환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

인간암세포는 암의 생물학을 연구하고 항암제를 평가하기 위해 널리 받아들여진다. 그러나, 이러한 세포주 반드시 그들의 형태 때문에 그들의 소스 조직의 원래 특성을 보존 하지 않습니다., 유전자 돌연변이, 그리고 유전자 발현 프로필 오랜 기간 동안 문화 동안 변경할 수 있습니다. 더욱이, 이들 세포주 대부분은 단층에서 배양되거나 뮤린 제노이식으로 사용되며, 어느 쪽도 물리적으로 종양 조직^1,2를나타내지 않는다. 따라서, 항암제의 임상효능은 암세포주에서 관찰된 것과 동일하지 않을 수 있다. 따라서, 환자 유래 종양 이노이식또는 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs) 및 종양 조직의 구조 및 기능을 정확하게 재현하는 종양 스페로이드 모델을 이용한 전 생체내 작용체가 개발되고 있다. 증가하는 기록은 이 모형이 관련 암 조직에 직접 비교됨으로써 항암제에 환자의 반응을 예측한다는 것을 건의합니다. 이들 체외 시스템은 상이한 종양 조직 유형에 대해 확립되었으며, 약물 스크리닝을 위한 관련 고처리량 분석시스템(HTS)도^3,4,5,6,7을개발하였다. 환자 또는 환자 유래 종양 xenografts로부터 얻은 1 차종양의 이질적인 전 생체 권식배는 기질 조직^8,9,10에서세포의 복잡성을 유지하는 배양의 용이성과 능력 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 견인력을 얻고^있다. 이러한 모델은 암의 생물학에 대한 이해를 높이고 체외에서약물 효능의 평가를 용이하게 할 것으로 기대된다.

최근 후쿠시마 번역 연구 프로젝트에서 F-PDO로 지정된 다양한 유형의 종양 조직에서 일련의 새로운 PdOs가 만들어졌습니다. PdOs는 소스 종양의 형태와 유사한 큰 세포 클러스터를 형성하고 6 개월 이상 배양 할 수있다^11. 비교 조직학 및 포괄적인 유전자 발현 분석은 PdOs의 특징이 문화 조건하에서 장기간 성장한 후에도 그들의 근원 종양 조직의 특징에 가깝다는 것을 보여주었습니다. 또한, 96웰 및 384웰 플레이트의 각 유형의 PDO에 적합한 HTS가 설립되었다. 이러한 아세약은 여러 분자 표적 제제 및 항체를 평가하기 위해 사용되었습니다. 여기서, 자궁내막암에 사용되는 표준 화학요법(paclitaxel 및 카보플라틴)은 파클리탁셀과 카보플라틴에 반응하지 않은 환자로부터 유래된 F-PdOs를 사용하여 평가하였다. 이에 따라, 이러한 PDO에 대한 파클리탁셀 및 카보플라틴의 세포 성장 억제 활성은 약하였다(IC₅₀: >10 μM). 또한, 이전 연구는 화학요법제제 및 분자표적제에 대한 일부 F-PdOs의 민감도가 임상 효능^11,12,13과일치한다고^{보고하였다.} 마지막으로, 항암제에 의한 PdOs의 고차 구조의 변화는 3차원 세포 분석^{시스템(12,13)을}사용하여 분석되었다. PDO 기반 HTS를 이용한 항암제의 평가 결과는 이들 제제에 대해 얻어진 임상 결과와 유사하다. 여기서, PDO 모델을 사용하여 항암제 및 면역요법의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있는 보다 간단하고 정확한 HTS를 위한 프로토콜이 제시된다.

헬싱키 선언에 따라 인간 유래 자료와 관련된 모든 실험은 후쿠시마 의과대학 윤리위원회(승인번호 1953및 2192; 승인일 1953및 2192; 승인일 2020년 3월 18일, 2016년 5월 26일)에 의해 사전에 승인되었습니다. 이 연구에서 사용된 임상 표본을 제공한 모든 환자로부터 서면 통보 된 동의를 얻었습니다.

