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방법 논문

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

4.4K 조회수

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DOI:

10.3791/62023

⸱

2021년 5월 16일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

이 논문에서

요약

조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.

초록

심혈 관 질환은 전 세계적으로 사망률의 가장 널리 퍼진 원인이며 종종 변경 된 심장 기능으로 심실 강성 증가로 이어질 수있는 고조 된 심장 섬유증에 의해 표시됩니다. 심장 심실 섬유증의 이러한 증가는 상주 섬유아세포의 활성화에 기인하지만, 이러한 세포가 기준선 또는 활성화 후 3차원(3-D) 심장 내에서 어떻게 작동하는지 잘 이해되지 는 않는다. 섬유아세포가 심장 질환과 3D 심장의 역학에 어떻게 기여하는지 조사하기 위해, 전체 마우스 심장 내에서 형광으로 표지된 심장 섬유아세포를 보여주는 세련된 CLARITY 기반 조직 클리어링 및 이미징 방법이 개발되었습니다. 조직 거주자 섬유아세포는 Rosa26-loxP-eGFP 플로레스센트 리포터 마우스를 사용하여 Tcf21-MerCreMer 노크 라인을 표현하는 심장 섬유아세포와 교차하여 유전적으로 표지되었습니다. 이 기술은 건강한 마우스와 심장 질환의 섬유성 마우스 모델에서 전체 성인 왼쪽 심실전체에 걸쳐 섬유아세포 국소화 역학을 관찰하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 하나의 부상 모델에서, 심장 섬유아세포의 독특한 패턴은 수축 방향으로 포장 된 섬유의 밴드를 따라 부상당한 마우스 심장에서 관찰되었다. 허혈성 상해 모형에서, 섬유아세포 죽음이 생겼고, 광원 국경 지역에서 재인구에 선행되었습니다. 종합적으로, 이 정제된 심장 조직 명확히 기술과 디지털화된 화상 진찰 시스템은 조직 처리로 인해 손실된 형광을 둘러싼 항체 침투 실패 또는 이전 문제점의 제한 없이 심장에 있는 심장 섬유아세포의 3-D 시각화를 허용합니다.

서론

심근 세포는 심혼에 있는 가장 큰 부피 분획을 포함하더라도, 심장 섬유아세포는 더 풍부하고 이 기관의 기준선 구조 및 배상 특징을 통제에 비판적으로 관련시게 관련시게 관련시다. 심장 섬유아세포는 이동성이 뛰어나고 기계적으로 반응하며, 활성화 정도에 따라 전형적으로 다양합니다. 심장 섬유아세포는 세포외 매트릭스(ECM)의 정상 수준을 유지하는 데 필요하며, 이들 세포에 의한 ECM 생산량이 너무 적거나 너무 많으며 질병1,2,3로이어질 수 있다. 질병에 그들의 중요성을 감안할 때,심장 섬유세포는 특히 과도한 섬유증4,5,6,7을제한하는 시도에서 새로운 치료 전략을 식별하는 쪽으로 조사의 점점 더 중요한 주제가되고 있습니다. 부상 시 섬유아세포는 증식및 풍부한 ECM을 분비할 수 있을 뿐만 아니라 심실을 리모델링하는 데 도움이 되는 수축 활성을 갖는 근섬유세포로 알려진 합성 세포 유형으로 활성화되고 분화합니다.

심장 섬유아세포는 2-D 배양6,8,9,10에서그들의 성질을 광범위하게 평가되었지만, 기준선이나 질병 자극으로 3-D 살아있는 심장의 특성과 역학을 훨씬 적게 이해한다. 여기서, Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer 유전 기자 시스템으로 표지된 섬유아세포의 형광을 유지하면서 성인 마우스 심장을 지우는 조직에 정제된 방법이 기재되어 있다. 심장 내에서, Tcf21은 정지 섬유아세포4의비교적 구체적인 마커이다. 타목시펜이 유도성 MerCreMer 단백질을 활성화하도록 주어진 후, 본질적으로 모든 정지 섬유아세포는 Rosa26 메뚜기에서 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 영구적으로 발현하여 생체 내에서 추적할 수 있게 합니다.

