이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

6.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

2021년 6월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

이 논문에서

요약

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

초록

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타내며 현재 불치입니다. 이 질병은 그 근본적인 기계장치가 해명될 남아 있는 신경 발달 결함을 일으키는 원인이 됩니다. 주요 장애물은 환자에서 볼 수있는 초기 발병 신경 장애를 재구성 하는 효과적인 모델의 부족. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 기술의 발전은 신경계의 발달 및 조직에 대한 질병의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있는 3차원(3D) 뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다. 연구원은, 이 저자를 포함하여, 최근에 미토콘드리아 무질서를 모형하기 위하여 인간 적인 두뇌 오르가노이드를 소개했습니다. 이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 견고한 생성과 미토콘드리아 생물 학적 프로파일링 및 이미징 분석에서의 사용에 대한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 실험은 신진 대사 및 발달 기능 장애를 조사하기 위하여 두뇌 organoids의 사용을 허용할 것입니다 미토콘드리아 질병의 신경 병리를 해부하기 위하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

서론

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타냅니다1. 그(것)들은 산화 인산화 (OXPHOS)2, 호흡 사슬 조립, 미토콘드리아 역학 및 미토콘드리아 DNA 전사 또는 복제를 포함하여 다른 미토콘드리아 프로세스를 방해하는 유전 돌연변이에 기인합니다 3. 에너지 요구 사항이있는 조직은 특히 미토콘드리아 기능 장애4에 의해 영향을받습니다. 따라서 미토콘드리아 질환을 가진 환자는 일반적으로 조기 발병 신경 학적 증상을 개발합니다.

미토콘드리아 질환에 걸린 어린이에게는 현재 치료법이 없습니다5. 미토콘드리아 질환의 약물 개발을 위한 주요 장애물은 인간 질병 과정을 재구성하는 효과적인 모형의 부족입니다6. 현재 연구된 동물 모델 중 일부는 환자에서 존재하는 신경학적 결함을 나타내지 않는다7. 따라서 미토콘드리아 질환의 신경 병리학의 기본 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.

최근 연구는 미토콘드리아 질환에 의해 영향을 받는 환자에서 iPSC를 생성 하 고 환자 특정 신경 세포를 얻기 위해 이러한 세포를 사용. 예를 들어, 미토콘드리아 질환, 리 증후군과 관련된 유전적 결함은 세포 생체 에너지8,9, 단백질 합성10 및 칼슘 항상성9,11에서 수차를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이 보고는 미토콘드리아 질병에서 생기는 신경 손상에 중요한 기계론단서를 제공했습니다, 이 불치병을 위한 약 발견을 위한 도로를 포장12.

그러나 2차원(2D) 문화는 3D 기관의 건축복잡성및 지역조직에 대한 조사를 가능하게 하지 않는다13. 이를 위해 환자별 iPSCs14 에서 추출한 3D 뇌 오르가노이드를 사용하면 연구원이 추가적인 중요한 정보를 얻을 수 있으며 이로 인해 미토콘드리아 질환이 신경계의 개발 및 기능에 미치는 영향을 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다15. 미토콘드리아 질환을 조사하기 위해 iPSC 유래 뇌 오르가노이드를 사용하는 연구는 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 밝히기 시작했다.

미토콘드리아 질환, 미토콘드리아 뇌병증, 젖산증 및 뇌졸중과 같은 에피소드 증후군(MELAS)과 관련된 돌연변이를 운반하는 척수 오르가노이드는 결함이 있는 신경 발생 및 지연된 운동 뉴런 분화를 보였다16. 미토콘드리아 질환, 리 증후군 환자에서 유래한 피질 오르간노이드는 크기 감소, 신경 상피 싹 생성의 결함 및 피질 아키텍처의 손실을 보였다17. 리 증후군 환자에서 뇌 오르가노이드는 질병 결함이 미토콘드리아 대사에 투입 할 수없는 신경 전구 세포의 수준에서 시작 것으로 나타났다, 비정상적인 신경 분지 및 형태 발생을 일으키는 18. 따라서, 신경 전조자는 미토콘드리아 질환에 대한 세포 치료 표적을 나타낼 수 있으며, 미토콘드리아 기능을 촉진하는 전략은 신경계의 기능적 발달을 지원할 수 있다.

