돼지 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)의 특성화

내피는 매우 복잡하고 역동적인 구조이며 혈관벽의 중요한 구성 요소입니다. 순환하는 혈액과 주변 조직 사이에 물리적 인터페이스를 제공하기 위해 혈관의 내부 표면을 감싸고 있습니다. 이러한 이질적인 구조는 혈관신생, 염증, 혈관조절, 지혈^등의 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다 1,2,3,4. 인간 제대 정맥 내피 세포는 내피 세포의 기능을 평가하기 위해 널리 연구된 세포 유형입니다. 그러나, 환자별 배치 가변성, 일관되지 않은 표현형 및 최소 분할 효율은 이러한 모든 특징을 개선할 수 있는 세포 공급원을 결정할 필요가 있음을 시사한다⁵.

일차 내피 세포의 균질한 집단을 얻는 것은 기술적으로 어려울 수 있으며, 일차 내피 세포는 높은 증식 능력을 갖지 않는다⁶. 따라서 혈관 재생을 연구하고 병태생리학적 과정을 평가하기 위해 다양한 그룹이 말초 혈액에서 파생된 다양한 유형의 내피 세포, 예를 들어 내피 전구 세포(EPC) 또는 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 얻고 평가하려고 시도했습니다^.6,7,8,9 . 방추형 초기 EPC는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유래하며 성장 효능이 제한적이고 성숙한 내피 세포를 생성하는 혈관 신생 능력이 제한적입니다. 또한, 그들은 염증성 단핵구와 매우 유사합니다. 또한, 기능적이고, 증식하고, 성숙한 내피 세포로 더 분화하는 능력은 여전히 논란의 여지가 있다 6,7,9,10. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 연속 배양은 후기 성장 EPC, BOEC 또는 내피 콜로니 형성 세포 (ECFC)로 알려진 세포의 2 차 집단을 생성 할 수 있습니다 6,7,9,10. Medina et al. 2018년에 EPC의 한계, 명명법의 모호성, EPC¹¹에 따라 지속적으로 그룹화되는 많은 별개의 세포 유형과의 일반적인 일치 부족을 인정했습니다. 대조적으로, BOEC는 혈관 복구, 건강 및 질병, 세포 치료에서 그 역할로 인정 받고 있습니다. 이들 세포의 추가 연구 및 치료적 사용은 순환 전구 세포로부터 이러한 세포 유형을 일관되게 유도하기 위한 프로토콜에 의존할 것이다.

BOECs와 같은 일차 세포는 증식성이 높은 성숙한 내피 세포⁶를 얻기 위한 대용물로서 사용될 수 있다. BOEC는 초기 EPC와 표현형적으로 구별되며 조약돌 형태 및 부착 접합부 및 카베올라 발현과 같은 전형적인 내피 특징을 나타냅니다¹². Hebbel et ^al.13,14,15에 의한 유전자 프로파일링은 BOEC 또는 ECFC가 미세혈관 및 대혈관 형성을 촉진하기 때문에 진정한 내피 세포임을 발견했습니다. 따라서 BOEC는 병태생리학적 과정과 유전적 변이를 평가하는 도구로 사용될 수 있다¹⁶. 이들은 또한 혈관 재생을 위한 세포 치료를 위한 우수한 세포 공급원으로 간주된다¹⁷. 따라서 이러한 고증식 세포를 일관되게 유도하기 위한 표준화된 프로토콜이 필수적입니다.

BOEC는 인간의 병태생리학적 및 유전적 변이를 연구하기 위한 강력한 도구를 제공하지만, 보다 균질한 BOEC 공급원은 보다 강력하고 신뢰할 수 있는 실험 및 치료 결과를 제공할 수 있습니다. 우수한 균질성은 유사한 조건에서 자란 유전적으로 유사한 동물로부터 유래된 이종유전 세포 공급원을 사용함으로써 달성될 수 있다¹⁸. 이종 세포 공급원은 숙주 면역 반응을 유도하는 경향이 있지만, 면역 적합성 동물 및 세포를 포함한 동물 제품을 생성하는 것을 목표로 면역 조절 전략이 개발되고 있습니다. 특히 돼지는 말초 혈액의 풍부한 공급원이며 인간과의 해부학적 및 생리학적 유사성으로 인해 의료 기기 및 기타 치료법을 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다. 따라서 이 연구는 돼지 말초 혈액에서 고증식성 BOEC의 분리 및 확장을 위한 프로토콜을 개선합니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜은 비교적 적은 양의 혈액에서 많은 수의 BOEC를 얻는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 배양은 단일 혈액 샘플에서 수백만 개의 세포를 생성하기 위해 여러 계대를 통해 확장될 수 있습니다.