1. PdOs 문화

참고: F-PdOs는 다양한 이기종 형태를 나타내고 서스펜션 배양에서 성장하는 세포 클러스터를 형성한다(그림1). 또한 F-PdO는 6개월 이상 배양할 수 있으며 향후 사용을 위해 냉동 보존할 수 있습니다.

1. 저장된 PdOs의 해동 (0일)
   1. 0일째(그림 1)에해동 및 종자 PdOs (예를 들어, RLUN007, 폐 아데노암) 먼저, B-27 보충제의1%와 멸균 50mL 원심분리기 튜브에 표피 성장 인자의 30 ng/mL을 포함하는 PdOs용 배지 15mL(재료 표 참조)를 추가합니다.
   2. 액체 질소 저장에서 냉동 유리병을 제거 한 후, 부드럽게 2 분 동안 37 °C 수조에서 PdOs를 교반. 다음으로, 수조에서 유리병을 제거하고, 70%에탄올로 바이알을 닦은 다음, 바이알을 생물학적 안전 캐비닛으로 옮킨다.
   3. 유리병의 내용을 15mL의 매체를 포함하는 튜브로 전송하여 PdfOs용 배지를 전송한다. 3mL 전송 파이펫으로 5회 위아래로 부드럽게 파이펫을 하여 PdOs와 매체를 혼합합니다. ~25°C에서 3분 동안 200 x g의 튜브원심분리기를 제거하고 상퍼를 폐기합니다. PDO 펠릿을 5mL의 신선한 배지로 재연하고 25cm² 플라스크(재료 표참조)로 부드럽게 피펫팅으로 옮김합니다. 마지막으로, 5% CO_2에서37°C에서 인큐베이터에서 PdOs를 배양한다.
2. 일주일에 두 번(3-7일)을 변경합니다. 세포 클러스터를 침전시키고 배지의 4mL(80% 부피)를 대체하는 PDO 현탁액을 원심분리한다. 신선한 배지에서 세포를 다시 중단합니다.
   참고: RLUN007의 대다수는 직경이 100-500 μm인 세포 클러스터로 나타납니다. 미디엄에서 페놀 레드의 색이 도 1A에도시된 대로 노란색으로 변하면 배지를 더 자주 교체한다. 배지가 교체 다음날 노란색으로 변하고 각 셀 클러스터가 합쳐져 직경>500 μm의 더 큰 클러스터를 형성하면 1:2의 분할 비율로 통과합니다.
3. PdOs의 하위 문화(8-28일)
   참고: 실제로 단일 세포의 수를 측정하는 어려움을 감안할 때, 통로의 타이밍은 원심 분리 후 적절한 세포 클러스터 밀도 및 PDO 펠릿의 크기에 따라 결정된다(도1B). RLUN007의 경우, PDO 펠릿의 부피는 해동 후 약 2주 후에 30 μL(25cm² 플라스크의 포화 밀도)에 도달한다.
   1. 25cm² 플라스크에서 25cm² 플라스크(P1)로 1개에서 이송하기 위해 PDO 서스펜션을 원심분리기 튜브및 원심분리기로 약 25°C에서 2분 동안 200xg로 옮긴다. PDO 펠릿의 부피를 추정하고 상체를 폐기합니다. 5mL 의 신선한 배지에서 5mL 파이펫을 사용하여 PDO 펠릿을 다시 중단합니다. 파이펫은 저속으로 5회 부드럽게 위아래로 내려오고 있습니다. 그런 다음 PDO 서스펜션(2.5mL)의 부피의 절반을 두 개의 플라스크로 옮기고, 각 플라스크에 2.5mL의 신선한 매체를 추가한다. 5% CO_2에서37°C에서 세포를 배양한다.
   2. 25cm² 플라스크에서 75cm² 플라스크(P2)로 옮기려면 2개의 플라스크에서 2개의 플라스크에서 PDO 서스펜션을 2개의 원심분리관으로 옮기고 PDO를 약 25°C에서 2분 동안 200xg로 원심분리한다. 다음으로, PDO 펠릿의 부피를 추정하고 2.5mL의 신선한 배지(튜브당)에서 펠릿을 재연한다. 그 후, PDO 서스펜션을 한 튜브에 결합하여 다른 튜브에 결합하여 신선한 배지 10mL를 포함하는 75cm² 플라스크로 옮겨낸다. 5% CO_2에서37°C에서 세포를 배양한다. 서브 배양 된 PdOs를 2 25cm² 플라스크에서 첫 번째 통과 후 약 1 주일 후 75cm² 플라스크로 전송합니다(그림 1C).