뇌 오르가노이드의 사용은 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미토콘드리아 질환은 주로 조기 발병 신경 변성5로 간주됩니다. 그러나, 신경 발달 결점은 또한 발달 지연 및 인지 장애를 포함하여 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 환자에서 존재합니다19. 환자 별 뇌 오르가노이드는 이러한 측면을 해결하고 미토콘드리아 질환이 인간의 뇌 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 설명합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 또한 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 헌팅턴병4와 같은 다른 일반적인 신경 질환에서 병역적 역할을 할 수 있습니다. 따라서 뇌 오르가노이드를 사용하여 신경 발달에 미토콘드리아 결함의 영향을 해명하는 것도 이러한 질병의 연구에 도움이 될 수 있습니다. 이 논문은 미토콘드리아 질환의 질병 모델링을 수행하는 데 사용할 수있는 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

참고: 인간 ipC를 사용하려면 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 iPSC는 지역 윤리 승인(#2019-681)에 따라 건강한 대조군 개인에게서 파생되었습니다. 모든 세포 배양 절차는 멸균 세포 배양 후드하에서 수행되어야하며, 후드 아래에 옮기기 전에 모든 시약과 소모품을 신중하게 소독해야합니다. 분화에 사용되는 인간 iPSC는 광범위한 문화권에서 발생할 수 있는 잠재적인 게놈 수차를 피하기 위해 50 이하의 통로 번호를 가져야 합니다. 세포의 다능성 상태는 예를 들어 NANOG 또는 OCT4와 같은 자발성 관련 마커의 발현을 모니터링함으로써 오르가노이드 생성 전에 검증되어야 한다. 마이코플라즈마 테스트는 마이코플라즈마 없는 배양을 보장하기 위해 매주 실시되어야 합니다.