모든 동물 연구는 위스콘신 의과 대학과 메이요 클리닉의 각 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

참고: 이 연구에서는 40-80kg, 생후 3-6개월의 Yorkshire/Landrace/Duroc 교배 국내 돼지(Sus domesticus)를 사용했습니다.

1. 돼지 말초 혈액 수집

1. 재료를 준비하십시오.
   1. 헤파린 용액을 멸균 식염수에서 100U/mL로 희석합니다.
   2. 2개의 50mL 원뿔형 튜브와 2개의 60mL 주사기 각각에 3-4mL의 헤파린 용액을 추가합니다.
   3. 희석되지 않은 헤파린 용액(1,000U/mL)을 확장 튜브에 넣습니다.
   4. 헤파린이 채워진 확장 튜브의 한쪽 끝에 19G 바늘을 연결하고 다른 쪽 끝에 헤파린 함유 60mL 주사기를 연결합니다.
2. 제도적 정책에 따라 돼지를 마취시킨다.
   1. 마취를 유도하기 위해 아트로핀(0.05mg/kg), 틸레타민/졸라제팜(2-5mg/kg) 및 자일라진(2mg/kg)의 IM 주사를 투여합니다.
      참고: 동물이 의식을 잃고 하악 근육이 경직되지 않으면 적절한 마취가 이루어집니다.
   2. 동물을 앙와위 자세로 눕히고 양쪽에 말아 올린 수건을 놓아 안정성을 제공합니다.
   3. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
   4. 마취 중 담요, 가열 패드 및/또는 가열된 시술 테이블을 포함한 열 지원을 제공합니다.
3. betadine 스크럽 용액으로 대퇴골 사타구니 부위를 청소하십시오.
4. 19G 바늘로 대퇴 정맥이나 동맥을 뚫고 천천히(~1-2mL/s) 50mL의 혈액을 주사기에 넣습니다.
   알림: 너무 빨리 그리면 셀이 손상될 수 있습니다.
5. 바늘을 제자리에 두고 즉시 확장 튜브를 꼬고 60mL 주사기를 분리합니다
6. 혈액을 헤파린이 함유된 50mL 원추형 튜브로 천천히 옮깁니다.
7. 50mL 원뿔형 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다.
8. 나머지 헤파린 함유 60mL 주사기를 연장 튜브에 연결하고 연장 튜브를 풀고 추가로 50mL의 혈액을 주사기에 천천히 흡입합니다.
9. 즉시 동맥이나 정맥에서 바늘을 제거하고 연장 튜브에서 남은 혈액을 주사기로 천천히 끌어들입니다.
10. 확장 튜브에서 60mL 주사기를 분리하고 나머지 헤파린이 함유된 50mL 원추형 튜브로 혈액을 천천히 옮깁니다.
11. 50mL 원뿔형 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다.
12. 돼지의 대퇴골 사타구니 부위에 압력 지혈을 가하십시오.
13. 제도적 정책에 따라 돼지를 회수하십시오. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하고 일반 주거/사육장으로 돌아갈 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 지속적으로 모니터링합니다.

2. 단핵구의 분리

1. 4개의 50mL 원뿔형 튜브에 인산염 완충 식염수(PBS)로 혈액을 1:1로 희석합니다.
   참고: 이 작업은 세포 배양 오염을 방지하기 위해 무균 기술을 사용하여 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다.
2. 즉시 사용 가능한 실온 밀도 구배 용액 25mL를 8개의 50mL 코니컬 튜브에 추가합니다.
3. 튜브를 피펫 팁에 날카로운 각도로 잡고 50mL 원뿔형 튜브가 들어 있는 각 밀도 구배 용액의 내부를 따라 25mL의 혈액/식염수 용액을 매우 천천히 피펫팅합니다.
   참고: 혈액 용액은 밀도 구배 용액 위에 부드럽게 겹쳐야 하며 잘 정의된 인터페이스를 유지해야 합니다.
4. 튜브를 560 x g 및 실온(RT)에서 30분 동안 원심분리합니다.
   알림: 최상의 결과를 얻으려면 가능하면 원심분리기 브레이크를 비활성화하십시오.
5. 얇은 피펫을 사용하여 각 튜브에서 버피 코트(밀도 구배 용액 위와 투명 혈장 아래의 단핵 세포의 흐린 층)를 조심스럽게 수집하고 두 개의 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 고르게 분배합니다. 튜브가 포함된 밀도 구배 용액을 폐기하십시오.
   알림: 밀도 구배 용액과 플라즈마를 가능한 한 적게 수집하면서 가능한 한 많은 버피 코트를 수집하십시오.

