방법 논문

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

DOI:

10.3791/62757

⸱

2022년 1월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.

초록

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생체 내 현미경 검사 (IVM)는 단일 세포 분해능에서 세포 이동, 분열 및 사망의 시각화를 가능하게합니다. 외과적으로 삽입된 이미징 윈도우를 통한 IVM은 수일 내지 수주에 걸쳐 동일한 조직의 종방향 관찰을 허용하기 때문에 특히 강력하다. 일반적인 이미징 창은 마우스의 피부에 봉합된 생체적합성 금속 프레임의 유리 커버슬립을 포함한다. 이 창문은 생쥐의 자유로운 움직임을 방해하고 강한 염증 반응을 이끌어 낼 수 있으며 깨진 유리 또는 찢어진 봉합사로 인해 실패 할 수 있으며 그 중 어느 것도 안락사가 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 장기 복부 장기 및 유선 이미징을위한 창문은 이전에 두개골 이미징 창에 사용 된 광학적으로 투명한 실리콘 폴리머 인 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 박막으로 개발되었습니다. 이 창문은 조직에 직접 접착 할 수있어 삽입에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PDMS는 유연하여 시간이 지남에 따라 마우스의 내구성에 기여하며 최대 35 일이 테스트되었습니다. 종방향 영상화는 개별 세션 동안 동일한 조직 영역의 영상화이다. 스테인리스 스틸 그리드가 창문 내에 내장되어 동일한 지역을 현지화하여 며칠 간격으로 동일한 위치에서 동적 프로세스 (예 : 유선의 개입)를 시각화 할 수있었습니다. 이 실리콘 창은 또한 시간이 지남에 따라 미세 전이로 발전하는 단일 전파 암 세포를 모니터링 할 수있었습니다. 이 연구에 사용 된 실리콘 창은 금속 프레임 유리 창보다 삽입하기가 간단하며 이미지 된 조직의 제한된 염증을 일으 킵니다. 또한, 임베디드 그리드는 반복 이미징 세션에서 동일한 조직 영역의 간단한 추적을 허용합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마취 된 동물의 조직 이미징 인 Intravital Microscopy (IVM)는 손상되지 않은 조직에서 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 사건의 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 적용은 매우 다양하지만 IVM은 암 생물학 분야에서 암세포가 조직을 침범하고 전이하는 방법을 밝히고 주변 미세 환경과 상호 작용하며 약물 1,2,3에 반응하는 데 도움이되었습니다. 또한, IVM은 생체외 프로파일링 접근법(예를 들어, 유세포 분석기)에 상보적인 통찰을 제공함으로써 면역 반응을 지배하는 복잡한 메카니즘의 이해를 증진시키는 열쇠가 되었다. 예를 들어, 생체 내 영상 실험은 세포 이동 및 세포 - 세포 접촉과 관련된 면역 기능에 대한 세부 사항을 밝혀 냈으며 부상이나 감염에 대한 반응으로 시공간 역학을 정량화하는 플랫폼을 제공했습니다 4,5,6,7. 이러한 과정의 대부분은 조직 학적 염색을 통해 연구 될 수도 있지만 IVM 만이 동적 변화를 추적 할 수 있습니다. 사실, 조직학적 섹션이 주어진 시간에 조직의 스냅샷을 제공하는 반면, 생체내 영상은 시간이 지남에 따라 동일한 조직 내의 세포간 및 세포내 사건을 추적할 수 있다. 특히, 형광 표지의 진행과 분자 리포터의 개발은 분자 사건이 증식, 사망, 운동성 및 다른 세포 또는 세포외 매트릭스와의 상호 작용과 같은 세포 거동과 상관되도록 허용했다. 대부분의 IVM 기술은 형광 현미경을 기반으로하며, 이는 광 산란으로 인해 더 깊은 조직을 이미징하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 관심있는 조직은 종종 종종 침습적 및 말단 절차로 외과 적으로 노출되어야합니다. 따라서, 기관 부위에 따라, 조직은 몇 내지 40h8에서 변화하는 기간 동안 연속적으로 영상화될 수 있다. 대안적으로, 영구적인 이미징 윈도우의 외과적 삽입은 7,9주까지의 기간에 걸쳐 순차적으로 동일한 조직의 영상화를 허용한다.