1. 뇌 오르가노이드의 세대

  1. 인간 iPSC의 문화
    1. iPSC 배지에서 피더없는 조건하에서 배양 인간 iPSCs ( 재료의 표 참조) 코팅 된 6 웰 플레이트에 및 37 ° C 및 5 % CO2에서 가습 된 조직 배양 배양 배양에 보관하십시오.
      참고: 피더 세포의 이월은 오르가노이드 분화를 방해할 수 있습니다. 피더가 없는 조건에서 적어도 한 번 은 세포를 통과합니다.
    2. 1:4에서 1:12에 이르는 비율로 효소가 없는 분리 배지를 사용하여 iPSC를 80%의 합류로 통과시한다. 세포 생존을 증가시키기 위해 각 분할 후 10 μM Rho 관련 단백질 키나아제(ROCK) 억제제(Y27632)를 추가합니다.
  2. iPSC(80% 수렴)-일 0을 해리합니다.
    1. 피질 분화 매체 I(CDMI) (표 1)를 준비합니다. 세포에 첨가하기 전에 실온(22-25°C)에서 CDMI 배지를 예동한다.
    2. 인산염 완충식식염수(PBS)로 iPSC를 함유한 우물을 세척하여 죽은 세포와 이물질을 제거합니다.
    3. 각 웰에 500 μL을 추가하고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오. 현미경으로 확인하여 세포 분리를 보장하십시오.
    4. iPSC 배지 1mL을 추가하여 시약 A를 희석하여 활동을 중화시합니다.
    5. 1000 μL 파이펫을 사용하여 세포를 위아래로 피펫하여 분리하고 셀 서스펜션을 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
    6. iPSC를 실온(22-25°C)에서 5분 동안 125 x g 로 부드럽게 원심분리합니다.
    7. 조심스럽게 셀 펠릿을 방해하지 않도록 슈퍼 나탄을 흡인.
    8. 단일 셀 현탁액을 얻기 위해 CDMI의 1 mL로 펠릿을 다시 중단하고 셀 수를 계산합니다.
    9. CDMI의 100 μL당 9,000iPSC, 20μM WNT-카테닌 억제제(IWR1), 5 μM SB431542로 시딩 배지를 준비한다.
    10. 잘 100 μL의 파종 매체를 96웰 V-하단 플레이트에 넣습니다.
    11. 플레이트를 가습 조직 배양 배양에 37°C 및 5% CO2로 유지하십시오.
  3. 신경권 생성
    1. 1일째에는 정의된 매끄러운 테두리가 있는 둥근 세포 응집체(신경구)가 형성되고 있음을 관찰한다. 골재 주위의 죽은 세포를 기록합니다. 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서 배양을 계속합니다.
    2. 셋째 날에는 양면을 세 번 눌러 죽은 세포를 분리하여 접시를 교반합니다.
    3. 20 μM ROCK 억제제, 3 μM IWR1, 5 μM SB431542로 보충된 CDMI 100 μL을 각 웰에 추가합니다.
    4. 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
    5. 6일째에는 각 우물에서 상류 매체의 80 μL을 조심스럽게 제거하십시오. 우물의 바닥을 만지지 마십시오.
    6. 각 웰에 3 μM IWR1 및 5 μM SB431542로 보충된 CDMI 100 μL을 추가합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
    7. 18일까지 3일마다 5단계와 6단계를 반복합니다.
  4. 신경구의 전송
    1. 18일, 피질 분화 매체 II(CDMII)(표 1)를 준비하고 100mm 초저 부착 세포 배양판에 10mL를 추가한다.
    2. 팁이 잘린 200 μL 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 100mm 초저 부착 세포 배양 판으로 둥근 신경구를 전달합니다.
      참고: 팁의 개구가 충분히 넓고 골재가 너무 빨리 흡인되지 않도록 하여 신경구를 손상시키지 않도록 부드럽게 하십시오.
    3. 신경구를 포함하는 접시에서 5 mL의 매체를 제거하고 신선한 CDMII의 5 mL를 추가합니다.
      참고: 이 절차는 신경구의 전송에서 이월할 수 있는 CDMI 매체의 양을 감소시키는 것을 돕습니다.
    4. 37°C 및 5% CO2에서 가습조직 배양 배양기 내부에 70rpm에 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.
      참고: 다음 날 신경구를 육안으로 검사합니다. 신경구가 함께 뭉치거나 플레이트 바닥에 부착되어 있는 경우 궤도 셰이커의 속도를 늘립니다.
    5. 3일마다 슈퍼내트 매체를 조심스럽게 흡인하고 신선한 CDMII로 교체하십시오. 신경구가 건조되는 것을 방지하기 위해 소량의 배지를 둡니다.
    6. 35일째에, 피질 분화 매체 III(CDMIII)를 준비한다(표 1).
      참고: 매트릭스 구성 요소는 콜드 CDMIII에 용해되어야 합니다.
    7. 플레이트에서 배지를 흡인하고 차가운 CDMIII 10mL를 추가합니다.
      참고: 매트릭스 성분이 덩어리를 형성하지 않고 오르가노이드를 코팅할 수 있도록 차가운 매체를 사용하는 것이 더 효과적입니다.
    8. 배지를 변경한 후, 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 가습조직 배양 배양기 내부에 70rpm에 궤도 셰이커에 다시 놓는다.
    9. 매체의 색상에 따라 성장 속도에 따라 3-5일마다 배지를 변경합니다.
    10. 70일째에, 피질 분화 매체 IV(CDMIV)를 준비한다(표 1). 원하는 오르가노이드 에 도달할 때까지 CDMIV 배지를 사용합니다. 이 기간 동안, 가습조직 배양 배양(37°C 및 5% CO2) 내부에 70rpm에 설정된 궤도 셰이커에 플레이트를 보관한다.
    11. 성장률에 따라 3-5일마다 배지를 변경합니다.

