Caenorhabditis elegans의 수지상 가시 이미징

수지상 가시는 시냅스 전달을 위해 이웃 뉴런으로부터 입력을받는 특수 세포 구조입니다. 신경 전달 물질 수용체의 활성화는 이러한 특징적인 신경 돌출부에서 세포 내 칼슘 및 하류 신호 전달 경로를 상승시킵니다¹. 신경 전달에 대한 수지상 척추의 근본적인 중요성과 신경^{발달 질환에서} 잘못된 조절 1 때문에 수지상 척추 형태 형성 및 기능을 조절하는 요인의 발견은 신경 과학 분야에서 높은 관심을 끌고 있습니다.

최근에, 수지상 가시는 포유류 가시와 공유되는 주요 특성을 기반으로 C. elegans 신경계에서 확인되었습니다². 이 결정은 척추 생물학을 조사하기 위해 C. elegans의 장점을 활용할 가능성을 열어주기 때문에 중요합니다. 등쪽 D(DD) 운동 뉴런의 수지상 가시는 복부 신경줄의 콜린성 뉴런(VA 및 VB)으로부터 입력을 받습니다(그림 1A)^2,3,4. 여기에서는 DD 수지상 가시의 구조와 생체 내 기능을 라이브 이미징 및 유전자 분석에 쉽게 접근할 수 있는 온전한 신경계에서 탐색하기 위한 이미징 방법을 제시합니다. 수지상 가시의 형상을 모니터링하기 위해, (1) 수지상 과정 및 가시를 채우는 세포질 형광 단백질; (2) 수지상 가시와 수상 돌기의 경계를 장식하는 막 결합 형광 단백질; 또는 (3) 수지상 가시가 풍부한 액틴 마커인 LifeAct⁵ 또는 Utrophin⁶을 사용하여 모양을 드러냅니다. DD 스파인의 기능을 모니터링하기 위해 GCaMP 형광은 시냅스 전 콜린성 뉴런⁷에서 적색 편이 옵신 크림슨의 활성화에 의해 유발되는 Ca++ 과도 현상을 감지하는 데 사용됩니다. 두 전략 모두 야생형 및 돌연변이 동물에서 DD 수지상 가시에 대한 연구를 용이하게 할 것으로 예상됩니다.

1. DD 수지상 가시의 구조 결정

1. DD 스파인에 레이블을 지정하는 형질전환 웜 만들기
   1. flp-13 프로모터를 사용하여 관심 있는 표지(예: 세포질 mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin)에 대한 발현 벡터를 구축합니다(그림 1). 보충 파일 1에서 플라스미드의 전체 목록을 참조하십시오.
   2. 확립된 방법을 사용하여 DD 스파인 ^8,9를 표지하는 트랜스제닉 라인을 생성한다.
2. 실란트 준비
   1. 파라핀 기반 매립 매체¹⁰ 의 1:1 혼합물을 만듭니다( 재료 표 참조).
   2. 용융될 때까지 배지를 60°C에서 가열한 다음, 캡핑된 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 분취하고, 가열 블록을 60-70°C로 유지한다.
      알림: 실란트는 가열 블록에서 4 주 동안 지속될 수 있습니다.
3. 마취제를 준비하십시오.
   1. 1 % 트리카인과 1M 레바 미솔의 증류 된 H₂O에서 원액을 만듭니다 ( 재료 표 참조). -20 °C에서 보관하십시오.
   2. 단계 1.3.3-1.3.5 11에 기재된 바와 같이, 0.05% 트리카인 및 15 mM 레바미솔 마취제의 작업 용액을 준비^한다.
   3. 1% 트리카인 스톡 75μL와 1M 레바미솔 22.5μL를 혼합합니다.
   4. M9 완충액을 최종 부피 1.5mL에 추가합니다.
   5. 0.05% 트리카인, 15 mM 레바미솔 10 μL를 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 분취하고, -20°C에서 보관한다.