새로운 이미징 윈도우의 개발은 인트라바이탈 이미징 접근법(10)을 더욱 개선하기 위한 기술적 필요성으로서 강조되고 있다. 원형 생체내 영상화 창은 봉합사(11)로 피부에 고정된 유리 커버슬립을 포함하는 금속 링이다. 자유로운 움직임에 대한 간섭, 삼출물의 축적 및 유리 커버 슬립의 손상은 이러한 창문을 사용할 때 볼 수있는 일반적인 문제입니다. 또한, 프로토 타입 창은 전문적인 생산이 필요하며 외과 수술은 광범위한 교육이 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 이전에 뇌(12)의 장기 이미징을 위해 두개골 창문에 사용되어온 실리콘 폴리머인 폴리디메틸실록산(PDMS)이 복부 장기 및 유선 영상화에 사용하도록 조정되었다. 여기에서, 동일한 조직 영역의 반복적인 이미징을 위한 랜드마크를 제공하기 위해 스테인리스강 그리드 주위에 윈도우를 캐스팅하는 방법을 포함하는 PDMS 기반 실리콘 윈도우를 생성하기 위한 상세한 방법이 제시된다. 또한, 복부 장기 또는 유선에 창을 삽입하기위한 간단하고 스티치가없는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 현재 사용되는 이미징 창의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 종방향 생체 내 영상의 접근성을 높입니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

설명 된 모든 절차는 콜드 스프링 하버 실험실 외과 지침에 따라 수행되었으며 콜드 스프링 하버 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 실리콘 창 주조

  1. 베이스 엘라스토머와 경화제를 10:1 (v/v) 비율로 혼합하여 실리콘 폴리머(PDMS)를 준비합니다.
  2. 멸균되고 매끄러운 표면에 소량의 PDMS를 증착하여 창을 캐스팅하고 부피 대 면적비를 원하는 두께로 조정한다.
    참고: 24웰 플레이트 뚜껑의 뚜껑에 직경 22mm 원형에 200mg의 폴리머 용액을 사용하면 창의 견고성과 광학 선명도 간에 좋은 절충안이 나타납니다.
  3. 옵션: 동일한 조직 영역의 반복 이미징을 위한 랜드마크를 제공하려면 PDMS가 원하는 주조 표면에 있는 후 실리콘으로 스테인리스 스틸 그리드를 가볍게 누릅니다.
  4. 기포를 제거하려면 코팅된 표면을 진공 데시케이터에 45분 동안 놓고 폴리머를 탈기시킨다.
  5. 실리콘 창문을 80°C의 오븐에서 45분 동안 경화시킨다.
  6. 금형의 가장자리에서 폴리머를 스코어링하고 포셉으로 주조하는 데 사용되는 표면에서 경화 된 창을 부드럽게 벗겨냅니다.
  7. 수술 전에 오토클레이빙으로 창문을 살균하십시오.

2. 실리콘 윈도우의 삽입을 위한 마우스 준비

  1. 4% (v/v) 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하십시오. 마우스를 수술대 위의 온난 패드로 옮기고, 마우스를 마취 코 마스크에 넣고, 수술 내내 유지를 위해 이소플루란 농도를 2%로 낮춘다.
  2. 뒷다리의 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 마우스가 비활성 상태이고 발가락 핀치 반사 반응이 나타나지 않을 때까지 진행하지 마십시오.
  3. 안과 윤활제를 눈에 바르면 건조하지 않고 외상을 예방할 수 있습니다.
  4. 선제 진통 (buprenorphine 0.05 mg / kg)을 피하로 투여하십시오.
  5. 수술 부위를 면도하고 제모 크림으로 머리카락을 완전히 제거하십시오.
  6. 수술 부위 감염을 예방하기 위해 포비돈 요오드 용액 (10 % v / v)과 에탄올 (70 % v / v)을 3 배 연속으로 바르십시오.

