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방법 논문

포신 각막 조직 은 포진 심플렉스 바이러스-1 항 바이러스의 효능을 연구하기 위해 퇴치

3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62195

⸱

2021년 9월 20일

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Illinois at Chicago

이 논문에서

요약

우리는 실험 약물의 항 바이러스 효능을 테스트하기 위해 돼지 각막의 사용을 설명합니다.

초록

바이러스 및 박테리아는 각막 감염을 통해 상처 및 궤양과 같은 다양한 안구 표면 결함 및 변성을 일으킬 수 있습니다. 전 세계적으로 60-90%의 혈청률을 가지면 포진 심플렉스 바이러스 유형-1(HSV-1)은 일반적으로 병변 및 감염 관련 실명으로 나타나는 오로페이셜 영역의 점막 병변을 유발합니다. 현재 항 바이러스 약물은 효과적인 동안, 저항의 출현 및 독성 부작용의 지속이 유비쿼터스 병원체에 대 한 새로운 항 바이러스의 개발을 필요로. 체외 평가는 신흥 항 바이러스에 관한 몇 가지 기능적 데이터를 제공하지만 생체 내에서 안구 조직의 복잡성을 입증하지는 않습니다. 그러나 생체 내 연구는 비싸고 특히 바이러스 성 에이전트와 함께 작업 할 때 숙련 된 인력이 필요합니다. 따라서 ex vivo 모델은 항 바이러스 검사를위한 효율적이면서도 저렴한 단계입니다. 여기서 우리는 돼지 각막 전 생체를 사용하여 HSV-1에 의감염을 연구하는 프로토콜과 기존 및 새로운 항 바이러스 약물을 사용하여 국소적으로 치료하는 방법에 대해 논의합니다. 우리는 또한 HSV-1을 사용하여 플라크 분석법을 수행하는 방법을 시연한다. 상세한 방법은 HSV-1 병원체를 닮은 감염을 공부하기 위하여 유사한 실험을 수행하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서론

안구 감염으로 고통받는 사람들은 종종 시력 상실1을발생시다. 전 세계적으로 높은 혈청병으로, HSV 감염된 개별은 각막 흉터, 기질 각질염 및 신생 혈관 화2,3,4,5로이끌어 내는 되풀이눈 감염 때문에 손해를 입습니다. HSV 감염은 또한 덜 빈번하게 일으키는 원인이 되는 것을 보여주었습니다, 면역 손상중 심각한 조건의 범위, 뇌염 및 전신 이환 과 같은 치료되지 않는 환자6,7,8. Acyclovir 같은 약물 (ACV) 그리고 그것의 뉴클레오시드 유사체는 HSV-1 감염을 억제하고 심지어 재활성화를 통제에 일관된 성공을 보여주었지만, 이러한 약물의 장기간 사용은 신장 실패, 태아 이상 및 진화 하는 바이러스 균주에 약물 저항의 출현을 제한 하는실패9,10,11,12,13. HSV-1 안구 감염과 관련되었던 복잡성은, 이전에 인간 각막 세포의 단층 및 3D 배양을 사용하여 시험관내에서 연구되고 murine 또는 토끼 안구 감염을 사용하여 생체내에서 공부되었습니다. 이러한 체외 모델은 HSV-1 감염의 세포 생물학적 구성 요소에 대한 중요한 데이터를 제공하지만, 그러나 각막 조직의 복잡한 복잡성을 모방하지 못하고 바이러스14의수지상 확산을 조명하는 데 거의 영향을 미치지 않는다. 대조적으로, 생체 내 시스템은 HSV-1 감염 도중 각막 및 면역 활성화 반응에 있는 감염 퍼짐을 보여주는에 있는 더 통찰력이 있더라도, 그(것)들은 실험을 간과하기 위하여 동물 배려를 위한 훈련된 조사자 및 큰 시설이 필요하다는 주의와 함께 옵니다.