수많은 잘 확립 된 조직 청산 프로토콜이 존재하며, 그 중 일부는 심장11,12,13,14,15,16,17에적용되었습니다. 그러나, 상이한 조직 청산 프로토콜에 사용되는 시약의 대부분은 내인성 형광신호(18)를담금질하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 성인 심장은자가형광(19)을생성하는 풍부한 헴 그룹 함유 단백질로 인해 클리어하기 어렵다. 따라서, 본 프로토콜의 목표는 생체내12,13,14,16,17,20에서최적의 3D 시각화를 위해 부상당한 성인 심장에서 헤메 자동 형광의 동시억제와함께 섬유아세포 마커 형광을 보존하는 것이었다.

생체 내에서 심장 섬유아세포를 검사하려고 시도하는 이전 연구는 이러한 연구가 항체 침투 및 심장 혈관구조14,16,17,20에의해 제한되었지만 이러한 세포를 라벨에 부착 된 항체를 사용하였다. 살라몬 외는 신생아 심장에서 국소 뉴러넥스 형광의 유지보수로 조직 개폐를 보였지만, Nehrhoff 등은 골수성 세포를 표시하는 형광의 유지, 전체 심실 벽을 통한 내인성 형광의 유지가 아직 입증되지 않았으며, 이는 기준선 또는13의성인 심장 섬유아세포의 시각화를 포함하였습니다. 이 조직 청산 프로토콜은 CLARITY 방법(명확한 지질 교환 아크릴아미드-혼성 경질 영상/면역스테인링/시상 혼성화 호환 조직 하이드로겔) 및 PEGASOS(폴리에틸렌 글리콜(PEG)-관련 용매 시스템)에 기초하여 이전 프로토콜의 혼합물을 정제한다. 이 정제 된 프로토콜은 기준선에서 마우스 심장에 심장 섬유 아세포의 보다 강력한 검사와 그들이 부상의 다른 유형에 반응하는 방법의 더 강력한 검사를 허용했다. 프로토콜은 간단하고 재현 가능하며 생체 내에서 심장 섬유아세포의 행동을 특성화하는 데 도움이됩니다.

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프로토콜

마우스를 관련시키는 모든 실험은 신시내티 아동 병원 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 기관은 또한 AAALAC (실험실 동물 관리의 인증을위한 미국 협회)인증을 받았습니다. 마우스는 자궁 경부 탈구를 통해 안락사되었고, 생존 수술 수술을 받은 마우스는 통증 완화를 받았다(아래 참조). 통증 관리 및 안락사에 사용되는 모든 방법은 미국 수의학 협회의 안락사 패널의 권고에 근거합니다. 모든 마우스는 항상 사용할 수있는 물과 음식이있는 옥수수 침대 침구 단위에 보관되었습니다. 마우스는 동성케이지에 4마리를 보관하였다. 수술 이나 부상 되지 않은 조직 정리에 대 한, 6-8 주 된 남성과 여성 마우스의 동일한 수를 사용 했다.

참고: 모든 수술에서 멸균 수술 조건이 유지되었습니다. 외과 의사는 깨끗한 스크럽과 멸균 가운으로 변경한 다음 신발 커버와 헤어넷을 착용했습니다. 외과 의사는 클로르헨시딘으로 손을 닦고 멸균 수술 장갑을 착용했습니다. 외과 의사는 절개 부위를 각각 3 번 진정, 면도 및 스크러빙한 기술자의 도움을 받아 2 % 클로로 우디신 글루코네이트와 70 %의 이소프로판올을 번갈아 가며 했습니다. 마우스는 그 때 외과 의사에게 가져왔고, 수술은 행해졌습니다. 동물 들 사이, 악기는 비드 살균기에서 살균 되었다.