2. 뇌 오르가노이드의 면역 염색

  1. 조직 준비
    1. 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비하고 안전 후드 아래에 놓습니다.
      참고: PFA를 취급할 때 개인 안전 장비를 착용하십시오.
    2. 뇌 오르가노이드를 수집하고 부드럽게 PFA로 채워진 6 웰 플레이트에 무딘 팁 3 mL 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 전송합니다.
      참고: 세포 복잡성이 높은 구조물의 시각화를 허용하기 위해 40일 이상 된 오르가노이드를 사용합니다.
    3. 실온에서 1시간 동안 PFA 용액에 오르가노이드를 보관하십시오.
    4. 3mL 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 PFA를 조심스럽게 제거하고 PBS를 사용하여 고정 된 오르가노이드를 세 번 세척하십시오.
    5. 고정 된 오르가노이드를 PBS에 4 °C에서 저장하여 추가 사용까지 보관하십시오.
  2. 뇌 오르가노이드 슬라이스 준비
    1. 3% 한천 용액을 준비하고 액화 될 때까지 천천히 가열합니다.
    2. 흡수성 필터 용지(매끄러운 측면 업)에 금형(10mL 주사기의 절단 단부)을 놓습니다. 한방울을 위에 놓습니다.
    3. 주걱으로 6웰 플레이트에서 단일 오르간로이드를 신속하게 꺼내 필터 용지로 과도한 PBS를 제거합니다.
      참고: 필터 용지로 오가노이드를 직접 만지지 않도록 주의하십시오.
    4. 오가노이드를 한천 방울에 놓습니다.
    5. 최대 3개의 오르가노이드로 이 절차를 반복하십시오.
      참고: 이 단계에서 한천의 응고를 피하기 위해 빠르게 작업합니다.
    6. 모든 오르가노이드가 완전히 덮일 때까지 금형을 한천으로 리필하십시오.
    7. 한천이 고화되기 시작할 때까지 기다린 다음 흡수성 필터 용지를 포함한 오르가노이드를 포함하는 전체 금형을 냉각 요소로 부드럽게 옮긴다.
      참고: 냉각 요소를 사용할 수 없는 경우 4°C의 냉장고에 오르가노이드를 몇 분 간 보관하십시오.
    8. 한편, 슬라이싱 절차를 준비하십시오 : 면도날 (아세톤으로 세척하고 이중 증류수로 세척)을 진동의 홀더에 넣고 욕조에 장착하고 PBS로 채웁니다.
    9. (고화된) 한천에서 금형을 제거하고 메스를 사용하여 큐브를 구성합니다.
    10. 접착제 젤( 재료표 참조)과 함께 진동의 캐리어 플레이트에 오르가노이드를 함유한 천큐브를 부착하고 PBS를 함유한 욕조에 넣습니다.
    11. 진동을 조정합니다( 재료표 참조)를 150 μm 두께로 슬라이스를 잘라냅니다.
      참고: 진동 설정(적절한 각도, 진폭, 빈도 및 블레이드의 속도)은 초기 산후 동물에서 파생된 고정 뇌 조직을 슬라이스하는 데 사용되는 것과 유사할 수 있습니다. 그러나 이상적인 설정은 진동의 유형에 크게 의존하며 절단 하는 동안 조직의 왜곡 또는 심지어 리핑을 방지 하기 위해 첫 번째 단계에서 결정 되어야 합니다.
    12. 절단 절차를 시작합니다. 유리 파이펫 이나 주걱을 사용하여 부드럽게 PBS로 채워진 24 웰 플레이트에 갓 잘라 각 조각을 전송합니다.
    13. 추가 처리될 때까지 슬라이스가 포함된 플레이트를 4°C(최대 며칠 동안)에 보관합니다.
    14. 유리 파이펫또는 주걱으로 접시밖으로 슬라이스를 현미경 슬라이드로 옮기십시오. 슬라이드당 최소 2슬라이스를 사용하십시오.