3. 세포의 세척 그리고 도금

1. 6 웰 플레이트에 피브로넥틴을 코팅합니다.
   1. 인간 혈장 피브로넥틴을 멸균수에 1mg/mL로 희석하여 원액을 만듭니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다.
   2. 600 μL의 피브로넥틴 원액을 3 mL의 PBS에 희석하여 3.6 mL의 피브로넥틴 작업 용액을 만든다.
   3. 피브로넥틴 작업 용액 600μL를 6웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 고르게 코팅될 때까지 부드럽게 흔들어줍니다.
   4. 피브로넥틴이 웰을 코팅할 때까지 30분 정도 기다렸다가 각 웰에서 용액을 부드럽게 흡인합니다.
2. 피브로넥틴이 코팅되기를 기다리는 동안 단핵 세포를 세척하십시오
   1. 튜브에 최대 45mL의 PBS를 보충합니다.
   2. 낮은 브레이크로 560 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 두 튜브에서 상층액을 흡인합니다.
   3. 각 세포 펠릿을 25mL의 PBS에 재현탁합니다.
   4. 두 번째 세탁을 반복합니다.
3. 각 세포 펠릿을 5mL의 PBS에 재현탁하고 15mL의 0.8% 염화암모늄 용액을 각 튜브에 추가합니다.
   알림: 이 단계는 나머지 적혈구를 용해하는 것입니다.
4. 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
5. PBS로 튜브를 토핑하고 낮은 브레이크로 560 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 이전과 같이 세포를 세척합니다. 두 튜브에서 상층액을 흡인합니다.
6. 각 세포 펠릿을 25mL의 PBS에 재현탁하고 두 번째 세척을 반복합니다.
7. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 10,000U/mL 페니실린, 10mg/mL 스트렙토마이신 및 25μg/mL 암포테리신을 함유한 항생제/항진균제 용액 1개가 보충된 EGM-2 배양 배지 6mL에 각 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   참고: EGM-2 배양 배지는 200μL의 하이드로코르티손, 2mL의 인간 섬유아세포 성장 인자(hFGF-B), 500μL의 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 500μL의 인슐린 유사 성장 인자(R₃ IGF-1)의 재조합 유사체, 500μL의 아스코르브산, 500μL의 인간 표피 성장 인자(hEGF), 500mL당 겐타마이신/암포테리신 500μL 및 헤파린 500μL.
8. 2mL의 세포 현탁액을 피브로넥틴이 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰로 부드럽게 옮기고 고르게 코팅될 때까지 부드럽게 흔들어 줍니다.
   참고: 목표는 형성될 내피 콜로니의 수를 최대화하기 위해 가능한 한 많은 세포를 파종하는 것입니다.