2. 성장 억제 HTS

참고: 도 2에도시된 바와 같이, PdOs에 대한 항암제의 성장 억제 활성은 세포내 ATP 함량을 측정하여 평가된다. 이 단계는 시판되는 셀 생존 가능성 분석 키트를 사용하여 수행됩니다(재료표참조).

1. 0일째에, 분석기에는 적절한 수의 세포 클러스터를 사용할 수 있습니다. 시딩 하루 전에 PDO 서스펜션을 75cm² 플라스크에서 15mL 튜브로 옮기고 원심분리기를 200 x g에서 2분 동안 전송하여 PDO 펠릿 부피를 측정합니다. 그런 다음, 신선한 매체의 15 mL에서 PDO 펠릿을 다시 중단하고 75cm² 플라스크로 다시 전송합니다. 5% CO_2에서37°C에서 세포를 배양한다.
   참고: 필요한 PDO 펠릿 부피는 각 PDO의 희석률과 분석에 사용되는 384웰 플레이트 수에 따라 달라집니다. RLUN007의 경우 10개의 384웰 플레이트로 파종하기 위해서는 200μL의 세포 펠릿 부피가 필요합니다.
2. 1일(24시간 매체 변경 후)에서는 70μm 메쉬 필터가 포함된 필터 홀더로 셀 조각화 및 분산 장비(재료 표참조)를 사용하여 PdOs를 다진다. 그런 다음, PDO 서스펜션의 15mL를 10배 희석시 희석시. PDO 서스펜션의 종자 40 μL은 셀 서스펜션 디스펜서를 사용하여 384웰 초저 부착 스페로이드(원형 바닥) 마이크로플레이트(재료표참조)로 한다(재료표참조).
   참고: 셀 클러스터를 다진 경우 시판되는 셀 조각화 및 분산 장비를 사용하는 것이 좋습니다(재료 표참조).
3. 시드 후 24시간(2일째)에서 액체 처리기를 사용하여 최종 농도 범위에서 20 μM ~ 1.0nM(10개의 직렬 희석)의 최종 농도 범위에서 0.04 μL의 시험제 용액을 가진 PdOs를 치료하십시오(재료표참조).
4. 8일째(시험 약물 치료 후 144시간)에 세포내 ATP 측정 시약을 시험 우물에 추가합니다. 믹서를 사용하여 플레이트를 혼합하고 25 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 플레이트 판독기를 사용하여 세포내 ATP 콘텐츠를 발광으로 측정합니다(재료 표참조).
5. 셀 생존가능성을 계산하려면, 테스트 우물에서 ATP의 양을 배경을 빼고 차량을 포함하는 컨트롤 웰에 나누어 놓는다. 6일 간 성장률을 계산하려면, 종자 후 24시간 차량 제어 우물에서 ATP의 양을 차량 제어 우물에 분배한다.
6. 생물학적 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 용량 반응 곡선으로부터 50% 억제 농도(IC₅₀₎및 곡선(AUC) 값 아래 영역을 계산합니다(재료표참조). Z 계수는 1 (무한 분리)에서 <0까지 범위의 차원없는 매개 변수로, Z = 1로 정의 - (3θc + + + 3θc-) / |μc+- μc-|, 여기서 θc+, θc-, μc+, 및 μc-표준 편차(σ) 및 평균(μ)의 높은(c+) 및 14(c+) 및^14의표준 편차(σ)와 평균(μ)이다.