      알림: 마취 혼합물은 온도에 민감하며 각 실험에 대해 해동 후 작업 용액의 개별 분취량을 다시 동결해서는 안됩니다. M9 버퍼에 대한 레시피는 보충 파일 2 를 참조하십시오.
4. 고해상도 이미지 획득
   1. 10% 아가로스를 제조하고 60°C의 수조에 유지한다.
      참고: WormBook¹²의 Monica Driscoll의 보고서를 참조하십시오.
   2. 15-20명의 젊은 성인을 10% 아가로스 패드에 장착하고 3μL의 마취제를 추가합니다(3단계 참조).
   3. 커버 슬립을 적용하십시오 (웜은 5 분 이내에 고정됩니다).
   4. 녹은 접착 실란트 혼합물로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하십시오 ( 재료 표 참조).
   5. 이미지 수집
      1. 초고해상도 획득
         1. 초고해상도 현미경용 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경과 63x/1.40 Plan-Apochromat 오일 대물 렌즈를 사용하여 작은 픽셀 크기(예: < 50nm)를 달성합니다. 제조업체의 소프트웨어에서 권장하는 단계 크기를 사용하여 Z 스택을 획득합니다( 재료 표 참조).
         2. DD 복부 프로세스의 총 부피에 걸쳐 있는 일련의 광학 섹션을 수집합니다(예: 0.19μm 스텝 크기 또는 2-3μm 두께에서 15-20개 슬라이스). 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 위해 Z 스택을 제출하고 점수가 7보다 높은 이미지를 분석합니다(그림 1B, 그림 2 및 그림 3).
      2. 나이퀴스트 인수
         1. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 빛의 파장과 사용 중인 대물 렌즈의 개구수에 대한 최적의 픽셀 크기를 선택합니다(예: 40x/1.4 Plan Fluor oil 대물렌즈).
            참고: 픽셀 크기가 작을수록 DD 가시의 미세한 구조가 드러납니다.
         2. 자동 알고리즘을 사용하여 3D 디콘볼루션을 위한 스택을 제출합니다( 재료 표 참조)(그림 3).
      3. Z의 오버샘플링은 3D 디콘볼루션¹³ 후에 더 선명한 이미지를 생성할 수 있기 때문에 가능한 가장 작은 Z 단계(예: 피에조 단계에 의해 결정됨)를 사용합니다.
5. 이미지 분석
   1. 적절한 이미지 처리 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 Z-스택(¹⁴)의 최대 강도 투영을 생성합니다.
   2. DD 수상 돌기의 돌출부를 수동으로 세십시오.
      알림: 돌출부는 주 샤프트에서 수직으로 확장됩니다(그림 1B, 화살촉).
   3. DD 수상 돌기의 길이를 결정하여 DD 수상 돌기의 10 μm 당 가시의 밀도를 계산했습니다 (그림 1C).
   4. 가시를 얇은/버섯, 필로포디얼, 뭉툭하거나 가지로 분류합니다(그림 2A).
      알림: 얇은/버섯 가시는 좁은 바닥(목)과 더 넓은 팁(머리)을 나타냅니다. Filopodial 가시는 수축 된 바닥 (목 없음)을 표시하지 않지만 일정한 너비를 갖습니다. 뭉툭한 등뼈는 넓은 바닥과 팁을 가지고 있습니다. 분기 된 등뼈는 하나 이상의 팁이있는 돌출부입니다.

2. 시냅스 전 콜린성 신호 전달에 의한 DD 수지상 척추의 활성화 평가

1. 기존 기술(예: 미세 ^주입)을 사용하여 형질전환 웜 생성^8,9
   1. flp-13 프로모터를 사용하여 DD 뉴런에서 Ca⁺⁺ 센서인 GCaMP6s의 발현을 유도하고 unc-4 프로모터를 사용하여 시냅스 전 VA 뉴런에서 적색 이동 채널로돕신인 크림슨의 발현을 유도합니다(그림 4A). 보충 파일 1의 플라스미드 목록을 참조하십시오.
2. 전-트랜스 망막 (ATR) 및 대조군 플레이트를 준비하십시오.