    15. 주사기로 한천과 초과 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
    16. 슬라이스가 슬라이드를 부착할 때까지 건조시키도록 합니다.
      참고: 현미경 슬라이드는 4°C에서 PBS로 채워진 플라스틱 챔버에 보관할 수 있지만 슬라이스 시술 후 가능한 한 빨리 염색해야 합니다.
  3. 면역히스토케미칼 염색
    1. 차단 용액을 준비합니다(표 1).
    2. PAP 펜을 사용하여 슬라이드의 슬라이스 주위에 소수성 테두리를 그려 슬라이드에 있는 모든 솔루션을 유지합니다.
    3. 조심스럽게 슬라이드에 차단 용액을 추가하고 실온 (22-25 ° C)에서 1 h에 대한 배양. 조직을 파괴하지 않으려면 조각 위에 직접 용액을 추가하지 마십시오.
    4. 차단 용액을 흡인시키고 차단 용액에서 희석된 원하는 1차 항체를 적용한다.
    5. 4°C에서 가습 챔버에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
    6. 슬라이드를 1x PBS로 3회 헹구고 각각 10분 동안 헹구십시오.
    7. 차단 용액에서 희석된 특정 이차 항체로 슬라이스를 배양하고 어두운 실내 온도에서 1시간 동안 Hoechst 염색(1:2,500)을 수행한다.
      참고: 비특이적 결합이나 자동 형광이 없는지 확인하기 위해 음의 컨트롤을 수행해야 합니다.
    8. 어둠 속에서 각각 10 분 동안 1 x PBS로 세 번 헹구습니다.
    9. 슬라이스에 장착 매체 한 방울을 추가하고, 드롭 가장자리에 커버슬립을 놓고, 기포를 피하기 위해 덮개슬립을 슬라이스쪽으로 천천히 놓습니다.
    10. 슬라이드가 실온에서 하룻밤 동안 쉬도록 합니다. 커버슬립 테두리에 매니큐어를 적용하여 슬라이드를 더 밀봉합니다. 장기 보관을 위해 4°C에 보관하십시오.
  4. 염색 서류
    1. 스티치에 대 한 큰 이미지를 스캔 하려면, (자세한 내용은 재료의 표 참조) 장착 된 전동 수직 넓은 필드 현미경을 활용 하 고 품질 목표; DAPI 필터 세트(예: 여기): 340-380 nm, 이색 거울(DM): 400 nm, 배리어 필터(BA): 435-485 nm); 형광제 이소토오카네이트 필터 세트 (예를 들어, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 필터 세트(예: ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); 디지털 카메라; 자동화된 스티치 및 스택 작업을 허용하는 고성능 획득 소프트웨어.
    2. 이미지 처리의 경우 8비트 티프 파일 생성, 스티치 자르기, 콘트라스트 및 밝기 조정, 채널 병합(예: 파란색, 녹색 및 빨간색)을 생성하고 스케일 바를 추가할 수 있는 이미지 처리 프로그램을 사용합니다.
    3. 세부 사항을 스캔하려면 고품질 의 목표, UV 레이저 (EX : 408 nm), 아르곤 레이저 (EX : 488 nm), 헬륨 - 네온 레이저 (EX : 543), 공초점 현미경을위한 이미징 소프트웨어를 갖춘 전동 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다.
    4. 세부 정보 의 이미지 처리에 대 한, 공초점 z 스택의 최대 강도 프로젝션을 생성 할 수 있는 이미지 처리 프로그램을 사용 하 여 (예를 들어, 0.6 μm각 광학 섹션), 8 비트 tif 파일을 생성, 콘트라스트 및 밝기를 조정, 채널을 병합 (예를 들어, 파란색, 녹색, 빨간색), 스케일 바를 추가.
    5. 그래픽 편집기를 사용하여 수치를 정렬합니다.