3. 성장 억제를 위한 세포 따기 및 화상 진찰 시스템을 가진 HTS

참고: 프로토콜 2를 이용한 데이터에서 큰 편차가 있는 경우(분석에서 변형[CV]의 계수가 20% 이상인 경우, 선택한 크기의 PdOs는 셀 피킹 및 이미징 시스템을 사용하여 96웰 또는 384웰 플레이트로 시드될 수있다(그림 2). 프로토콜은 이전 섹션의 2.1 및 2.2 단계에 설명된 것과 동일합니다. 이 단계는 시판되는 셀 피킹 및 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다(재료표참조).

1. 1일째에는 384웰의 초저부착 스페로이드 마이크로플레이트를 40 μL의 중간//크기로 설정하고 세포 피킹 및 이미징 시스템에 대상 플레이트를 놓습니다.
2. 기포를 제거하기 위해 2 분 동안 1,500 x g에서 배양 배지 및 원심 분리기 6 mL로 따기 챔버 (재료 표참조)를 채웁니다. 매체에 일시 중단된 PdOs(PDO 펠릿 부피, 4 μL)를 피킹 챔버에 추가하고 시스템에 설정합니다.
3. 적어도 1 분 동안 챔버를 서서 분산하여 세포 클러스터가 챔버의 바닥에 정착되도록하십시오. 그런 다음 챔버의 스캔을 수행합니다.
4. 셀 클러스터의 자동 선택을 위해 시스템에 피킹 크기를 140-160 μm(면적 15,386-20,000 μm^2)으로설정합니다. 다음으로, 스캔된 이미지에서 선택한 셀 클러스터의 품질을 확인하고 선택 팁(재료 표참조)을 사용하여 웰당 10개의 셀 클러스터를 대상 플레이트로 전송합니다.
5. 2.3단계에서 프로토콜 단계를 수행합니다.

4. 항체 의존세포 세포 독성에 대한 HTS

참고:이 단계는 전기 임피던스 측정 기기인 시판 가능한 시스템(재료 표참조)을 사용하여 수행됩니다. 단클론 항체 및 천연 킬러(NK)세포(도 3)를이용한 항체 의존세포 세포독성(ADCC)에 의한 PdOs의 세포투하를 평가하는 데 사용된다. NK 세포는 NK 세포 생산 키트(재료표 참조)를사용하여 말초 혈액 단핵 세포로부터 생산되며 제조업체의 지시에 따라 생산됩니다.