   참고: ATR은 Chrimson이 광유전학적으로 활성화된 이온 채널로 기능하는 데 필요한 보조 인자입니다.
   1. 에탄올 (100 %)에서 100 mM ATR 저장 용액을 준비한다. -20°C에서 1mL 분취량으로 보관하십시오.
   2. 층류 후드 아래에서 각 60mm NGM(선충 성장 배지) 영양 한천 플레이트에 300μL의 야간 OP50 박테리아 배양과 0.25μL의 ATR을 추가하고 멸균 유리 막대로 뿌립니다.
   3. 대조군의 경우 300μL의 OP50 박테리아와 0.25μL의 에탄올(100%)을 별도의 NGM 플레이트 그룹에 추가합니다.
   4. 박테리아가 자랄 수 있도록 플레이트를 실온에서 24시간(주변광으로부터 보호) 동안 후드에 두십시오.
      알림: 플레이트는 초기 24시간 배양 후 사용하거나 4°C에서 유지하여 5일 이내에 사용할 수 있습니다.
3. 실험 설정
   1. 5569 개의 NC4 L4 단계 유충을 OP50 시드 ATR 또는 ATR이없고 23 ° C의 어둠 속에서 자라는 대조군 플레이트에 놓습니다.
   2. 3일 후, 스테레오 해부 현미경을 사용하여 외음부 발달을 확인하여 2.4.1-2.4.3단계에 설명된 대로 이미징을 위해 ATR 및 대조군 플레이트에서 L4 단계 자손을 선택합니다.
   3. 현미경 슬라이드에 0.05μm 폴리비드(2.5% 고형분 w/v) 2μL를 놓습니다( 재료 표 참조).
   4. 백금 와이어 ( "웜 픽")를 사용하여 용액에 작은 슈퍼 접착제 덩어리를 추가하고 부드럽게 소용돌이 치며 필라멘트 "가닥"의 접착제를 생성합니다. 그런 다음 3μL의 M9 버퍼를 추가합니다(그림 4B).
   5. 약 10 개의 L4 유충을 용액에 넣고 커버 슬립을 바르십시오.
      알림: 접착제 섬유는 무작위로 웜과 접촉하여 커버 슬립을 적용한 후 고정시킵니다. 큰 접착제 덩어리에 내장 된 웜은 건조 된 것처럼 보이므로 이미지를 찍어서는 안됩니다.
   6. 1.4.4단계에서 언급한 대로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
4. 수지상 가시에서 유발된 Ca⁺⁺ 과도 현상의 기록.
   1. 민감한 CCD 카메라, 100x TIRF 오일 대물 렌즈, 488nm 및 561nm 레이저 라인이 장착된 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하십시오( 재료 표 참조).
   2. 초점면에 DD 스파인을 배치하도록 현미경 스테이지를 조정합니다.
   3. 매 프레임마다 488nm 레이저 라인(GCaMP6s 형광 검출용)으로 샘플을 조명하고 주기적으로 561nm 레이저 라인(Chrimson 여기용)으로 샘플을 조명하는 타임랩스 획득을 설정합니다.
      참고: 예를 들어, 488nm 조명을 사용하여 5번째 프레임마다 561nm 빛의 200ms 펄스와 결합된 GCaMP6s 신호의 연속 스냅샷(200ms)을 캡처합니다(그림 4C-E). 이 구성을 사용하면 각 561nm 펄스 전후의 GCaMP 레벨이 ~1초 간격으로 감지됩니다(VA 활성화 전에 GCaMP를 검출하기 위한 488nm 레이저 200ms, VA 활성화를 위한 561nm 펄스 200ms, 레이저 라인과 방출 필터 간 전환의 경우 ~600ms). 이 설정을 사용하면 VA 뉴런이 2.5초마다 활성화됩니다.
5. 생체 내 Ca⁺⁺ 이미징 분석
   1. 2D 디콘볼루션 및 이미지 정렬을 사용하여 획득 중 웜 이동으로 인해 발생하는 사소한 편차를 수정합니다( 재료 표 참조).