3. 간에서 이미징을위한 복부 창 삽입; 다른 복부 장기에 적응 가능 (그림 1)

  1. 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.
  2. 멸균 가위와 포셉을 사용하여 xiphoid 공정에서 3mm 아래로 시작하여 10mm 절개를 만듭니다.
  3. 중간 선을 따라 피부의 1-1.5cm2 부분을 제거하십시오.
  4. 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
  5. 선택 사항: 간장의 더 큰 부분을 시각화하려면 멸균 식염수로 적신 멸균 면봉을 사용하여 횡격막에서 간을 아래로 밀어 내면서 간과 횡격막을 연결하는 팔시폼 인대를 드러냅니다. 열등한 정맥 카바를 자르지 않도록 인대를 절단하십시오.
  6. 31 G 주사기로 수술 용 접착제를 철회하고 이미지 할 부위의 가장자리 주위의 간 표면에 소량을 바르십시오. 이 접착제는 원형 씰을 생성하여 이미징을 위해 중앙 영역을 그대로 유지합니다.
    주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다. 접착제를 적용하기 전에 조직을 건조 할 필요는 없습니다.
    참고: 모든 시아노아크릴레이트 기반 접착제를 이 절차에 성공적으로 사용할 수 있습니다. 외과 용 접착제는 멸균을 보장합니다. 터미널 절차의 경우 다목적 슈퍼 접착제가 좋은 결과를 산출합니다.
  7. 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 간을 단단히 잡으십시오 (~ 2 분).
  8. 복막 아래 창 가장자리를 접습니다.
  9. 주사기를 사용하면 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 복막을 아래로 밀어 창문에 고정시킵니다.
  10. 마찬가지로, 복막에 고정하기 위해 포셉으로 피부를 아래로 밀기 전에 소량의 외과 용 접착제를 복막에 고정하십시오.
    참고 : 올바르게 수행되면 이제 간 조직의 원형 영역이 창을 통해 표시되어야합니다.
  11. 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.
    주의: 멸균 수술 기술을 사용하여 수술을 수행하고 삽입 전에 창문을 멸균 한 경우 수술 용 접착제로 상처를 밀봉하면 감염을 피할 수 있습니다. 그러나 외과 적 삽입 또는 불완전한 폐쇄 중에 적절한 무균 기술을 따르지 않으면 명백한 또는 임상 적 감염으로 이어질 수 있으며 조직이 건조해질 수 있습니다.

4. 간에서 이미징을위한 측면 창 삽입; 문맥 정맥에 암세포의 동시 주입과 호환 (그림 2)