여기서 우리는 HSV-1 감염 유도 상처 시스템을 검사하기 위해 전 생체 모델으로 돼지 각막을 사용합니다. 감염에 기인한 상처 시스템의 세포 및 분자 생물학뿐만 아니라 특정 약물의 잠재적 인 약리학은 조직 각성 배양을 통해 연구 될 수있다. 이 모형은 또한 그밖 바이러스성 및 세균성 감염을 위한 사용을 위해 개정될 수 있습니다. 이 연구에서는, 돼지 각막은 전임상 소분자, BX795의 항바이러스 효능을 시험하기 위해 사용되었다. 돼지 각막의 사용은 접근의 용이성과 비용 효과때문에 선호되었다. 또한, 돼지 각막 모델은 각막이 분리되기 쉽고 감염 및 시각화를 위한 적절한 크기이며15를처리할 수 있는 견고한 것으로 인간의 눈의 좋은 모델입니다. 돼지 각막은 또한 트랜스 각막 투과성 및 전신 흡수15모두에서 인간 각막 모델의 복잡성과 유사하다. 연구를 위해 이 모델을 사용하여, 우리는 BX795가 HSV-1 바이러스 감염의 유능한 억제제로 추가 조사의 가치가 있는 방법을 설명할 수 있었고 잠재적인 소분자 항바이러스화합물(16)으로분류하는 문헌에 추가하였다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 모든 돼지 조직은 제 3 자 민간 조직에 의해 제공되었으며 시카고 직원의 일리노이 대학에 의해 동물 취급이 수행되지 않았습니다.

1. 재료

  1. 시약
    1. 플라크 분석시 다음 시약을 사용하십시오: 분말 메틸셀룰로오스, 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 페니실린 및 연쇄 절제술(P/S)을 플라크 분석용으로 사용하십시오.
    2. 플라크 분석용 크리스탈 바이올렛 용액을 준비하기 위해 크리스탈 바이올렛 정제와 에탄올(분자 생물학 등급)을 사용하십시오.
  2. 베로 셀 성장 미디어 - DMEM 전체 미디어
    1. 조직 배양 후드 내부에 DMEM 미디어 병을 엽니다. 혈청 피펫을 사용하여 병에서 55mL의 미디어를 제거하고 폐기하십시오. DMEM에 P/S의 FBS 50mL를 추가합니다. 4 °C에서 냉장 보관하십시오.
  3. 플라크 분석 미디어 - 5% 메틸셀룰로오스 미디어의 주식
    1. 500mL 유리 병 안에 교반 자석으로 2.5 g의 메틸셀룰로오스 파우더를 측정하고 오토클레이브하십시오. 병이 실온으로 냉각된 후, 50mL의 FBS와 5mL의 P/S를 포함하는 DMEM 전체 미디어의 500mL를 가지고 메틸셀룰로오스가 들어있는 유리 병에 추가하십시오.
    2. 자기 교반기로 2 일 동안 4 °C에서 저어줍니다. 4 °C에서 냉장 보관하십시오.
  4. 절제된 돼지 각막에 대한 미디어 준비
    1. 조직 배양 후드 내부에 최소 필수 미디어 (MEM) 병을 엽니 다. 혈청 피펫을 사용하여 병에서 10mL의 MEM을 폐기하십시오.
    2. 인슐린-트랜스퍼린 셀레늄(ITS) 5mL과 항진성 항생제(AA)의 5mL을 미디어에 추가하고 4°C에서 냉장 보관하십시오.
  5. 크리스탈 바이올렛의 마스터 및 작업 재고 :
    1. 크리스탈 바이올렛 스톡 용액을 만들려면 1 g의 크리스탈 바이올렛 파우더를 물에 20% 에탄올100mL에 넣습니다. 이 스톡(1%w/v 크리스탈 바이올렛)은 어두운 곳에 보관할 때 최대 연도까지 보관하고 사용할 수 있습니다.
    2. 이로부터 작업 재고를 만들기 위해, 물 350mL에 원래 재고 솔루션의 50 mL을 추가합니다. 이 솔루션에 100mL의 에탄올을 추가하여 500mL 작동 크리스탈 바이올렛 솔루션(0.1% w/v 크리스탈 바이올렛)을 만듭니다.
      참고: 이러한 두 솔루션 모두 어둠 속에서 저장해야 합니다.