1. ADCC 활동 측정
   1. 0일째에는 96웰 플레이트(재료표참조)를 4°C에서 10 μg/mL 섬유네틴 용액(0.5 μg/well)의 50μL로 코팅합니다.
   2. 1일째, 섬유네틴 용액을 제거한 후, 각 웰에 배양 배지의 50 μL을 추가하여 배경 임피던스를 측정합니다.
   3. 시드전에는 5mL의 세포배양 해리 시약(재료표 참조)을 PdOs(RLUN007: 75cm² 플라스크에서 PDO 펠릿의 100 μL)를 추가하고 PDOs를 분산시키는 데 20분 동안 37°C의_CO2 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이트한다. 트립시니화를 중지하려면 배지, 원심분리기 5mL을 추가하고 해리 시약을 제거합니다. 40 μm 셀 스트레이너를 통해 신선한 매체로 PdOs를 헹구고 필터를 사용합니다(재료 표참조).
   4. 셀 생존 가능성 분석기를 사용하여 셀 수를 계산합니다(재료 표참조).
   5. PDO 서스펜션을 저수지로 옮기고 다중 채널 피펫을 사용하여 혼합합니다. 96웰 플레이트에 5 x 10⁴ 셀/웰의 우물에 PDO 서스펜션을 추가합니다. 각 우물에는 100 μL의 최종 부피가 포함되어 있습니다. 그런 다음, 30 분 동안 약 25 °C의 생물학적 안전 캐비닛에 플레이트를 놓습니다.
   6. 37°C에서 CO₂ 인큐베이터로 플레이트를 계측기로 옮기다. 임피던스의 변경 사항을 셀 인덱스로 15분마다 기록합니다.
   7. PDO 파종과 같은 날에 37°C 의 수조에서 NK 세포를 해동한다. 유리병에서 NK 셀에 대한 10mL의 배지를 포함하는 15mL 튜브로 세포를 전송(재료표참조) 및 원심분리기는 약 25°C에서 5분 동안 300 x g로 전달한다. 상체를 버리고 신선한 배지의 10mL에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 계수 후 세포 밀도를 1 x 10⁶ 셀/mL로 조정하고 75cm² 플라스크로 옮김합니다. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 NK 세포를 배양한다.
   8. 2일째에는 멸균 V-바닥 96웰 플레이트의 최종 농도의 10배인 항체 용액(인산염 완충식식염)을 준비한다.
   9. 각 우물에서 60 μL의 매체를 제거하고, 10 μg/mL, 1 μg/mL 및 0.1 μg/mL)의 10 μL을 PdfOs에 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터의 기기로 다시 옮기고 셀 인덱스를 1h로 기록합니다.
   10. NK 셀 서스펜션을 50mL 튜브로 옮기고 세포 수를 계산합니다. 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 NK 세포 밀도를 1 x 10⁶ 셀/mL 및 2 x 10⁶ 셀/mL로 조정하여 PdOs용 배지로 조정합니다.
   11. 1:1 또는 2:1의 표적(RLUN007) 세포 비에서 이펙터(NK) 세포에 NK 셀 현탁액50μL을 추가한다. 항체의 최종 농도는 1 μg/mL, 0.1 μg/mL 및 0.01 μg/mL이다. 플레이트를 약 25°C에서 15분 동안 보관하고 판을 계측기로 되돌려 놓습니다.
2. 데이터 수집 및 분석
   1. 분석 소프트웨어를 사용하여 셀 인덱스를 백분율 사이토리시스 값으로 변환합니다(재료 표참조).
   2. 백분율 세포석은 대조군으로 단독으로 표적 세포 (PdOs)에 비해 NK 세포에 의해 살해된 표적 세포의 백분율을 말합니다. 각 시점에서 샘플 우물의 인덱스에서 NK 셀만 포함하는 우물의 셀 인덱스를 뺍니다. 항체를 첨가하기 직전에 각 값을 세포 지수로 정규화한다. 다음 방정식을 사용하여 정규화된 세포 지수를 백분율 세포용액으로 변환합니다: % 세포분석 = (1- 정규화된 세포 지수 [샘플 우물]) / 정규화된 세포 지수(표적 단독 우물) x 100.

매우 정확한 HTS는 항암제를 평가하기 위해 PdOs 및 384웰 마이크로플레이트를 사용하여 개발되었으며, 각 PDO에 대한 HTS의 개발은 이전에10,11,12,13을보고되었다. HTS의 성능은 CV와 Z계수를 계산하여 평가하였다. Z'-factor는 분석 품질 및 성능의 검증을 위해 널리 허용되는 방법이며, 이 값이 >0.514인경우 분석이 HTS에 적합합니다. RLUN007을 이용한 384웰 플레이트 분석의 제어 데이텀 포인트는 CV 값이 5.8% 및 0.83의 Z-factors를 계산한 반면, 거의 변동성이 보이지 않았으며, 그림 4에나와 같이 0.83의 Z-factors를 계산하였다. 이러한 결과는 이 분석이 HTS에 대한 높은 성능을 가지고 있음을 나타냅니다. HTS를 이용한 항암제에 대한 PdOs의 민감도를 조사하기 위해, 성장 억제는 8개의 항암제, 특히 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제(아파티닙, 엘로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 라파티닙, osimertinib 및 로실레티닙) 및 파클리타셀을 사용하여 평가되었다. 각 PDO에 대한 항암제의 IC50 및 AUC 값은 도 4에도시된다. RLUN007은 모든 EGFR 억제제 및 기타 항암제에 대해 고감도(IC50 < 2 μM, AUC < 282)를 나타냈다. 모든 데이터를 위해 계산된 시그노이드 곡선은 항암제의 성장 억제 활성을 정확하게 측정할 수 있음을 나타냈다.