1. Cre 재조합

  1. 크로스 Rosa26-loxP-eGFP 마우스 (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) Tcf21-MerCremer 마우스(그림 1A)6,21.
  2. 이 십자가의 자손이 6 주에 도달하면 옥수수 기름에 용해 된 타목시펜 75 mg /kg의 관면 주사를 투여하십시오. 22 이 타목시펜을 두 번, 48h 간격으로 투여한다(도1B).
  3. 타목시펜 주사 후, 1 주일 동안 타목시펜 음식 (~0.4 g/kg 타목시펜 구연산염)의 다이어트에 마우스를 넣어. 타목시펜 차우의 1 주일 후, 수술을 수행하기 전에 1 주일 동안 정상적인 자동 차우 다이어트에 마우스를 반환(그림 1B). 적절한 수의 마우스(수술 조건당 3개)를 부상없는 대조군으로 지정합니다. 이 마우스를 희생하고, 일반적인 차우 규정식의 1 주일 다음 아래에 설명된 청산 프로세스로 진행합니다.
  4. 타목시펜 식이요법과 재결합에 따라 수술을 수행하십시오.

2. 외과 모델

  1. 허혈/레퍼퓨전 (I/R)23,24
    1. 통풍이 잘 되는 상자에 실내 공기에 1.5% 이소플루란 가스를 가진 마우스를 마취; 가슴과 목을 전기 클리퍼로 면도한 다음, 2% 클로르헤시딘 글루코네이트에 젖은 면봉으로 면도 부위를 문질러 보세요.
    2. 인공 눈물 연고를 사용하여 수술 중 건조를 방지하려면 진정 된 마우스의 눈에 연고를 배치하여 건조를 방지하십시오.
    3. 기관지를 시각화할 수 있도록 수술 가위를 사용하여 중간 목 컷을 수행합니다. 관착튜브를 기관체에 넣고 중간 목 절개를 통해 기관 카테터를 시각화하여 20 G 카테터로 삽관합니다. 이소플루란 가스로 진정되는 동안 인공호흡기에 쥐를 놓습니다(1.5%) 객실 에서.
    4. 수술 가위로 왼쪽 앞 사지 아래에 절개를 하고 갈비뼈 3과 4 사이의 늑간 근육을 잘라냅니다. 리트랙터를 사용하여 갈비뼈를 열어 보입니다.
    5. 폐와 심장 사이에 식염수에 담근 작은 스폰지를 놓고 폐손상을 방지합니다.
    6. 피쉬후크 바늘(6.5mm, 3/8c)을 사용하여 왼쪽 관상 동맥을 8-0으로 사용할 수 있는 미끄러짐 매듭으로 묶습니다. 프롤렌.
    7. 집게를 사용하여 스폰지를 제거합니다.
    8. 8-0의 끝을 외부화하면서 4-0 편조 실크와 연속 봉합사를 사용하여 폐쇄 된 늑간 근육을 봉합합니다. 프롤렌 슬립 매듭.
    9. 폐색 슬립 매듭돌출의 끝으로 국소 조직 접착제를 사용하여 피부 절개를 닫습니다.
    10. 1시간 동안 의 폐색 후, 슬립 매듭의 외부 끝을 당겨 내부로 관상 동맥 폐색을 방출하여 허혈을 완화하고 재퍼퓨전을 유발합니다.
    11. 1 mg/mL 연장 방출 부프레노르핀을 아펠러로서 투여하고,37°C에서 산소가 있는 배양실에 마우스를 배치하여 다른 동물과 분리한다. 마취에서 회복되고 흉골 이나 앉는 위치를 유지할 수 있을 때까지 적어도 15 분마다 마우스를 모니터링하십시오. 그들의 일반 하우징에 마우스를 반환합니다.
    12. 수술 후 48시간 동안 동물에게 통증과 고통을 평가하고, 완전히 치유될 때까지 매일 절개 부위를 모니터링합니다.
    13. 희생될 때까지 수분 공급, 영양, 전반적인 웰빙을 위해 마우스를 관찰하십시오.
  2. 심근 경색 (MI)25,26,27
    1. 2.1.1-2.1.7 단계를 수행합니다.
