여기서, 솔루션 NMR 분광법에 의한 15N이완 분산 프로파일의 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제공된다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 형성 역학은 중요한 생물학적 과정인 효소 촉매, 리간드 결합, 알로스터리 및 시그널링의 조절에 근본적인 역할을 합니다. 구조와 역학 사이의 균형이 생물학적 기능을 어떻게 지배하는지 이해하는 것은 현대 구조 생물학의 새로운 개척지이며 몇 가지 기술적 및 방법론적 발전에 불을 붙였습니다. 이들 중, CPMG 이완 분산 용NMR 방법은 μs-ms 타임스케일에서 발생하는 단백질 형태 평형의 구조, 운동학 및 열역학에 대한 고유하고 원자분해능적인 정보를 제공한다. 여기서, 연구 결과는 15N 이완 분산 실험의 취득 그리고 분석을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 예를 들어, 박테리아 효소의 C-말단 도메인에서 μs-ms 역학의 분석을 위한 파이프라인이 나타난다.
서론
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) 이완 분산 (RD) 실험은 용액 NMR분광법 1,2,3,4,5에의해 μs-ms 시간 척도에서 발생하는 형태 평형을 특성화하기 위해 일상적인 베이스에 사용된다. 균역학을 조사하는 다른 방법에 비해 CPMG 기술은 현대 NMR 분광계에서 비교적 구현하기 쉽고, 특수 시료 준비 단계(즉, 결정화, 샘플 동결 또는 정렬 및/또는 형광 또는 파라마그네틱 태그와 함께 동월 결합)을 필요로 하지 않으며, 구조적, 역학적 재형성, 역학적 재형성, 역학적 재해석, 동역학적 재보행의 포괄적인 특성화를 제공한다. CPMG 실험이 형태 평형에 대해 보고하기 위해서는, 두 가지 조건이 적용되어야 한다: (i) 관찰된 NMR 스핀은 형태 교환(microstates)을 겪고 있는 상태에서 다른 화학적 변화를 가져야 하며 (ii) 교환은 ~50 μs에서 ~10ms에 이르는 시간 척도로 이루어져야 한다. 이....
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프로토콜
1. NMR 샘플 의 준비
- 관심 있는 단백질의 2H,15N-labled 샘플을 표현하고 정화합니다.
참고: 15개의N 라벨 단백질 샘플이 CPMG RD 실험의 획득에 사용될 수 있지만, 감단(가능한 경우)은 얻어진 데이터의 품질을 극적으로 증가시킵니다. 정해성 단백질의 생산을 위한 프로토콜은문헌(13)에서유효하다. - 완충제는 정제된 단백질 샘플을 탈가스 NMR 버퍼로 교환합니다.
- NMR 샘플을 NMR 튜브로 전송합니다.
참고: NMR 샘플의 농도는 신호 대 잡음 비율을 최대화하고 단백질-단백질 상호 작용의 발생을 최소화하기 위해 신중하게 최적화되어야 합니다. 일반적으로 CPMG 실험의 전형적인 농도 범위는 0.1-1.0 mM이다.
2. NMR 실험의 첫 번째 설정
- 추가 파일을 다운로드하고 압축 해제합니다.
- 파일 bits.vv 및 trosy_15N_cpmg.vv(펄스 프로그램라는 폴더에 위치)를 펄스 프로그램 디렉토리(
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결과
여기서 설명된 프로토콜은 1H-15N TROSY스펙트럼(그림 3A)에서각 피크에 대한 RD 프로파일을 획득하는 결과를 낳는다. 인수된 RD 프로파일로부터, 각 백본 아마이드 그룹의 15N횡방향 이완에 대한 교환 기여도를 추정할 수있다(도 3A,3B). 조사 중인 단백질의 3D 구조에 Rex를 플로팅함으로써, μs-ms 시간척도(도 3C)에대한 형성 교류를 겪고 있는 구조 영역을 식별할 수 있다. 카버-리차드 방정식을 이용한 RD 곡선모델링은 평형 상태의 분수 집단 및 이들 상태 간의 교환률과 같은 교환 공정에서 열역학 및 운동 파라미터를 반환한다(도1, 도 3D).
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토론
이 원고는 단백질에 대한 15NRD 데이터를 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜을 설명합니다. 특히 NMR 샘플 의 준비, NMR 데이터 측정 및 RD 프로파일 분석을 위한 중요한 단계가 다룹니다. Rd 실험의 인수 및 분석에 관한 몇 가지 중요한 측면에 대해 논의됩니다. 그러나, 실험 및 데이터 분석에 대한 보다 심층적인 설명을 위해, 본문문헌을 주의 깊게 공부하는 것이3, 8,11,15,16을적극 권장한다.
NMR 샘플을 준비할 때, 주요 NMR 가시종과 관련하여 사소한(<1% 채밀) 상태의 존재가 검출 가능한 RD 프로파일.......
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공개 사항
모든 저자는 원고를 읽고 승인했습니다. 우리는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIGMS R35GM133488의 자금과 로이 J. 카버 자선 신탁에서 V.V.V.에 이르기까지 자금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | 감도 향상 |
| 중수소 산화물 | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% 순수, NMR 샘플 및 중수소 배양 준비에 활용 |
| 수동 구동 원심분리기 | United Scientific 공급 | CENTFG1 | NMR 튜브 벽에 붙어 있는 기포나 잔류 액체를 제거하는 데 사용됩니다. |
| High Field NMR 분광계 | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | NMR 데이터 수집 |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | NMR 데이터 모델링 |
| NMR 파스퇴르 피펫 | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex 유리 파스투어 피펫으로 액체 샘플을 NMR 튜브 |
| Willmad Precision에서 이송 | 535-PP-7 | 5mm 얇은 벽 7'' 원통형 유리관 | |
| NMR립 | 생명과학 및 생명공학 연구소 | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR 데이터 처리 |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | NMR 데이터 분석 |
| Tospin 3.2 (또는 그 이상) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | 수집 소프트웨어 |
참고문헌
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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재인쇄 및 허가