상기 방법론을 사용하여 데이터가 크게 달라질 때 세포 따기 및 이미징 시스템이 사용됩니다. 세포 클러스터를 손상시키지 않고 정확하게 선택하는 세포 따기 및 이미징 시스템은 세포 클러스터 크기를 조정하여 세포 이물질을 분석 시스템에서 제외하여 정확한 HTS 분석방법을 허용합니다. 시스템을 사용하지 않았을 때 CV 값은 26.0% 및 Z의 요인 값은 0.23(데이터가 표시되지 않음)이었습니다. 그러나 CV와 Z의 계수 값은 시스템을 사용하여 각각 6.4%와 0.81로 개선되었습니다.

장시간 세포의 수, 형태 및 부착물을 모니터링하는 전기 임피던스 측정 기기를 사용하여 ADCC 활성을 이용한 PdOs의 세포용액을 조사하기 위해, 임피던스 신호의 변화는 96웰의 이펙터 세포로 처리된 RLUN007을 사용하여 평가되었다. 표적 세포로만 구성된 대조군과 비교하여 시간이 지남에 따라 세포세포가 증가했습니다. 항체 없이 E:T 비율 1:1(도5A,C) 또는 2:1(도5B,D)에서6시간 후 45% 또는 75%에 도달하였다. TRAstuzumab을 이용한 NK 세포 매개 세포 분석은 각각 6시간(도5A,1 μg/mL) 및 2:1(도5B,1 μg/mL)의 비율로 약 60% 및 90%였다. 대조적으로, cetuximab는 NK 세포 매개 세포염에 복용량 의존적인 충격이 있었다 (도 5C,D). 세툭시맙의 가장 높은 농도에서 RLUN007은 각각 1:1과 2:1의 비율로 90%와 100%로 파괴되었다(그림5C,D). 트라스투주맙의 효과는 60%의 세포독성만으로 세툭시맙보다 약했습니다. 이러한 결과는 PDO 분석 시스템이 실시간 임피던스 기반 기술을 사용하여 ADCC 활동을 평가할 수 있음을 나타냅니다.

그림 1: PDO 문화에 대한 임계 점. (A)매체의 색상 변경. (B)50-200 μL에 대한 수준으로 표시된 튜브로 PdOs를 포함하는 원심분리기 튜브를 일렬로 세공하여 펠릿 크기로부터 의 PdOs의 양을 측정합니다.(C)PDO 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 384웰 마이크로플레이트를 사용하여 고처리량 분석 시스템을 만드는 데 사용되는 프로토콜의 요약입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: ADCC 활동의 높은 처리량 분석에 대한 프로토콜의 요약입니다. ADCC, 항체 의존형 세포 세포 독성; NK, 자연 살인자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 항암제의 성장 억제를 위한 고처리량 분석 시스템. 항암제에 대한 RLUN007의 용량 반응 곡선. 다진 PdSo는 384웰 플레이트로 시드되었습니다. 이들은 항암제의 10개의 다른 농도로 6일 동안 치료되었다(10 μM과 1.5 nM 사이). 데이터는 삼중 실험의 표준 편차에 ± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: ADCC 활동에 대한 높은 처리량 분석. (A,B) 트라스투주맙. (C,D) 세툭시맙. (A,C) 이펙터 셀에 대한 RLUN007의 1:1 비율. (B,D) RLUN007의 비율을 가진 세포분석: 1:2의 이펙터 세포. 활성은 이펙터 셀을 첨가한 후 12h를 측정하였다. 데이터는 세 개의 복제 샘플의 표준 편차가 ± 평균으로 제시됩니다. ADCC, 항체 의존형 세포 세포 독성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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