    2. 연속 봉합사를 사용하여 4-0 편조 실크를 사용하여 늑간 근육을 닫습니다.
    3. 국소 조직 접착제를 사용하여 피부 절개를 닫습니다.
    4. 2.1.11-2.1.13 단계를 수행합니다.
  3. 안지오텐신 II/페닐레프린 마이크로 삼투성 펌프 주입
    1. 멸균 조건하에서 안지오텐신 II 및 500 μg/μL 작동 용액을 준비하십시오(예: 라미나르 플로우 후드에서) 멸균 인산염 완충식염(PBS)의 100 μL에 안지오텐신 II 1 mg과 PBS의 500 μL에 페닐레프린 염산염 250 mg을 첨가하였다.
    2. 각 작업 솔루션의 희석과 최종 부피를 계산하여 마우스 중량을 기반으로 마이크로 삼투압 펌프에 분배합니다.
      참고: 예를 들어, 20g 마우스는 20g x 14일 x 1.5 μg/day = 420 μg angiotensin 또는 42 μL 의 작업 용액뿐만 아니라 20g x 14 일 x 50 μg/일 = 14000 μg 페닐프린 염수염 또는 28 Μl 작업 용액이 필요합니다.
    3. 각 마우스의 무게를 위해, 멸균 PBS에서 약물의 작업 재고를 희석하고 27 G 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여 마이크로 삼투압 펌프 (0.25 μL /h, 14 일, 약 100 μL)를 채웁니다.
      참고: 이것은 1.5 μg∙g-1∙일 -1의안지오텐신 II 및 50 μg∙g -1의미합산염을 생성합니다.
    4. 실내 공기를 포함하는 환기 챔버에서 1.5 % 이소플루란 흡입 (효과를) 마우스를 마취시한다.
    5. 마취된 마우스를 소핀 위치에 멸균 수술대에 놓고 이소플루란 가스 흡입(1.5%)으로 마취를 유지합니다. 코 콘을 통해.
    6. 수술 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 인공 눈물 연고를 사용합니다.
    7. 전기 헤어 클리퍼와 이식 영역 위에 모피를 면도하고 에탄올과 멸균 면봉을 사용하여 절단 할 영역을 살균. 어깨 블레이드 아래, 뒷면의 오른쪽 측면에 마우스 피부의 표피 층에 수술 가위를 가진 작은 절개 (약 1cm)를 합니다. 한 쌍의 수술 가위의 칙칙한 면을 사용하여 이식 부위 안팎에서 피부를 부드럽게 스트레칭하여 미니펌프를 삽입합니다.
    8. 절개 내에 마이크로 삼투압 펌프를 놓고, 펌프를 피부 밑에 수동으로 마사지하여 마우스의 등주 중공선의 왼쪽으로 물리적으로 기동합니다.
    9. 테이퍼 포인트 바늘로 4-0 실크를 사용하여 연속 봉합사를 통해 절개를 닫습니다.
    10. 펌프 이식 에 따라, 진통에 대한 피진 주입을 통해 0.1 mg / kg 의 용량으로 느린 방출 buprenorphine을 관리 (72-h 느린 릴리스). 마우스를 산소로 된 배양실에 37°C에 배치하여 다른 동물과 분리합니다. 그들은 마취에서 회복하고 흉골 또는 앉아 위치를 유지할 수 있습니다 때까지 적어도 15 분 마다 마우스를 모니터링합니다.
    11. 37°C 온난화 챔버에서 마취에서 회복되면 마우스를 표준 하우징 유닛에 다시 배치하십시오.
    12. 수술 후 48시간 동안 마우스를 모니터링하고 완전히 치유될 때까지 매일 절개 부위를 모니터링합니다.
    13. 희생될 때까지 수분 공급, 영양, 전반적인 웰빙을 위해 마우스를 관찰하십시오.