2. 절차

  1. 전체 눈에서 돼지 각막의 격리17
    1. 적합한 공급 업체로부터 돼지 눈을 받으면 도 1에그림과 같이 조직 처리가 지연되면 얼음에 저장하십시오.
    2. 유리체 유머 유출로 인한 사고뿐만 아니라 오염을 방지하기 위해 이 절차 중에 개인 보호 장비를 사용하고 착용해야 합니다.
    3. 작업 영역을 70% 에탄올로 분사하여 청소하고 소독합니다. 작업 공간이 안정되도록 도 2에서 그림처럼 벤치 커버와 테이프를 단단히 옆으로 펴고 있습니다.
    4. 거즈에 돼지 눈을 놓습니다(그림 3). 50mm 거즈를 사용 하 여, 한 손으로 도 4B에 도시된 바와 같이 돼지 눈의 후방 부분(도4A)을홀드합니다.
    5. 30G 바늘로, 눈의 상피 표면의 약 중앙에 한 번 조심스럽게 찌르고 스트로마에 손상이 없도록한다(그림 5). 찌르기는 기질 개입을 피하기 위해 상피 (~100-200 μm)로 제한되어야 합니다.
    6. 날카로운 살균 블레이드를 사용하여 각막에서 1mm 거리에서 클클레라에 작은 절개를 합니다. 각막의 가장자리를 잘라서 유리체 유머가 손의 신속하고 매끄러운 회전 작용을 사용하여 누출되지 않도록합니다(그림 6A). 각막-스클레라 엣지를 평평한 트위저로 잡고,블레이드(그림 6B)를사용하여 눈의 남은 테더링 멤브레인을 잘라냅니다.
    7. 각막을 가지고 각막 매질의 2mL오버레이 12웰 접시에 놓습니다. 각막은 그림 7A-D, 그림 8)의일련의 단계에서 시연되어 위를 향하여 배치해야합니다.
    8. 각막 표면의 디스브라이드 부위에 17GFP의 5 x 105 플라크 성형 유닛(PFU)을 포함하는 바이러스 용액의 5μL을 추가합니다. 감염된 돼지 각막이 함유된 12웰 플레이트를 인큐베이터에 72h에 대해 5% CO2로 놓습니다.
    9. 실험에 사용되지 않는 추가 눈을 10% 표백제로 스프레이하고 생체 위험 가방에 안전하게 배치하십시오.
  2. 시각화
    참고: 바이러스는 약물을 첨가하기 전에 매일 시각화되어야 합니다.
    1. 스테레오 현미경 및 LED 광원을 켜고 각막을 이미징하기 전에 기계램프가 예열되도록 합니다. 정중 하 게 용액을 방해 하지 않고 악기에 각막의 접시를 수행. GFP(380-460 nm)가 표본을 보는 데 사용되도록 필터를 변경합니다. 노출 시간을 500ms로 설정하여 이미지를 캡처합니다.
    2. 첫째, 각막 판을 스테레오스코프 아래에 놓고 이미지를 7.5배 의 가장 낮은 배율로 캡처합니다. 모든 바이러스 확산 및 원더리 형성이 명확하게 시각화되는 등 증가 배율 이미지 (예 : 15x, 25배, 35배)와 함께 이 것을 따라가십시오.
    3. 감염된 각막을 조직 배양 인큐베이터로 되돌리고 촬영한 모든 이미지를 저장하십시오.
  3. 바이러스 감염 정량화
    참고: 돼지 각막에서 바이러스 성미는 약물 치료의 효과를 분석하기 위해 매일 평가되어야한다.
    1. 바이러스를 정량화하기 위해, 종자 베로 세포는 이 실험에서 수행된 것과 같이 6웰 플레이트를 사용하는 경우 잘 세포당 5 x 105 의 밀도로 하였다. 감염 하기 하루 전에이 작업을 수행 합니다. 그들은 바이러스 정량화에 대한 컨실수 있는지 확인하기 위해 하룻밤 도금 세포를 배양.
    2. Aliquot 500 μL 의 혈청 프리 미디어가 여러 마이크로 센심 분리튜브로 들어갑니다. 세럼 무료 미디어 충전 튜브에 담근 멸균 면 담봉을 삽입합니다. 면봉을 담그고 사용하기 전에 최소 5 분 동안 젖어야합니다.
    3. 기본 미디어를 방해하지 않고 감염된 돼지 각막 판을 생물 안전 캐비닛으로 운반합니다. 젖은 면봉을 사용하여, 과도한 압력을 가하지 않고 감염된 돼지 각막의 중심에서 5mm의 직경에 시계 방향으로 3 회전과 3 회전을 합니다.
