우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타내며 현재 불치입니다. 이 질병은 그 근본적인 기계장치가 해명될 남아 있는 신경 발달 결함을 일으키는 원인이 됩니다. 주요 장애물은 환자에서 볼 수있는 초기 발병 신경 장애를 재구성 하는 효과적인 모델의 부족. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 기술의 발전은 신경계의 발달 및 조직에 대한 질병의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있는 3차원(3D) 뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다. 연구원은, 이 저자를 포함하여, 최근에 미토콘드리아 무질서를 모형하기 위하여 인간 적인 두뇌 오르가노이드를 소개했습니다. 이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 견고한 생성과 미토콘드리아 생물 학적 프로파일링 및 이미징 분석에서의 사용에 대한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 실험은 신진 대사 및 발달 기능 장애를 조사하기 위하여 두뇌 organoids의 사용을 허용할 것입니다 미토콘드리아 질병의 신경 병리를 해부하기 위하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.
서론
미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타냅니다1. 그(것)들은 산화 인산화 (OXPHOS)2, 호흡 사슬 조립, 미토콘드리아 역학 및 미토콘드리아 DNA 전사 또는 복제를 포함하여 다른 미토콘드리아 프로세스를 방해하는 유전 돌연변이에 기인합니다 3. 에너지 요구 사항이있는 조직은 특히 미토콘드리아 기능 장애4에 의해 영향을받습니다. 따라서 미토콘드리아 질환을 가진 환자는 일반적으로 조기 발병 신경 학적 증상을 개발합니다.
미토콘드리아 질환에 걸린 어린이에게는 현재 치료법이 없습니다5. 미토콘드리아 질환의 약물 개발을 위한 주요 장애물은 인간 질병 과정을 재구성하는 효과적인 모형의 부족입니다6. 현재 연구된 동물 모델 중 일부는 환자에서 존재하는 신경학적 결함을 나타내지 않는다7. 따라서 미토콘드리아 질환의 신경 병리학의 기본 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.
최....
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프로토콜
참고: 인간 ipC를 사용하려면 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 iPSC는 지역 윤리 승인(#2019-681)에 따라 건강한 대조군 개인에게서 파생되었습니다. 모든 세포 배양 절차는 멸균 세포 배양 후드하에서 수행되어야하며, 후드 아래에 옮기기 전에 모든 시약과 소모품을 신중하게 소독해야합니다. 분화에 사용되는 인간 iPSC는 광범위한 문화권에서 발생할 수 있는 잠재적인 게놈 수차를 피하기 위해 50 이하의 통로 번호를 가져야 합니다. 세포의 다능성 상태는 예를 들어 NANOG 또는 OCT4와 같은 자발성 관련 마커의 발현을 모니터링함으로써 오르가노이드 생성 전에 검증되어야 한다. 마이코플라즈마 테스트는 마이코플라즈마 없는 배양을 보장하기 위해 매주 실시되어야 합니다.
1. 뇌 오르가노이드의 세대
- 인간 iPSC의 문화
- iPSC 배지에서 피더없는 조건하에서 배양 인간 iPSCs ( 재료의 표 참조) 코팅 된 6 웰 플레이트에 및 37 ° C 및 5 % CO2에서 가습 된 조직 배양 배양 배양에 보관하십시오.
참고: 피더 세포의 이월은 오르가노이드 분화를 방해할 수 있습니다. 피더가 없는 조건에서 적어도 한 번 은 세포를 통과합니다.
- iPSC 배지에서 피더없는 조건하에서 배양 인간 iPSCs ( 재료의 표 참조) 코팅 된 6 웰 플레이트에 및 37 ° C 및 5 % CO2에서 가습 된 조직 배양 배양 배양에 보관하십시오.
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결과
여기에 설명된 프로토콜은 둥근 오르가노이드의 견고한 생성을 용이하게 한다 (그림 1A). 생성된 오르가노이드는 축산(SMI312) 및 원원수(microtubule-관련 단백질 2(MAP2)에 특이적인 단백질 마커를 사용하여 시각화될 수 있는 성숙한 뉴런 (도 1B)을 함유하고 있다. 성숙한 오르가노이드는 뉴런 세포(MAP2 양성) 뿐만 아니라 신경세포(예를 들어, 성상세포 마커 S100칼슘 결합 단백질 B(S100ß)에 대한 양성) 을 함유하고 있다(도 1B).
공초점 현미경을 사용하여 슬라이스 된 뇌 오르가노이드를 분석함으로써, 상이한 세포 유형 및 세포 구조의 상세한 분포 및 조직을 식별하고 모니터.......
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토론
이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 재현 가능한 생성과 미토콘드리아 질환 모델링에 대한 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 이전에 게시된 work20에 따라 수정됩니다. 본 프로토콜의 한 가지 주요 장점은 각 오르가노이드의 수동 포함을 비계 매트릭스에 포함시키지 않는다는 것입니다. 실제로, 매트릭스 용액은 단순히 세포 배양 배지에 용해된다. 더욱이, 고가의 생물반응기를 채용할 필요가 없으며, 오르가노이드는 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 배치된 표준 조직 배양 6웰 플레이트에서 배양될 수 있기 때문이다. 이 절차는 또한 다양한 개별 라인에서 파생된 다른 오르가노이드를 함유하는 여러 플레이트의 병렬 재배를 가능하게 하여 실험의 처리량을 증가시키고 다른 오르가노이드의 성장 프로필에서 나타나는 잠재적 차이의 모니터링을 가능하게 한다. 우리는 일관된 결과로, 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 건강한 통제 및 개별에서 파생된 다른 iPSCs를 사용하여 이 프로토콜을 시험.......
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공개 사항
저자는 경쟁 금융 또는 비 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
기술 지원을 위해 미리암 뷔닝에게 감사드립니다. 우리는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)(PR1527/5-1 ~A.P.), 스파크 및 베를린 보건연구소(BIH)(BIH 유효성 검사 기금 A.P.), 유나이티드 미의 지원을 인정합니다. 토콘드리아 질병 재단 (UMDF) (A.P.에 리 증후군 국제 컨소시엄 보조금), 대학 병원 뒤셀도르프 (Forschungskommission UKD 에 A.P.), 독일 연방 교육 및 연구부 (BMBF) (e: 바이오 젊은 조사관은 A.P.에 AZ 031L0211을 부여합니다. C.R.R.의 실험실에서 의 작업은 DFG에 의해 지원되었다 (FOR 2795 "스트레스아래 시냅스", Ro 2327/13-1).
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재료
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참고문헌
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K.
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