3. 수정된 활성 CLARITY 프로토콜을 사용하여 성인 마우스 하트 지우기

  1. 수술 표면과 모든 수술 도구를 70%에탄올로 살균하여 깨끗한 수술 부위를 준비합니다. PBS(각 100mL)에서 감기 1x PBS 및 4% 파라포름데히드(PFA)의 용액을 준비한다. 장갑, 실험실 코트, 얼굴 마스크 및 눈 보호 기능을 착용하십시오.
  2. 염화 나트륨 용액을 0.9% w/v로 희석하여 헤파린 버퍼를 준비합니다. 1 mL 주사기와 27 G 바늘을 사용하여 헤파린-NaCl의 60 μL로 각 마우스를 복렬히 주입하십시오.
  3. 헤파린-NaCl 용액을 주입한 후 5분 후, 실내 공기를 포함하는 환기 챔버에서 1.5%의 이소플루란 흡입(effect)을 사용하여 마우스를 마취시킵니다.
  4. 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사, 여기서 머리의 뒷면은 평평한, 집게의 닫힌 끝으로 개최되는 동안, 척추 기둥은 꼬리를 당겨 탈구된다.
  5. 면 봉봉에 70 % 에탄올로 마우스의 복부 표면을 청소하십시오. 수술 가위를 사용하여 xiphoid 과정 아래 약 3cm 의 횡회 절개를 합니다.
  6. 복부를 xiphoid 과정까지 디글로 사용하여 기본 복벽 조직으로부터 피부를 분리하십시오 (꼬리에 가장 가까운 피부를 잡고 머리에 가장 가까운 피부를 흉곽쪽으로 당깁니다). 수술 가위를 사용하여 시포이트 프로세스 아래 3cm 의 피하 복벽 조직에 2cm 의 횡절개를 합니다. 이 횡절개에서 수직 절단을, 중간선까지 흉곽을 통해. 흉곽을 다시 고정하여 심장을 노출시합니다.
  7. 27 G 바늘과 10 mL 주사기를 사용하여 우수한 베나 카바와 대오르타에 차가운 PBS를 주입하십시오 (심장의 위치 조작은 펑크를 피하기 위해 무딘 집게로 신중하게 수행되어야한다) 심장에서 혈액을 맑게하십시오.
    참고: 충분한 관류는 꼬리 경련과 폐의 변색으로 지적 될 수 있습니다.
  8. 27G 바늘과 10mL 주사기를 사용하여 우수한 베나 카바 및 대어타에 차가운 4% PFA를 주입하여 고정 과정을 시작하십시오.
  9. 마음을 흥분시다. 동맥, 오른쪽 심실 및 중격, 왼쪽 심실은 직선 블레이드 메스를 사용하여 분리해야합니다. 이 조직을 차가운 4% PFA로 채워진 15mL 원심분리기 튜브에 넣고 하룻밤 사이에 4°C의 누에이터에 놓습니다.
  10. 감기 1x PBS로 심장을 3시간 씩 씻아 과도한 PFA를 제거합니다.
  11. 하이드로겔(상대 아크릴아미드/폴리아크릴아미드 조성물의 경우 A4P0이라고 불릴)을 15mL 원심분리기 튜브에 혼합하여 다음 화학물질을 혼합하여 준비합니다: 아크릴아미드 40% 중 10%, 10% 1x PBS, 80% 증류수.