   2. DD 수지상 척추를 관심 영역으로 정의합니다(그림 4C-D의 ROI).
   3. ROI를 복제하고 웜 내부의 인접 영역으로 재배치하여 배경 신호(즉, 노이즈)를 수집합니다.
   4. 적절한 소프트웨어( 재질 표 참조)를 사용하여 GCaMP6s 강도를 각 시점별로 엑셀로 내보냅니다. 척추 ROI 형광에서 배경 형광을 뺍니다.
   5. 여기 후 각 시점(ΔF)에서 561nm 여기 직전 프레임의 GCaMP6s 형광(F0)을 뺀 다음 F0로 나누어 ΔF/F0를 결정하여 형광의 변화를 확인합니다(그림 4E).
   6. 정규화된 트레이스를 그래프로 표시합니다( 재질 표 참조).
   7. 561nm 광의 각 펄스 전후의 GCaMP6s 형광 측정에 대해 쌍을 이루는 통계 테스트를 수행합니다.
      참고: 이 접근 방식은 561nm 여기 전후의 모든 측정에서 평균 GCaMP6s 신호를 비교하는 통계적 검정력을 감소시키는 GCaMP6s 형광의 무작위 변동을 효과적으로 배제합니다(그림 4F).
   8. 정규 분포 또는 가우스 분포를 보여주는 측정값의 경우 쌍체 모수 분산 분석을 사용하고 두 그룹 각각에 대한 다중 비교를 수정합니다(전후 ATR, 전후 ATR 없음). 또는 정규 분포를 따르지 않는 데이터의 경우 여러 검정에 사후 보정이 있는 비모수 분산 분석을 사용합니다.
      참고: ATR이 없는 플레이트("ATR 없음")에서 자란 웜은 필수 컨트롤이며 크림슨 기능에 ATR이 필요하기 때문에 561nm 활성화 Ca⁺⁺ 과도 상태를 나타내지 않아야 합니다.

3 개의 독립적 인 마커 (cytosolic mCherry, LifeAct :: GFP :: GFP, MYR :: mRuby)를 사용한 측정은 야생형 젊은 성인에서 DD 수상 돌기 10 μm 당 3.4 ± 1.03 DD 수지상 가시의 평균 밀도를 산출했습니다 (그림 1B, C). 이 분석의 경우, 잠재적으로 척추 형태 형성15를 유도하는 액틴 세포 골격6과 우트로핀의 상호 작용으로 인해 상당히 낮은 척추 밀도를 산출한 GFP::Utrophin 마커로 얻은 측정은 제외되었습니다(2.4 ± 0.74, 그림 1). 광학 현미경의 척추 밀도 측정은 DD1 뉴런 2의 전자 현미경 사진에서 12개의 가시를 재구성하여 얻은4.2개의 척추/10μm 수상 돌기의 값과 비슷합니다. 생세포 이미징 접근법은 DD 척추의 얇은/버섯 모양의 형태가 성인 대 대체 척추 모양(예: 필로포디알, 뭉툭한, 분지)에서 우세하다는 것을 확인했으며(그림 2B), 이는 성숙한 포유류 신경계의 가시에서도 전형적입니다16.