    4. 면봉을 혈청 프리 미디어에 삽입하여 마이크로센심분리기 튜브에 넣고 시계 방향과 시계 반대 방향으로 5번 회전합니다. 면봉의 금속 끝은 마이크로 원심 분리튜브에 완전히 맞고 뚜껑을 닫을 수 있도록 짧게 절단해야합니다.
    5. 소용돌이 기계에 면봉된 면 끝이 들어 있는 마이크로센트심분리기 튜브를 고속으로 1분 간 배치합니다.
    6. 이러한 샘플에 플라크 분석서를 통해 바이러스 정량화를 수행합니다.
      참고: 이 정량화 단계는 감염 후 6일에 2일, 4일 및 선택적으로 수행되어야 합니다.
  4. 플라크 분석에 의한 바이러스 정량화
    참고 : 플라크 분석을 수행하려면, 성장하고 6 우물 플레이트로 베로 세포를 판과 분석의 시작 전에 세포의 90 %의 합류를 보장합니다. 이 세포의 75cm2 플라스크를 사용합니다. 아래의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛 내에서 수행되어야합니다.
    1. 배양 배지를 흡입한 후 10mL의 신선한 인산염 완충식염(PBS)으로 플라스크에서 베로 세포의 컨블러블 단층물을 세척한다. 첫 번째 워시 액액을 흡입한 후 PBS로 워시 스텝을 다시 반복합니다.
    2. 세포 단층층에 0.05% 트립신 1mL를 추가합니다. 플라스크를 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 육안으로, 세포가 플라스크의 내부 표면에서 분리되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 플라스크를 다시 검사하기 전에 5 분 더 기다립니다. 세포가 분리된 것처럼 보일 때, 전체 미디어 9mL을 단층층에 추가하여 세포가 플라스크 표면에서 완전히 빠져나도록 합니다.
    3. 전체 미디어와 함께 플라스크에서 모든 세포를 수집하고 15 mL 원심 분리 튜브에 배치합니다.
    4. 플라크 분석에 사용되는 6개의 웰 플레이트의 모든 웰에 대해 원심분리기 튜브에서 300 μL을 사용하십시오. 전체 미디어의 2 mL와 6 웰 플레이트의 각 우물을 위로. 접시를 하룻밤 동안 인큐베이터에 두어 각 우물에 팽창식 단층층을 형성할 수 있도록 합니다.
    5. 플라크 분석법을 수행하기 위해서는 바이러스의 정량화 전에 시료의 직렬 희석을 수행해야 합니다.
    6. 10-8의 희석에 도달할 때까지 혈청 프리 미디어를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 바이러스의 10 1배 희석을 수행한다. 10-3 희석시, 6웰 플레이트로부터 세포에 대한 성장 매체를 흡수한 후 도금 세포의 단층으로 희석1mL을 전달하면, 이것은 감염 단계가 될 것이다. 감염된 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양한다.
    7. 기존 감염 매체를 흡인하고, PBS로 두 번 부드럽게 세척하여 세포를 코팅하고 6개의 우물에 잘 당 2mL의 메틸셀룰로오스 라덴 미디어를 추가합니다. 72h 또는 플라크 형성이 보일 때까지 인큐베이션하십시오. 플라크는 세포 단층의 세포 사이의 작은 간격의 형성에 의해 식별 될 수있다.
    8. 벽을 안내 팁으로 사용하여 각 우물의 모서리에 천천히 메탄올 1 mL을 추가합니다. 실온에서 6웰 플레이트를 15분 동안 배양합니다. 셀 단층층을 방해하거나 교반하지 않고 접시에서 각 우물의 내용내용을 천천히 흡인시합니다.
    9. 모든 세포가 덮여 있는지 확인, 6 웰 플레이트의 각 우물에 크리스탈 바이올렛 작업 용액의 1 mL을 추가합니다. 어둠 속에서 6 웰 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 크리스탈 바이올렛 용액을 흡수성 용지 에 묻어 서 버려주세요.
    10. 시작 솔루션에서 총 바이러스 함량을 정량화할 수 있도록 가장 높은 희석으로 플라크 수를 계산합니다. 바이러스 성 titer를 확인하기 위해 두 번 과정을 반복합니다.