3. 뇌 오르가노이드의 생물학적 프로파일링

  1. 생체 에너지 프로파일링을 위한 오르가노이드 준비
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 papain 및 DNase 솔루션을 준비합니다.
    2. 3-5 개의 오르가노이드를 6 웰 플레이트로 옮기습니다. 미리 따뜻해진 PBS로 두 번 씻으시다.
    3. DNase를 포함하는 미리 따뜻해지는 활성화된 파아플 용액 2mL를 추가합니다. 칼날을 사용하여 오르가노이드를 작은 조각으로 자른다.
    4. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 27rpm에 설정된 궤도 셰이커에 놓고 15-20분 동안 배양한다.
      참고: 인큐베이션 시간은 오르가노이드 단계에 따라 다릅니다. 초기 단계 오르가노이드는 있는 것처럼 사용할 수 있습니다. 3개월 이상 인가노이드의 경우, 37°C에서 15-20분 동안 27rpm에서 27rpm에 설정된 흔들 속도로 조각을 절단하기 전에 오르가노이드를 2-3개로 자르고 배양하는 것이 좋습니다. 이 절차는 후기 단계 오르가노이드에 존재할 지도 모르다 괴사 조직을 제거하는 것을 도울 수 있습니다.
    5. 소화된 조직을 15mL 튜브로 수집하고 5mL의 오르가노이드 배양 배지 CDMIV(표 1)를 추가한다.
    6. 10-15회 위아래로 피펫을 하여 10mL 플라스틱 파이펫으로 조직을 트리투레이합니다. 불굴의 조직이 튜브 의 바닥에 정착하게하십시오.
    7. 조심스럽게 15 mL 튜브에 세포 현탁액을 전송, 비소 조직의 조각을 피하기. 40 μm 세포 스트레이너(예: 셀 스트레이너 캡이 있는 폴리스티렌 라운드 하단 튜브)를 통해 용액을 필터링합니다.
    8. 실온에서 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리하여 세포를 펠렛하십시오.
    9. 트라이판 블루를 사용하여 셀 수와 품질을 평가합니다.
    10. 96웰 마이크로 플레이트에 셀의 원하는 번호(~20,000/well)를 플레이트. 신경 매체로 도금 후 중간 6-8 h를 변경합니다(표 1).
    11. 4일 동안 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 코팅된 96웰 마이크로플레이트를 배양한다.
  2. 바이오 에너지 프로파일링
    1. 해리된 세포를 재현한 후 3일째에 96웰 마이크로플레이트의 하단 부분에 200μL의 교정 용액을 추가하고 상단 녹색 센서 카트리지를 수화 마이크로 플레이트에 놓습니다.
      참고: 센서 카트리지를 마이크로 플레이트 위에 올바른 방향으로 배치하고 교정판 솔루션이 모든 센서를 커버하도록 합니다.
    2. 하룻밤 사이에 37°C에서 비 CO2 인큐베이터에서 수화 된 96 웰 마이크로 플레이트를 배양합니다.
    3. 분석기를 켜서 악기가 하룻밤 사이에 37°C에서 안정화되도록 합니다.
    4. 4일째에, 현미경의 밑에 96 웰 마이크로 플레이트에 분리된 오르간배양을 검사하여 세포가 컨서적 단층으로 나타나는지 확인합니다.
    5. 분석 매체를 준비합니다(표 1).
    6. 세포 손상을 방지하기 위해 우물의 바닥을 만지지 않고 파이펫으로 모든 우물에서 신경 매체를 제거합니다. 또는 접시 전체를 조심스럽게 반전한 다음 깨끗한 종이에 말리십시오. 세포 사멸을 피하기 위해 신속하게 작업하십시오.
    7. 아세이 매체의 200 μL로 셀을 두 번 씻으시다. 분석 매체를 음180 μL의 최종 부피에 추가합니다. 1h에 대한 37°C에서 비 CO2 인큐베이터에서 96웰 마이크로 플레이트를 배양한다.
    8. 분석 매체에서 미토콘드리아 억제제 10 μM 솔루션을 준비합니다. 주입 후 최종 농도는 1 μM입니다.
    9. 미토콘드리아 억제제의 10배 솔루션으로 수화 마이크로플레이트에 배치된 센서 카트리지를 적재합니다.
      1. 미토콘드리아 억제제 18μL을 포트 A에 넣습니다.
      2. 19.8 μL의 미토콘드리아 억제제 2를 포트 B에 넣습니다.
      3. 항만 C에 미토콘드리아 억제제 2의 21.6 μL을 추가합니다.
      4. 포트 D에 미토콘드리아 억제제 3의 23.4 μL을 추가합니다.
    10. 적재된 카트리지를 분석이 시작될 때까지 37°C의 비 CO2 인큐베이터에 하중 카트리지를 놓습니다.
    11. 계측기 소프트웨어(표 2)에서 실행 중인 프로토콜을 설정합니다.
    12. 시작을 누릅니다. 비 CO2 인큐베이터에서 로드된 카트리지를 사용하여 교정을 위해 분석기로 배치합니다.
      참고: 플레이트가 올바른 방향에 뚜껑이 없는지 확인합니다.
    13. 교정 단계가 끝나면 교정 플레이트를 제거합니다. 비 CO2 인큐베이터에서 96웰 마이크로 플레이트를 가져 와서 분석기로 넣습니다. 계속 클릭하여 측정을 시작합니다.
    14. 실행이 완료되면, 분석기에서 96 웰 세포 배양 마이크로 플레이트를 제거하고 세포를 방해하지 않고 모든 우물에서 배지를 수집합니다.
      참고: 배지는 -20°C에 저장될 수 있으며, 적절한 젖산 분석 키트를 사용하여 배지내의 세포에 의해 방출되는 젖산의 양을 측정하기 위해 나중에 사용할 수 있다.
    15. 각 우물에 1x PBS의 200 μL로 세포를 씻으시다.
    16. PBS를 제거한 후 플레이트를 -20°C로 동결합니다.
      참고: 냉동 플레이트는 마이크로 플레이트의 각 우물에서 세포, 단백질 또는 DNA를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 정량화는 얻어진 생체 에너지 비율을 정상화하기 위해 필요합니다. 세포, 단백질 또는 DNA 정량화 에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