광학 전략을 사용하여 고해상도 광학 현미경 (그림 1 및 그림 2)으로 감지 된 추정 수지상 가시가 포유류 뉴런의 수지상 가시의 특징 인 시냅스 전 부위의 신경 전달 물질 방출에 반응하는지 묻습니다. 녹색 빛(561nm)은 시냅스 전 콜린성 뉴런에서 채널로돕신 변이체인 Chrimson을 활성화하는 데 사용되었고 청색광(488nm)은 시냅스 후 DD 수지상 가시에서 세포질 GCaMP 프로브에서 방출되는 Ca++ 의존성 형광을 감지하는 데 사용되었습니다. 이 실험은 시냅스 전 VA 뉴런에서 Chrimson의 광유전학적 활성화 직후 DD 척추에서 GCaMP 신호의 일시적인 파열을 감지했습니다(그림 3). 이 실험의 성공 여부는 모든 시냅스 전 VA 뉴런에서 Chrimson의 신뢰할 수있는 발현에 달려 있습니다. 이 경우, 일관된 VA 발현을 보장하기 위해Punc-4::Chrimson 마커의 염색체 적분제17을 사용하였다. 이 실험은 염색체 외 배열로도 수행 할 수 있습니다. 특정 VA 뉴런에서의 크림슨 발현은 예를 들어 크림슨 전이유전자를 공동발현 마커2로서 다운스트림 핵-국소화된 GFP를 갖는 SL2 형질도입된 리더 서열에 커플링시킴으로써 독립적으로 확인할 수 있다. 측정된 GCaMP 신호가 엄격하게 ATR에 의존하는 Chrimson의 광유전학적 활성화에 의존한다는 것을 확인하기 위해 ATR이 없는 상태에서 대조 실험을 수행하는 것이 필수적입니다(그림 4D). 마지막으로, 유발된 Ca++ 신호는 과도 상태이므로 488nm 레이저를 사용한 561nm 여기와 GCaMP 신호 획득 간에 신속한 전환(<1초)을 허용하는 이미징 프로토콜을 채택하는 것이 중요합니다(그림 4).

그림 1: DD 수지상 가시의 라벨링 . (A) (상단) C. elegans의 복부 신경줄에있는 6 개의 등쪽 D (DD1-DD6) 뉴런. (하단) 성인의 경우 복부로 향하는 DD 척추(화살촉)가 복부 A(VA) 및 복부 B(VB) 운동 뉴런(자홍색)의 시냅스 전 말단에 접촉하고 DD 교합은 등쪽 신경줄까지 확장되어 신체 근육(화살표)에 GABA 성 출력을 제공합니다18. 이 그림은 참고자료2에서 수정되었습니다. (B) 젊은 성인 벌레에서 세포질 mCherry, 미리스토일화된 mRuby(MYR::mRuby), LifeAct::GFP 및 GFP::Utrophin으로 표지된 DD 척추의 형광 현미경 사진(Airyscan). 회색 화살촉은 등뼈를 가리 킵니다. 스케일 바 = 2 μm. (C) 세포질 mCherry (3.77 ± 0.9), MYR::mRuby (3.09 ± 0.8), LifeAct::GFP (3.44 ± 1.1) 또는 GFP::Utrophin (2.41 ± 0.8)으로 표지된 DD 뉴런 수지상 가시의 밀도(가시/10 μm). 모든 샘플은 정규 분포를 따릅니다. 단방향 분산 분석은 세포질 mCherry, MYR::mRuby 및 LifeAct::GFP의 척추 밀도가 유의하게 다르지 않은 반면(NS) GFP::Utrophin 대 세포질 표지 mCherry (p = 0.0016) 및 LifeAct :: GFP (p = 0.0082). 빨간색 점선은 3D EM 재구성(4.2 spines/10 μm)에서 평가된 DD 뉴런의 척추 밀도를 나타냅니다. 이 그림은 참고자료2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: DD 수지상 가시 이미징. (A) (상단) 척추 모양의 개략도. (하단) LifeAct::GFP(녹색)로 표시된 각 유형의 척추(스케일 바 = 500nm)의 Airyscan 이미지와 고압 냉동 성인의 연속 전자 현미경 사진(파란색)에 의한 3D 재구성. (B) LifeAct::GFP로 시각화된 유형별 척추 빈도: 얇은/버섯(55.5 ± 14.5%), 필로포디알(10.3 ± 8.70%), 뭉툭한(18.8 ± 10.7%), 가지(15.42 ± 6.01%). MYR::mRuby로 시각화된 유형별 가시 빈도: 얇은/버섯(52.2 ± 16.5%), 필로포디알(5.68 ± 7.0%), 뭉툭한(33.1 ± 14.8%), 가지(9.02 ± 9.6%). 