매트릭스(ECM)의 정상 수준을 유지하는 데 필요하며, 이들 세포에 의한 ECM 생산량이 너무 적거나 너무 많으며 질병1,2,3로이어질 수 있다. 질병에 그들의 중요성을 감안할 때,심장 섬유세포는 특히 과도한 섬유증4,5,6,7을제한하는 시도에서 새로운 치료 전략을 식별하는 쪽으로 조사의 점점 더 중요한 주제가되고 있습니다. 부상 시 섬유아세포는 증식및 풍부한 ECM을 분비할 수 있을 뿐만 아니라 심실을 리모델링하는 데 도움이 되는 수축 활성을 갖는 근섬유세포로 알려진 합성 세포 유형으로 활성화되고 분화....

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프로토콜

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마우스를 관련시키는 모든 실험은 신시내티 아동 병원 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 기관은 또한 AAALAC (실험실 동물 관리의 인증을위한 미국 협회)인증을 받았습니다. 마우스는 자궁 경부 탈구를 통해 안락사되었고, 생존 수술 수술을 받은 마우스는 통증 완화를 받았다(아래 참조). 통증 관리 및 안락사에 사용되는 모든 방법은 미국 수의학 협회의 안락사 패널의 권고에 근거합니다. 모든 마우스는 항상 사용할 수있는 물과 음식이있는 옥수수 침대 침구 단위에 보관되었습니다. 마우스는 동성케이지에 4마리를 보관하였다. 수술 이나 부상 되지 않은 조직 정리에 대 한, 6-8 주 된 남성과 여성 마우스의 동일한 수를 사용 했다.

참고: 모든 수술에서 멸균 수술 조건이 유지되었습니다. 외과 의사는 깨끗한 스크럽과 멸균 가운으로 변경한 다음 신발 커버와 헤어넷을 착용했습니다. 외과 의사는 클로르헨시딘으로 손을 닦고 멸균 수술 장갑을 착용했습니다. 외과 의사는 절개 부위를 각각 3 번 진정, 면도 및 스크러빙한 기술자의 도움을 받아 2 % 클로로 우디신 글루코네이트와 70 %의 이소프로판올을 번갈아 가며 했습니다. 마우스는 그 때 외과 의사에게 가져왔고, 수술은 행해졌습니다. 동물 들 사이, 악기는 비드....

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결과

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심장 섬유아세포는 심장의 기준선 기능뿐만 아니라 심장 손상에 대한 반응에 필수적입니다. 이러한 세포의 배열 과 형태를 이해 하기 위해 이전 시도 2-D 설정에서 크게 실시 되었습니다. 그러나, 정제된 심장 조직 클리어링(도2)및 3-D 이미징 기술이 발표되어 심장 섬유아세포의 고급적이고 상세한 시각화를 가능하게 한다. 이 이미징 기술로, 섬유 아세포는 조밀하게 포장되고 부상되지 않은 심혼에 있는 가시적인 형태가 있는 것을 발견되었습니다(그림 3, 보충 동영상 S1-4).

왼쪽 심실 조직 클리어링은 부상되지 않은 심장에서 달성 된 후, 프로토콜은 부상 심장 조직을 연구 할 때이 클리어링 프로토콜이 수행하는 방법을 조사하기 위해 여러 부상 모델에 적용되었다. 마우스는 좌측 관상동맥(LCA)의 임시 폐쇄에 의해 I/R 손상을 입었으며, 그 다음으로 .......

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토론

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이 문서는 생체 내에서 심장 섬유아세포의 시각화를 허용하는 조직 정리를 위한 정제된 방법을 제시합니다, 기준선과 다음 상해둘 다, 마우스 심혼에 있는 섬유아세포를 특성화하고 더 잘 이해하기 위하여. 이러한 향상된 프로토콜은 성인 또는 신생아 심장12,13,14,16,17,20에서특정 세포 유형을 식별하려고 시도한 기존 조직 청산프로토콜의 한계를다룹니다. 마우스 심혼을 지우려는 초기 시도에서, 수동 적인 CLARITY 기술이 사용되었고, 여기서 심장은조직(15,18)에걸쳐 버퍼.......

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공개 사항

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저자는이 원고의 내용과 관련된 공개가 없습니다.

감사의 글

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저자는 이 모형의 발달에 있는 그들의 원조 그리고 지도에 대한 CCHMC Confocal 화상 진찰 코어를 인정하고 싶습니다, 뿐 아니라 모든 3D 인쇄된 부분의 디자인을 위한 임상 공학에서 매트 바티. Demetria Fischesser는 건강의 국가 학회에서 교육 교부금에 의해 지원되었다, (NHLBI, T32 HL125204) 그리고 제프리 D. 몰켄틴하워드 휴즈 의료 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-0 꼰 실크EthiconK871H
8-0 프롤렌Ethicon8730H
40% 아크릴아미드 용액Bio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
인공 눈물 연고Covetrus048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture 국소 티슈 접착제World Precision Instruments503763
HeparinSigmaH0777
Imaris Start Analysis SoftwareOxford InstrumentsN/A Micro-osmotic
pumpsAlzetModel 1002
Nikon Elements Analysis SoftwareNikonN/A
니콘 A1R HD 정립 현미경니콘N/A
일반 오토클레이브 차우Labdiet5010
Nycodenz, 5-(N-2, 3-디하이드록시프로필아세타미도)-2, 4, 6-트리-요오도-N,
N'-bis(2, 3 디하이드록시프로필) 이소프탈아미드		CosmoBioAXS-1002424
파라포름알데히드전자 현미경 과학15710
페닐에프린 염산염시그마P6126-10G
광개시Wako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax 재고 번호:012429
아지드화 나트륨시그마 AldrichS2002-5G
염화나트륨 솔루션Hospira, Inc.NDC 0409-4888-10
타목시펜시그마 알드리치T5648
타목시펜 식품EnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine, 탈색제Millipore Sigma122262-1L
X-Clarity 전기영동 투명화 챔버Logos BiosystemsC30001
X-Clarity 전기영동 투명화 솔루션Logos BiosystemsC13001
X-Clarity 전기영동 조직 바구니Logos BiosystemsC12001
X-Clarity 전기영동 조직 바구니 홀더Logos BiosystemsC12002
제

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H.

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