여기에 설명된 프로토콜은 둥근 오르가노이드의 견고한 생성을 용이하게 한다 (그림 1A). 생성된 오르가노이드는 축산(SMI312) 및 원원수(microtubule-관련 단백질 2(MAP2)에 특이적인 단백질 마커를 사용하여 시각화될 수 있는 성숙한 뉴런 (도 1B)을 함유하고 있다. 성숙한 오르가노이드는 뉴런 세포(MAP2 양성) 뿐만 아니라 신경세포(예를 들어, 성상세포 마커 S100칼슘 결합 단백질 B(S100ß)에 대한 양성) 을 함유하고 있다(도 1B).

공초점 현미경을 사용하여 슬라이스 된 뇌 오르가노이드를 분석함으로써, 상이한 세포 유형 및 세포 구조의 상세한 분포 및 조직을 식별하고 모니터...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 재현 가능한 생성과 미토콘드리아 질환 모델링에 대한 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 이전에 게시된 work20에 따라 수정됩니다. 본 프로토콜의 한 가지 주요 장점은 각 오르가노이드의 수동 포함을 비계 매트릭스에 포함시키지 않는다는 것입니다. 실제로, 매트릭스 용액은 단순히 세포 배양 배지에 용해된다. 더욱이, 고가의 생물반응기를 채용할 필요가 없으며, 오르가노이드는 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 배치된 표준 조직 배양 6웰 플레이트에서 배양될 수 있기 때문이다. 이 절차는 또한 다양한 개별 라인에서 파생된 다른 오르가노이드를 함유하는 여러 플레이트의 병렬 재배를 가능하게 하여 실험의 처리량을 증가시키고 다른 오르가노이드의 성장 프로필에서 나타나는 잠재적 차이의 모니터링을 가능하게 한다. 우리는 일관된 결과로, 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 건강한 통제 및 개별에서 파생된 다른 iPSCs를 사용하여 이 프로토콜을 시험...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁 금융 또는 비 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