  12. 하이드로겔의 심장을 잠기 직전에 광리니티에이터(2,2-Azobis[2-(2-이미다졸린-2yl))디하이드로클로리데)의 0.25% 용액을 하이드로겔 용액에 추가한다.
  13. 하이드로겔이 들어 있는 원물 튜브에 하트를 놓습니다. 원내관을 호일로 감싸고, 육체적 방해 없이 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
  14. 약 14시간 4°C에서 심혼을 함유한 원문관을 37°C 비드 목욕으로 옮기다.
  15. 비드 욕조에서 2.5 h 를 마친 후, 집게로 하이드로겔에서 심장을 조심스럽게 제거합니다.
  16. 견과류에 37°C에서 1x PBS를 함유한 15mL 원판 튜브에서 하트를 각각 1시간 씩 씻는다.
  17. 집게를 사용하여 활성 전기 전구 기계의 바구니에 하트를 놓고 뚜껑을 바구니에 놓습니다. 뚜껑이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
  18. 활성 전기 전광실 저장소를 챔버에 용액을 부어 전기 전광 개간 솔루션으로 채웁니다.
  19. 챔버가 전기 전광 제거 용액으로 가득 차면 심장을 포함하는 바구니가 잠길 수 있습니다. 전기 전광 기계에 캡을 단단히 놓습니다.
  20. 전기 전도 기계를 1.5 A, 37 °C에서 1.5 h로 실행합니다.
  21. 전기 전구의 1.5 h에 따라, 불투명 한 조직이 남아 있지 않도록 시각적으로 마음을 확인합니다. 조직의 영역이 여전히 불투명한 경우, 전기 전광실에서 전기 전광 용액에 심장을 다시 침수하고, 한 번에 0.5 h에 대한 전기 전광을 계속한다.
    참고: 전기 전도는 조직 손상의 첫 징후 (예 : 조직 마모)에서 중단되어야합니다.
  22. 15mL 원색 튜브로 심혼을 1시간, 3회 각각 3회, 영양사에 37°C로 세척한다.
  23. N,N, N,N+100,N을 포함하는 15 mL 원전 튜브에 심장을 잠급니다.,N의 은은한 테트라키스 (2-하이드록시프로필)에틸렌디아민- 헴 자동 불경을 감소시키는 탈색제.
    참고: 이 솔루션은 하트가 완전히 맑을 때까지 24시간마다 변경되어야 합니다(약 2일).
  24. 15mL 원색 튜브에 1x PBS3회 1회씩 하트를 세척하여 과도한 탈색제를 제거합니다.
  25. 굴절지수 매칭 솔루션(RIMS)을 0.02M 인산염 버퍼의 30mL, 5-40g(N-2,3-디하이드록시프로피라타미도)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis(2, 3 디하이드록시프로필) 교반 (완전히 용해되어야합니다-이 시간까지 걸릴 수 있습니다),5 mg의 나트륨 아지드, 50 μL Tween20, 및 1 g 1,4-diazabicyclo[2.2.2.2],
  26. 이미징 전에 48 시간 동안 RIMS의 심장을 평형화하십시오.