짝을 이루지 않은 T- 검정, 필로 포 디알 (p = 0.0339); MYR::mRuby 마커로 표시된 뭉툭한(p = 0.0009) 및 분기된(p = 0.011) 가시는 LifeAct::GFP와 크게 다릅니다. 이 그림은 참고자료2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: DD 가시의 고해상도 이미지를 획득하기 위한 전략. (A-B) (상단) (A) Airyscan 검출기 및 (B) 나이퀴스트 획득에 의해 세포질 마커(mCherry)로 표지된 DD1 수상돌기의 형광 이미지. (하단) DD 수상 돌기 (빨간색)는 이미지 분석 소프트웨어 (필라멘트 트레이서의 자동 경로 옵션)로 묘사되고 DD 가시 (파란색)는 반자동 가시 감지 모듈을 사용하여 그래픽으로 표시됩니다. 화살표는 C와 D로 확대 된 분기 척추를 가리 킵니다. 화살촉은 C와 D로 확대 된 인접한 얇은 / 버섯 가시를 나타냅니다. 스케일 바 = 2 μm. (C-D) (C) Airyscan 검출기 또는 (D) Nyquist 획득으로 얻은 (상단) 분기 척추 (화살표) 및 (하단) 인접한 두 개의 얇은 / 버섯 가시 (화살촉)의 확대 된 예. 스케일 바 = 500nm. 2에서 재현된 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: DD 스파인의 기능 평가. (A) DD 운동 뉴런은 Ca++ 지시자 GCaMP6s(녹색)를 발현하고, VA 운동 뉴런은 채널로돕신 변종인 크림슨(자홍색)7을 발현합니다. (B) Ca++ 측정을 위한 웜 장착 방법을 개략적으로 묘사합니다. (1) 깨끗한 현미경 슬라이드에 (2) 0.05μm 폴리 비드 2μL를 놓고 (3) 백금 와이어("웜 픽")를 사용하여 작은 슈퍼 접착제 덩어리를 추가하고 (4) 용액에 소용돌이치며 필라멘트 접착제 가닥을 생성합니다. (5) M9 버퍼 3μL를 첨가한다. (6) 약 10 개의 L4 유충을 용액에 넣고 (7) 커버 슬립을 바르고 바셀린 / 왁스로 가장자리를 밀봉합니다. (씨디) VA 뉴런의 활성화는 DD1 스파인에서 Ca++ 과도 현상과 상관관계가 있습니다. 크림슨의 주기적인 광 활성화(2.5초 간격)로 이미징된 GCaMP6s 형광(0.5초 간격)은 (C) +ATR(n = 12)이지만 (D) 컨트롤(-ATR, n = 12)에서는 그렇지 않은 Ca++ 과도 현상을 유발합니다. 패널은 561nm 광의 펄스 전후의 시간 경과에 따른 스냅샷(세로 분홍색 선)입니다. 스케일 바 = 2 μm. GCaMP6s 신호는 각 척추의 끝에 있는 ROI(관심 영역)에서 수집됩니다. (E) +ATR(녹색) 대 -ATR(대조군, 회색)에 대해 플롯된 10초 기록 기간 동안의 GCaMP6s 형광(n = 12개 비디오). 수직 분홍색 막대는 561nm 조명(예: 크림슨 활성화)을 나타냅니다. 각 동물은 561 nm 빛으로 4회 자극하였다. 측정은 561 nm 광의 각 펄스 전후에 수집되었다. (F) 561 nm 광의 각 펄스 전후의 GCaMP6s 형광 플롯. GCaMP6s 형광은 561 nm 광의 각 펄스 후 1초 후에 측정되었다. 샘플이 정규 분포를 따르지 않기 때문에 GCaMP6s 형광의 다중 비교를 수정하기 위해 쌍을 이루는 비모수 프리드먼 검정을 적용했습니다. ATR (+ATR, 녹색) (*** p = 0.0004, n = 48 측정) 또는 ATR (-ATR, 회색)이없는 경우 (NS, 중요하지 않음, p = 0.0962, n = 48 측정)로 성장한 웜에 대한 561nm 광 자극 후. 이 그림은 참고자료2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 연구에 사용된 플라스미드 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2 : M9 완충액의 조성 및 제조. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 이해 상충을 선언하지 않습니다.