기술 지원을 위해 미리암 뷔닝에게 감사드립니다. 우리는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)(PR1527/5-1 ~A.P.), 스파크 및 베를린 보건연구소(BIH)(BIH 유효성 검사 기금 A.P.), 유나이티드 미의 지원을 인정합니다. 토콘드리아 질병 재단 (UMDF) (A.P.에 리 증후군 국제 컨소시엄 보조금), 대학 병원 뒤셀도르프 (Forschungskommission UKD 에 A.P.), 독일 연방 교육 및 연구부 (BMBF) (e: 바이오 젊은 조사관은 A.P.에 AZ 031L0211을 부여합니다. C.R.R.의 실험실에서 의 작업은 DFG에 의해 지원되었다 (FOR 2795 "스트레스아래 시냅스", Ro 2327/13-1).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올Gibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) Ltd레이아웃 소프트웨어; 벡터 그래픽 편집기
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 기니피Sigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스Thermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
아르곤 레이저Melles Griot레이저, 예를 들어, 다이오드 레이저를 방출하는 488도 괜찮습니다,
너무 Ascorbicacid SigmaA92902
B-27 with Vitamin AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% in PBS, store solution at -20 ° C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star 세포 배양 6 웰 플레이트Greiner-Bio-One657160
화학적으로 정의 된 지질 농축11905031
컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경 C1Nikon Microscope Solutions모듈 식 컨 포칼 현미경
시스템 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저막 매트릭스, 페놀 무적색, LDEV 무함유Corning356231매트릭스 구성 요소
CyQUANT 세포 증식 분석 키트Thermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
당나귀 안티 염소 Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
당나귀 안티 마우스 Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
당나귀 안티 토끼 Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc 카메라Nikon 현미경 솔루션
Eclipse 90i 직립 광시야 현미경Nikon 현미경 솔루션
Eclipse E 600FN 정립 현미경Nikon 현미경 솔루션
Eclipse Ts2 도립 현미경Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver 버전 3.91Nikon Microscope Solutions컨포칼 현미경용 이미징 소프트웨어
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Fetal Bovine SerumGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
유리 파스퇴르 피펫브랜드747715Inverted
GlutamaxGibco35050-061
헬륨-네온 레이저Melles Griot다른 모든 레이저, 예를 들어 594를 방출하는 다이오드 레이저는 괜찮습니다., 너무
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 인큐베이터Thermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband National Institute of Health이미지 처리 소프트웨어
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
녹아웃 세럼 교체용Gibco10828010
레이저(407nm)Coherent다른 레이저(예: 407을 방출하는 다이오드 레이저)도 괜찮습니다
Map2Synaptic SystemsNo.188004 1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC 중간
멀티퓨지 X3R 원심분리기Thermo Scientific10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonza# LT07-218
N2 SupplementGibco17502-048
일회용 바늘 (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2Nikon이미징 소프트웨어
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EA슬라이드에 소수성 장벽을 그립니다.
Papain 해리 시스템 키트WorthingtonLK003150
ParaformaldehydeMerck818715PBS에서 4%, 저장 용액 -20 ° C
파스퇴르 피펫 7mLVWR612-16813mL까지 졸업
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope Solutions건식 현미경 대물렌즈
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon 현미경 솔루션오일 이멀젼 현미경 대물렌즈
폴리스티렌 페트리 접시 (100mm)Greiner Bio-One664161
폴리스티렌 라운드 바닥 튜브와 셀 스트레이너 캡 (5mL)Falcon352235
염화칼Roth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
정성 여과지VWR516-0813
락 억제제MerckSCM075
로테논시그마83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
메스 블레이드Heinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
중탄산나트륨Merck/Sigma31437-1kg-M
염화나트륨Roth3957
나트륨 인산이 수소Applichem131965
피루브산 나트륨Gibco11360070
SOX2산타 크루즈 생명 공학sc-173201 : 100
StemPro Accutase 세포 해리 시약Gibco / StemProA1110501시약
A 슈퍼 접착제 젤UHU63261접착 젤
SuperFrost PlusVWR631-0108
일회용 주사기(1mL)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Plate 24 WellSarstedt83.3922
TC Plate 6 WellSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
조직 배양 후드ThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo Scientific생산 종료, 다른 조정 가능한 마이크로톰도 괜찮습니다.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonist IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 세포외 플럭스 분석기Seahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Calibrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)Seahorse Bioscience102416-100
그 다른 .륨

참고문헌

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

인간 iPSC오가노이드 생성피질 분화신경구 형성바이오에너지 프로파일링공초점 이미지 촬영산소 소비율미토콘드리아 대사
미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.