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결과

실험적인 항 바이러스의 효능을 이해하려면 생체 내 인체 임상 시험을 위해 전송되기 전에 광범위하게 테스트해야합니다. 이와 관련하여, 긍정적 인 제어, 부정적인 제어 및 테스트 그룹을 식별해야합니다. 트리플루오로티미딘(TFT)은 오랫동안 헤르페스 각막염을국소적으로치료하는 바람직한 치료법으로 사용되어 왔다. 양성 대조군으로 사용, TFT 처리 각막 그룹은 낮은 감염 확산을 보여줍니다. 부정적 제어로, 우리는 PBS에 용해 된 DMSO 또는 차량 제어를 사용했습니다. BX795, 실험전임상약물은 시험군이었다. 총 4 각막이 각 그룹에 할당되었고 약물은 매일 3 번 돼지 각막에 추가되었습니다. 입체 형광 이미징을 사용한 우리의 결과는 BX795의 항 바이러스 효능이 바이러스 확산을 제어하는 TFT와 유사하다는 것을 보여줍니다. 우리의 연구 결과에 있는 바이러스성 퍼짐은 입체스코에서 녹색 형광 채널을 화상 진찰하여 구상될 수 있습니다. 우리는 만 처리 된 차량이 중앙 감염 영역에서 주변으로 바이...

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토론

이전 연구는 BX795 HSV-1 감염에 대 한 항 바이러스 에이전트로 유망한 역할을 보여 주었다; TANK 결합 키나아제 1 (TBK1)16을억제함으로써. TBK1과 자가식 모두 인간 각막 상피 세포에서 입증된 바와 같이 HSV-1 감염을 억제하는 데 중요한 역할을 했습니다. BX795는 10μM의 농도에서 항바이러스 활성을 최대한 효과적으로 효과적이높은 것으로 나타났으며, 주요 바이러스 성 단백질의 서양 블롯 분석 및 바이러스 플라크 분석을 모두 사용하여, BX795는 TFT16의활성에 필적하는 HSV-1 감염을 억제하는 것으로 나타났다. 돼지 각막에 대한 연구는 동일한 분석을 따르고 위에서 설명한 바와 같이 유사한 결과를 얻었습니다. BX795는 감염을 억제하는 TFT만큼 효과적인 것으로 나타났습니다 - 감염의 4 일과 6 일째에 돼지 각막으로 촬영한 이미지는 TFT와 BX795 모두에서 유사한 결과를 보여줍니다. 분비된 비리를 정량화하기...