  1. 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
  2. 멸균 가위와 포셉을 사용하여 늑골 아치 아래 3mm 아래 오른쪽 측면에 10mm 절개를하십시오.
  3. 피부의 1cm2 부분을 제거하십시오.
  4. 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
  5. 31 G 주사기로 수술 용 접착제를 철회하고 이미지 할 부위의 가장자리 주위의 간 표면에 소량을 바르십시오.
    주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다.
    참고: 모든 시아노아크릴레이트 기반 접착제를 이 절차에 성공적으로 사용할 수 있습니다. 외과 용 접착제는 멸균을 보장합니다. 터미널 절차의 경우 다목적 슈퍼 접착제가 좋은 결과를 산출합니다.
  6. 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 간을 단단히 잡으십시오 (~ 2 분).
  7. 복막 아래 창 가장자리를 접습니다.
  8. 주사기를 사용하면 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 복막을 아래로 밀어 창문에 고정시킵니다.
  9. 마찬가지로, 복막에 고정하기 위해 포셉으로 피부를 아래로 밀기 전에 소량의 외과 용 접착제를 복막에 고정하십시오.
    참고 : 올바르게 수행되면 이제 간 조직의 원형 영역이 창을 통해 표시되어야합니다.
  10. 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.
  11. 포털 정맥 주입이 필요한 경우:
    1. 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.
    2. 피부의 xiphoid 과정에서 시작하여 10mm 절개를하십시오.
    3. 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막에 10mm 절개를하십시오.
    4. 두 면봉을 멸균 식염수에 담그십시오.
    5. 면봉을 사용하여 멸균 식염수로 적신 멸균 거즈에 내장을 부드럽게 당기고 방향을 비틀거나 뒤틀리지 않도록주의하십시오.
    6. 복부의 오른쪽에 포털 정맥이 보일 때까지 복강에서 장을 옮기십시오.
    7. 31-33 G 바늘 5-7 mm 코달을 문맥 정맥이 간으로 들어가는 지점에 삽입하여 혈관을 통과하지 않고 혈관 내에서 진행되도록하십시오.
    8. 암세포를 천천히 주입한다(100 μL의 멸균 PBS에 재현탁).
      참고: 본 실험을 위해 아뮤린 췌장암 세포주 (예를 들어, KPC-BL/6-1199)는 멸균 PBS 100 μL에 주입된 완전한 DMEM 배지 및 1 x 105 세포에서 배양될 수 있다.
    9. 출혈을 예방하려면 바늘을 뽑은 직후에 1-2 분 동안 작은 수술 스폰지로 주사 부위에 부드러운 압력을 가하십시오.
    10. 압력이 풀리면 지혈을 보장하기 위해 1-2 분 동안 사이트를 모니터링하십시오.
    11. 축축한 면봉을 사용하여 장기의 생리적 방향에 따라 장을 복강으로 되돌립니다.
    12. 멸균 포셉을 사용하여 마우스의 복강 왼쪽에있는 복막 바로 아래에 창을 삽입하십시오.
    13. 4-0 실크 봉합사로 봉합하고 7mm 스테인레스 스틸 상처 클립으로 미드 라인 절개를 스테이플하십시오.
    14. 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치로 이동
    15. 멸균 된 가위와 포셉을 사용하여 피부를 통해 늑골 아치 아래 오른쪽 측면 3mm에 10mm 절개를하십시오.
    16. 절개 주위의 피부 1cm2 부분을 제거하십시오.
    17. 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
    18. 4.8-4.10 단계에 설명된 대로 창을 간 위로 당겨 제자리에 붙이십시오.

5. 췌장에 이미징을 위한 창 삽입(그림 3)

  1. 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
  2. 멸균 가위와 포셉을 사용하여 늑골 아치 아래 3mm 아래 왼쪽 측면에 10mm 절개를 만듭니다.
  3. 절개 주위의 피부 1cm2 부분을 제거하십시오.
  4. 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
  5. 멸균 식염수에 담근 멸균 면봉을 사용하여 비장을 부드럽게 당겨 췌장을 시각화합니다. 축축한 면봉으로 췌장을 재배치하여 절개를 통해 더 많은 표면적을 볼 수 있도록하십시오.
    참고 :이 시점에서 췌장암 세포는 실험 설계의 일부인 경우 췌장에 정형 외과 적으로 주사 될 수 있습니다.
  6. 31 G 주사기로 외과 용 접착제를 철회하고 이미지 할 부위의 가장자리 주위에 췌장 표면에 소량을 바르십시오.
    주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다.
  7. 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 췌장에 단단히 고정하십시오 (~ 2 분).
  8. 복막 아래 창 가장자리를 접습니다.
  9. 주사기를 사용하면 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 복막을 아래로 밀어 창문에 고정시킵니다.
  10. 마찬가지로, 복막에 고정하기 위해 포셉으로 피부를 아래로 밀기 전에 소량의 외과 용 접착제를 복막에 고정하십시오.
    참고 : 올바르게 수행되면 췌장 조직의 원형 영역이 창을 통해 표시되어야합니다.
  11. 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.

6. 유선에 이미징을 위한 창 삽입(그림 4)

  1. 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.
  2. 멸균 가위와 포셉을 사용하여 사타구니 젖꼭지 중 하나에 10mm 절개 내측을 만듭니다.
  3. 유선의 위 피부의 0.5cm2 부분을 제거하십시오.
  4. 두 번째 한 쌍의 멸균 가위를 사용하여 두 표면 사이에 가위를 퍼뜨려 부착을 방해하여 유선을 조심스럽게 피부에서 분리하십시오.
    참고 : 사타구니 유선 영역의 이미징을 용이하게하려면 유선보다 우월하지만 뒷다리보다 우수한 피부 부분을 해부하여 창문이 마우스의 이동성을 제한하지 않도록주의하십시오.
  5. 31 G 주사기로 외과 용 접착제를 철회하고 이미징 할 부위의 가장자리 주위의 유선의 표면에 소량을 바르십시오.
    주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다.
  6. 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 유선에 단단히 고정하십시오 (~ 2 분).
    참고 : 유선 조직의 원형 영역이 올바르게 수행되면 창을 통해 볼 수 있어야합니다.
  7. 창 가장자리를 피부 아래에 접습니다.
  8. 주사기를 사용하면 현재 피부 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 피부를 아래로 밀어 피부를 창문에 고정시킵니다.
  9. 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.