4. 똑바로 단일 광자 공초점 현미경을 사용하여 심혼을 지워진 화상 진찰

참고: 이미징 장치는 10cm 유리 페트리 접시의 하반부, 3D 인쇄 바닥 저수지, 둥근 유리 커버슬립 및 3D 인쇄 상단저수지(그림 1C-E)로구성됩니다. 3D 인쇄 물자 신시내티 아동 병원 임상 공학 부서에 의해 사내에서 만들어졌다.

  1. 진공 그리스를 사용하여 3D 인쇄된 바닥 저수지를 3D 인쇄된 조각의 바닥에 진공 그리스를 넣음으로써 페트리 접시에 3D 인쇄된 바닥 저장소를 밀봉합니다(그림1C).
    참고: 저장소는 이미지화되는 샘플과 동일한 높이여야 합니다(즉, 샘플은 위에 놓인 유리 커버슬립에 의해 압축되어서는 안 되며 샘플도 저수지 내에서 플로동하여 이동할 수 없어야 합니다).
  2. RIMS로 저장소를 채우고 파이프 팁으로 모든 거품을 제거합니다. 왼쪽 심실 벽을 향하도록 RIMS에 하트를 조심스럽게 배치하여 거품이 용액에 도입되지 않도록 합니다.
  3. 진공 그리스를 사용하여 3D 인쇄 상단 저수지조각(보충 도 1A)의하단 표면에 유리 커버슬립을 부착하여 진공 그리스의 얇은 층을 3D 인쇄된 조각에 다시 배치하고 커버 슬립에 배치하여)(도1D).
  4. 유리 커버슬립과 상단 저수지, 커버슬립 사이드를 아래저수지(보충도 1B)에놓습니다. RIMS와 커버 슬립 사이의 접착은 상단과 하단 저수지조각(그림 1E)사이의씰을 제공합니다.
  5. 10배 글리세롤 침지 목표와 함께 글리세롤로 상단 저장소를 채우면 됩니다.
  6. 다광자 공초점 스캔 헤드가 장착된 단일 광자 현미경을 사용하여 클리어된 하트를 이미지화하십시오.
  7. 단일 광자 현미경의 단계를 낮추고, 단계의 중앙에 샘플을 포함하는 페트리 접시를 놓습니다. 스테이지를 올리고 10배 글리세롤 침지 목표를 시료 장치의 상단 저장소에 있는 글리세롤로 낮춥니다. 견본을 사용하여 견본의 가장자리를 보고 견본이 집중하고 있는지 확인하십시오.
  8. 라이브 버튼을 클릭하여 접안 보기에서 카메라 보기로 전환합니다.
    1. 먼저 페트리 접시의 바닥에 있어야 조직 샘플의 가장 넓은 부분을 찾아 X와 Y 매개 변수를 설정합니다.
    2. ND 획득 및 사용자 지정 멀티포인트를 클릭합니다. 조이스틱을 사용하여 왼쪽에서 오른쪽에서 위쪽으로 아래로 스윕하여 조직 샘플의 중간을 먼저 찾아 멀티 포인트를 만듭니다.
    3. 그런 다음 조직의 크기에 따라 필요한 타일 링 크기를 결정하십시오 (일반적으로 6-8 주 된 마우스 심장의 경우 6 x 5). X 및 Y 매개 변수(ND 획득 탭 아래의 z 를 선택 해제)만 캡처하여 테스트 이미징을 실행하여 조직의 전체 길이와 너비가 캡처되었는지 여부를 확인합니다.
  9. z 매개 변수를 설정하려면 XYZ 탐색을열고 샘플의 위쪽과 아래쪽을 찾을 때까지 위아래 아이콘을 클릭합니다.
    1. Z 강도 보정 패널을 열고 각 z 지점에서 레이저 전력을 증가또는 감소시킴으로써 조직 밀도를 보정하기 위해 조직의 위, 중간 및 하단의 형광을 조정합니다. Z 강도 보정 패널 의 오른쪽에 있는 세트 화살표를 클릭하여 설정합니다.
    2. ND 획득 패널의 Z 단계 크기를 5μm로 설정합니다.
  10. 심장의 X, Y 및 Z 매개 변수가 묘사되고 z 강도 보정이 설정된 후, 공진 스캐너와 갈륨 아르세니드 인스플라이더 광증식 관(GaAsP PMTs)을 사용하여 10배 글리세롤 침수 목표를 가진 자동 직립 현미경을 사용하여 클리어된 하트를 이미지화한다. Nd 획득에서 XY 및 Z 탭을 확인하고 실행 Z 보정을누릅니다.
  11. 처리 소프트웨어에서 멀티포인트 이미지를 열고 스티치 버튼을 클릭하여 결과 이미지를 스티치, 언믹스 및 디노이즈로 제거합니다. 이미지에서 블라인드 언믹, 2 채널을클릭한 다음 을 찾습니다. 그리고 이미지아래에서 denoise.ai클릭한 다음 선택한 형광 채널(즉, GFP)을클릭합니다.
    참고: 이 과정은 전체 좌심실에서 GFP 양성 섬유아세포의 3D 이미지를 초래합니다.
  12. 이차 분석 소프트웨어를 사용하여 심장 섬유아세포 분산의 패턴과 추세를 추가로 식별합니다. 스팟 마법사 프로그램을 실행하여 스팟 함수를 사용합니다.