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공개 사항

저자는 이해 상충과 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 NIH 보조금 (R01 EY024710, RO1 AI139768 및 RO1 EY029426)에 의해 지원되었다. 연구 는 파크 패킹 회사에서 얻은 돼지 각막을 사용하여 실시되었다, 4107 애슐랜드 애비뉴, 뉴 시티, 시카고, IL-60609

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
피하 주사 바늘 30g.BD305128
500 mL 유리병.Thomas Scientific844027
BioDotBDVM-3200
Biosafety Level-2(BSL-2) 인증을 받은 생물안전 작업대.Thermofisher ScientificHerasafe 2030i
Calgiswab 6" 멸균 칼슘 알긴산 표준 면봉.청교도22029501
세포 스크레이퍼 - 25 cmBiologix BE70-1180 70-1250
크리스탈 바이올렛시그마 알드리치C6158어두운 곳에 파우더 보관
Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 - DMEMGIBCO419660294 °에 저장; C 사용 전까지
에탄올시그마 알드리치E7023
태아 소 세럼 -FBS시그마 알드리치F2442분주량을 50 mL 튜브에 넣고 사용할 때까지 냉동 보관
플랫 엣지 핀셋 – 2.HarwardInstruments72-8595
냉동고 --80 °C. -Thermofisher Scientific13 100 790
신선한 블레이드 상자.토마스 사이언티픽TE05091
GuazeJohnson & 108 평방 인치 폴더 12 플라이
HSV-1 17GFP는 노스웨스턴 대학의 패트리샤 스피어스 박사의 집 - 원래 변형에서 성장했습니다. HSV-1 균주 17
인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 - ITSGIBCO5 mL 튜브에 부분 표본41400045
자석 교반기를Thomas ScientificH3710-HS
금속 가위.Harward Instruments72-8400
마이크로피펫 1 - 1000 &마이크로;L.토마스 사이언티픽1159M37
최소 필수 매체 - MEMGIBCO 110950804°C에 보관; OptiMEM을 사용하기 전까지
 GIBCO319850474 °에 매장;
페니실린/스트렙토마이신GIBCO5 mL 튜브에 분취 15140148 사용하고 사용할 때까지 냉동 보관
인산염 완충액 식염수 -PBSGIBCO10010072실온에서 보관
Porcine CorneasPark Packaging Co., Chicago, IL요청에 의한 특별 주문
절차 벤치 커버 - 필요에 따라.Thermofisher ScientificS42400
혈청학 피펫Thomas ScientificP7132, P7127, P7128, P7129, P7137
혈청학적 피펫팅 장비.토마스 사이언티픽Ezpette Pro
입체경Carl ZeissSteREO Discovery V20
교반 자석.Thomas ScientificF37120
조직 배양 플라스크, T175 cm2.Thomas ScientificT1275
5% CO2 및 37°C를 유지할 수 있는 조직 배양 인큐베이터; C 온도.Thermofisher ScientificForma 50145523
조직 배양 처리 플레이트(6-well).토마스 사이언티픽T1006
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드GIBCO25-300-062분취액을 10 mL 튜브에 넣고
베로 세포미국형 배양 컬렉션 ATCCCRL-1586
항진균 및 항생제(AA)GIBCO는 분취액을 5mL 튜브에 넣고 벤치탑 볼텍서를 사용할 때까지 냉동 보관15240096. 존슨 를 발현하는 GFP는 을 하고 사용할 때까지 냉동 유지합니다.을 사용하기 전까지는 C.는 을 사용할 때까지 냉동 보관

참고문헌

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  13. Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
  14. Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559(2017).
  15. Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
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