7. 수술 후 회복

  1. 마우스를 충분한 중첩 재료가있는 깨끗한 회복 케이지에 넣고 케이지의 일부가 가열 패드에 놓여 있는지 확인하십시오.
  2. 마우스가 의식이 있고 움직일 때까지 마우스를 지속적으로 모니터링합니다.
  3. 필요한 경우, 선제 투여 후 12 시간 후에 진통제의 추가 복용량을 제공하십시오.
    참고: 추가 진통제는 일반적으로 불필요하지만, 마우스가 고통의 징후(예: 허리 구부러짐, 헐렁한 모피 또는 음식에 대한 관심 상실)가 나타나는 경우 수의사와 상의하십시오. 수술 후 처음 3 일 동안 매일 마우스를 모니터링하여 감염 징후 또는 기타 부작용이 있는지 확인하십시오. 마우스의 2 % 미만은 수의사의 관심이나 안락사가 필요하며, 일반적으로 창문의 부분적인 분리로 인해 발생합니다. 복부 간 영상 창이있는 수컷 마우스의 경우 생쥐 간의 싸움으로 인해 창문이 분리 될 수 있다는 점에 유의해야합니다. 이것은 마우스를 별도로 하우징함으로써 피할 수 있습니다.

8. 창을 통한 이미징

  1. 4% (v/v) 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하십시오.
  2. 안과 윤활제를 눈에 바르면 건조하지 않고 외상을 예방할 수 있습니다.
  3. 마우스를 유도 챔버에서 현미경 단계로 옮깁니다. 마우스를 마취 코 마스크에 넣고 이미징 절차 전반에 걸쳐 유지 마취를 위해 이소플루란 농도를 약 1-1.5 %로 낮 춥니 다.
  4. 압력 패드 센서를 마우스 아래에 놓아 호흡률을 모니터링하고 부드러운 수술 테이프를 사용하여 마우스를 무대에 고정시킵니다.
  5. 직장 온도계를 삽입하여 이미징 세션 전반에 걸쳐 체온을 모니터링하십시오.
  6. 가열된 패드를 켜고 마우스를 면밀히 모니터링하여 체온이 37°C를 초과하지 않도록 합니다.
  7. 소프트웨어를 사용하여 마우스의 호흡 속도를 모니터링하십시오. 최적의 속도는 ~ 1 호흡 / 초입니다. 필요에 따라 마취를 조정하십시오.
  8. 각 이미징 세션 전에 잔여 렌즈 침지 매체 및 이물질로부터 창문을 청소하여 70% 에탄올(v/v)에 담근 면봉으로 부드럽게 닦으십시오.
  9. 침수 렌즈를 사용할 때는 거품을 피하면서 창문에 초음파 젤을 바르십시오.
    참고: 증류수도 사용할 수 있지만 이미징 중에 다시 적용해야 할 수도 있습니다.
  10. 이미징에 대한 최적의 깊이를 찾으려면 먼저 그리드를 찾아 초점을 맞춥니다.
  11. 그리드의 바닥을 0으로 설정하여 대략적인 조직 이미징 깊이를 결정합니다. 이 정보는 후속 이미징 세션에서 대응하는 z 평면을 찾는 데 필요하다.
  12. 여러 이미징 세션에서 동일한 위치를 식별하려면 그리드의 사각형을 참조점으로 활용합니다. 이미징 동안, 격자의 방향과 이미지화된 각 시야의 격자 내의 위치를 주목한다(예를 들어, 상단으로부터 2번째 행, 왼쪽으로부터 4번째 사각형).
  13. 연속적인 이미징 세션 중에 그리드를 사용하여 특정 그리드 영역으로 다시 이동하여 필드를 이미징합니다.
  14. 각 이미징 세션이 끝나면 70% 에탄올(v/v)에 담근 면봉으로 창을 부드럽게 닦아 잔류 렌즈 침지 매체와 이물질을 제거합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이미징 창을 통한 생체 내 이미징은 몇 시간에서 몇 주에 걸쳐 단일 세포 분해능에서 광범위한 세포 및 분자 사건을 관찰, 추적 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이미징 윈도우에 이상적인 특징은 다음을 포함한다: a) 마우스의 웰빙 및 조직의 생리학에 대한 제한된 영향; b) 내구성; c) 삽입의 단순성; d) 동일한 영역의 반복 이미징을위한 명확한 랜드 마크. 그 결과 다용도의 불활성 실리콘 윈도우가 탄생하여 쉽게 제작되고 삽입되며, 여러 이미징 세션의 범위에 걸쳐 동일한 시야각을 찾을 수 있는 그리드를 장착할 수 있습니다.