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결과

심장 섬유아세포는 심장의 기준선 기능뿐만 아니라 심장 손상에 대한 반응에 필수적입니다. 이러한 세포의 배열 과 형태를 이해 하기 위해 이전 시도 2-D 설정에서 크게 실시 되었습니다. 그러나, 정제된 심장 조직 클리어링(도2)및 3-D 이미징 기술이 발표되어 심장 섬유아세포의 고급적이고 상세한 시각화를 가능하게 한다. 이 이미징 기술로, 섬유 아세포는 조밀하게 포장되고 부상되지 않은 심혼에 있는 가시적인 형태가 있는 것을 발견되었습니다(그림 3, 보충 동영상 S1-4).

왼쪽 심실 조직 클리어링은 부상되지 않은 심장에서 달성 된 후, 프로토콜은 부상 심장 조직을 연구 할 때이 클리어링 프로토콜이 수행하는 방법을 조사하기 위해 여러 부상 모델에 적용되었다. 마우스는 좌측 관상동맥(LCA)의 임시 폐쇄에 의해 I/R 손상을 입었으며, 그 다음으로 ...

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토론

이 문서는 생체 내에서 심장 섬유아세포의 시각화를 허용하는 조직 정리를 위한 정제된 방법을 제시합니다, 기준선과 다음 상해둘 다, 마우스 심혼에 있는 섬유아세포를 특성화하고 더 잘 이해하기 위하여. 이러한 향상된 프로토콜은 성인 또는 신생아 심장12,13,14,16,17,20에서특정 세포 유형을 식별하려고 시도한 기존 조직 청산프로토콜의 한계를다룹니다. 마우스 심혼을 지우려는 초기 시도에서, 수동 적인 CLARITY 기술이 사용되었고, 여기서 심장은조직(15,18)에걸쳐 버퍼...

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공개 사항

저자는이 원고의 내용과 관련된 공개가 없습니다.

감사의 글

저자는 이 모형의 발달에 있는 그들의 원조 그리고 지도에 대한 CCHMC Confocal 화상 진찰 코어를 인정하고 싶습니다, 뿐 아니라 모든 3D 인쇄된 부분의 디자인을 위한 임상 공학에서 매트 바티. Demetria Fischesser는 건강의 국가 학회에서 교육 교부금에 의해 지원되었다, (NHLBI, T32 HL125204) 그리고 제프리 D. 몰켄틴하워드 휴즈 의료 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-0 꼰 실크EthiconK871H
8-0 프롤렌Ethicon8730H
40% 아크릴아미드 용액Bio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
인공 눈물 연고Covetrus048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture 국소 티슈 접착제World Precision Instruments503763
HeparinSigmaH0777
Imaris Start Analysis SoftwareOxford InstrumentsN/A Micro-osmotic
pumpsAlzetModel 1002
Nikon Elements Analysis SoftwareNikonN/A
니콘 A1R HD 정립 현미경니콘N/A
일반 오토클레이브 차우Labdiet5010
Nycodenz, 5-(N-2, 3-디하이드록시프로필아세타미도)-2, 4, 6-트리-요오도-N,
N'-bis(2, 3 디하이드록시프로필) 이소프탈아미드		CosmoBioAXS-1002424
파라포름알데히드전자 현미경 과학15710
페닐에프린 염산염시그마P6126-10G
광개시Wako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax 재고 번호:012429
아지드화 나트륨시그마 AldrichS2002-5G
염화나트륨 솔루션Hospira, Inc.NDC 0409-4888-10
타목시펜시그마 알드리치T5648
타목시펜 식품EnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine, 탈색제Millipore Sigma122262-1L
X-Clarity 전기영동 투명화 챔버Logos BiosystemsC30001
X-Clarity 전기영동 투명화 솔루션Logos BiosystemsC13001
X-Clarity 전기영동 조직 바구니Logos BiosystemsC12001
X-Clarity 전기영동 조직 바구니 홀더Logos BiosystemsC12002
제

참고문헌

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