창은 저렴하고 유연하며 명확한 재료 인 PDMS로 만들어졌습니다. Windows는 대부분의 실험실에서 구입할 수있는 소모품으로 주조 할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, 상업적으로 입수가능한 24개의 웰 플레이트의 뚜껑에 이미 에칭된 원형 몰드(직경 22mm)가 잘 작동합니다. 단위 면적당 사용되는 폴리머의 양을 변화시킴으로써, 윈도우의 두께를 조절할...

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토론

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Intravital 이미징 창은 시간이 지남에 따라 펼쳐지는 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 과정을 직접 시각화하는 데 중요한 도구입니다. 마우스에 유연한 실리콘 이미징 창을 주조 및 삽입하기 위해 설명 된 새로운 절차는 현재 사용되는 이미징 창 (삼출, 파손 및 정상적인 이동성과의 간섭)의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 마우스에 대한 추가 안전성을 제공하며이 기술의 접근성을 향상시킵니다.

가장 널리 사용되는 이미징 창은 유리 커버 슬립을 고정하는 금속 프레임으로 구성됩니다. 이러한 프로토 타입 창문의 사용에 대한 주요 장애물은 금속 링을 고정하는 것이 힘든 스티칭 절차를 필요로하므로 고급 외과 적 훈련을 받아야한다는 것입니다. 또한 프레임을 제조하는 데 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요합니다. PDMS 창은 이러한 두 가지 문제를 모두 극복합니다. PDMS 창을 삽입하는 절차는 바느질을 제거하여 기술 학습에 대한 장벽을 크게 낮춥니다. 창문을 생산하는 재료도...

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공개 사항

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M.E.는 Insmed, Inc.의 brensocatib 연구 자문위원회 위원입니다. Vividion Therapeutics, Inc.의 과학 자문위원회 위원; Protalix, Inc.의 컨설턴트; Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T.는 Mestag Therapeutics의 공동 설립자이며 과학 자문위원회에 소속되어 있으며 Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology 및 Cygnal Therapeutics의 지분을 보유하고 있습니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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레이저 컷 스테인레스 스틸 그리드를 설계하고 최적화하는 데 도움을 주신 Rob Eifert에게 감사드립니다. 이 연구는 CSHL 암 센터 (P30-CA045508)와 국립 보건원 (NIH)의 M.E. 기금 (1R01CA2374135 및 5P01CA013106-49)에 의해 지원되었습니다. CSHL 및 노스웰 헬스; 톰슨 가족 재단; 미국 전역에서 수영; Simons Foundation에서 CSHL에 대한 보조금. M.S.는 국립 일반 의료 과학 연구소 의료 과학자 교육 프로그램 교육 상 (T32-GM008444)과 NIH의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 수상 번호 1F30CA253993-01의 지원을 받았습니다. L.M.은 James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. J.M.A.는 암 연구소 / 어빙턴 박사 후 펠로우십 (CRI 상 # 3435)을 수상했습니다. D.A.T.는 Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research 및 Thompson Family Foundation의 지원을 받습니다. 만화는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3M Medipore 소프트 클로스 수술 테이프3M70200770819
실크 봉합사 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP 마우스Jackson Laboratory22974
AEC 기판 키트, 과산화효소(HRP), (3-아미노-9-에틸카르바졸)Vector Laboratories SK-4200
알코올 면봉BD 
마취 시스템분자 이미징 제품 (주)
Acqknowledge 소프트웨어 및 센서 BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
베타딘 스프레이 LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) 마우스Jackson Laboratory18549
C57BL/6J 마우스Jackson Laboratory664
CD45 단클론 항체 (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 항체Abcamab125212
Curity 거즈 스폰지 Covidien
당나귀 안티 염소 IgG H & L (HRP) Abcamab6885
당나귀 안티 토끼 IgG H& L (HRP) Abcamab97064
당나귀 안티 쥐 IgG H & L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 실리콘 봉지재 투명전자 현미경 과학24236-10두 부분, 10:1 혼합 비율
라운드 커버 유리, 8mm 직경, #1.5 두께 전자 현미경 과학72296-08
Ender-3 Pro 3D 프린터Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
원적외선 가열 담요Kent ScientificRT-0520
Fc 수용체 차단제Innovex BiosciencesNB309
피지 이미징 처리 패키지https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres 카르복실레이트, 0.04&마이크로; m, 황록색 (505/515)InvitrogenF8795
게이팅 시스템:BIOPAC Systems Inc.이 구성 요소를 함께 사용하면 이미징 중에 마우스 바이탈을 모니터링하고 마우스 호흡에 대한 이미지 획득을 게이팅할 수 있습니다. 모두 BIOPAC 시스템에서 인수했습니다.
Acqknowledge 소프트웨어 ACK100W, ACK100M
diff. amp. 모듈, C 시리즈 DA100C
듀얼 게이팅 시스템 작은 동물DTU200 
Windows용 MP160 - 분석 시스템MP160WSW 
MouseOx 플러스 120V 목스-120V; 015000 
압력 패드 TSD110 
GelfoamPfizer9031508흡수성 젤라틴 스폰지
경화 미세 가위Fine Science Tools14090-11두 쌍; 스테인레스 스틸, 날카롭
팁, 직선 팁, 26mm
절삭 날, 11cm 길이
인간 / 마우스 Myeloperoxidase / MPO 항체R & D SystemsAF3667
핫 비드 살균기Fine Science Tools18000-45사용 약 30분 전에 켜
; >200
에서 도구를 살균; C 30 초
이마리스 비트 플레인www.bitplane.com
침수 매체 Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurane (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594주사기 DL-1177-1
LysM-eGFP 마우스www.mmrrc.org012039-MU
마이크로 해부 겸자RobozRS-5135톱니형, 약간의 곡선, 0.8mm 팁 너비; 4" 길이
마이크로 해부 겸자RobozRS-51531 x 2 톱니, 약간의 곡선, 0.8mm 팁
너비, 4" 길이
MTS MiniBionix II 808MTS 시스템서보 유압 재료 시험기
호중구 Elastase 680 FAST 프로브PerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
산소일반 용접 공급 공사
폴리락틱 산 필라멘트해치박스1.75 mm 직경
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube 안과 연고Dechra NDC17033-211-38
Reflex 7 상처 클립Roboz SurgicalRS-9255
스테인리스 스틸 그리드Fotofab하나의 그리드는 직경이 0.200인치이며 총 52개의 개별 그리드 사각형이 0.016 x 0.016인치입니다. 각 사각형 사이에는 0.003인치의 공간이 있습니다.   
표면 처리된 멸균조직 배양판Fisher ScientificFB012929뚜껑은 이미징 창의 경화 표면으로 사용됩니다
. TriM Scope Multiphoton Microscope LaVision BioTec이미징은 두 개의 Ti:Sapphire 레이저(Mai Tai 및 InSight, Spectra-Physics)와 광학 파라메트릭 발진기가 장착된 정립 2광자 현미경(Trimscope, LaVision BioTec)에서 수행되었습니다. 다음 Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma)는 신호를 4개의 photomultipler tube로 보내는 데 사용되었습니다.
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR 마이크로 커버 유리VWR48404-453
326895 Vector Laboratories가 있는 인슐린

참고문헌

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  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

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