4. 세포 배양

1. 세포를 37°C, 5%_CO2, 및 100% 습도에서 배양한다.
2. 다음날, 각 웰에 1mL의 신선한 배양 배지를 부드럽게 첨가한다.
   참고: 피브로넥틴 코팅에 느슨하게 부착된 세포를 방해하지 않도록 부드럽게 하는 것이 중요합니다.
3. 다음날, 각 웰로부터 1.5 mL의 배양 배지를 부드럽게 흡인하고 이를 1.5 mL의 신선한 배양 배지로 교체하여 반 배양 배지 교체를 수행한다.
4. 다음 5일 각각에, 각 웰에 대한 전체 배양 배지 교체를 부드럽게 수행한다 (웰 당 신선한 배양 배지 2 mL).
5. 그 후, 일주일에 세 번 배양 배지를 부드럽게 교체하십시오.
6. 저전력(4x 대물렌즈) 광학 현미경으로 세포 배양을 정기적으로 시각화합니다.
   참고: 부착 혈액 성장 내피 세포(BOEC) 콜로니는 도금 후 7-10일 후에 웰에 나타나기 시작합니다. 비부착성 세포 유형은 배지 변화와 함께 폐기되고 다른 부착성 세포 유형은 BOEC 콜로니가 성장함에 따라 점차 소멸됩니다.
7. ~70%-80%가 합류할 때 BOEC를 피브로넥틴 코팅된 T-75 플라스크에 통과시키고 일주일에 세 번 배양 배지를 계속 교체합니다.
   참고: 파종 밀도는 콜로니를 T25 플라스크에 대신 통과시켜 제어할 수 있습니다. 후속 계대는 피브로넥틴 코팅을 필요로 하지 않으며, 배양 배지 변경은 주당 2회로 줄일 수 있다.
8. 계대 1-3으로부터의 세포는 실험에 사용되거나 동결 배지로 옮겨져 향후 사용을 위해 액체 질소에 저장될 수 있다.

배양 시작부터 BOEC 콜로니가 관찰될 때까지 배양된 세포의 형태를 관찰하였다(도 1). 더 작은 집단의 부착 세포가 배양 접시에 부착되어 성장하기 시작한 반면, 비부착 세포는 배양 배지 변경으로 제거되었습니다(그림 1B). 콜로니는 중심점에서 방사상으로 바깥쪽으로 증식하는 내피 유사 세포의 집합체로 6일째에 처음 나타났습니다(그림 1D). 배양이 진행됨에 따라 세포 콜로니는 더욱 조밀해졌고 성숙한 내피 세포와 유사한 조약돌 형태를 나타냈습니다(그림 1F). 일반적인 내피 조약돌 형태는 광학 현미경을 사용하여 BOEC를 쉽게 예비 식별할 수 있습니다.

내피 세포 콜로니는 일반적으로 배양 10-14일에 계대노화를 할 준비가 되어 있습니다. 이때, 6-웰 플레이트는 전형적으로 93%-98%의 생존율로 ~100만 개의 세포를 생성할 것이다. 첫 번째 계대 동안 내피 세포는 T75 플라스크에서 ~6-10백만 개의 세포를 생성하도록 확장됩니다.

BOEC의 형태 형성을 평가하기 위해, 기저막 매트릭스 (예를 들어, 매트리겔)를 10 μL/웰로 15 웰 혈관신생 플레이트에 도말하고, 중합을 허용하기 위해 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 계대 2 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 시딩하고 14시간 및 24시간 시점에서 이미지화했습니다. 웰 당 약 3,500 개의 세포 밀도는 네트워크 및 튜브와 같은 구조를 형성 할 수있었습니다. 튜브 형성은 무혈청 배지(FBS를 제외한 보충제가 포함된 EGM-2)의 경우 14시간 이내에, 완전 성장 배지(FBS를 포함한 보충제가 포함된 EGM-2)의 경우 24시간 이내에 나타났습니다. FBS를 첨가하면 내피 세포 특이적 성장 인자(예: VEGF)가 희석되고 다른 신호 전달 인자가 도입되어 튜브 형성 과정이 지연될 수 있습니다. 2D 위상차 현미경을 사용하여 무혈청 배지(그림 2A, B) 및 완전 성장 배지(그림 2C, D)에서 튜브 형성을 이미지화했습니다. 두 배지 조건의 세포는 형태학적 분화를 겪었고 모세관과 같은 구조의 광범위한 네트워크로 빠르게 조직되었습니다. 이러한 구조는 생체 내 모세혈관 네트워크와 유사한 조직화된 세포 코드로 구성되었습니다. 또한, 20x 배율의 현미경 사진은 내피 세포의 복잡한 다세포 조직과 형태학적 분화를 자세히 보여줍니다. 배지 조건 간에 형태학적 차이는 관찰되지 않았습니다. 모세관과 같은 구조의 광범위한 네트워크는 배양된 세포가 성숙하고 기능적인 내피 세포로 분화됨을 강력하게 시사합니다.

BOEC는 성숙한 내피 세포 마커 CD31 또는 혈소판 내피 세포 접착 분자-1(PECAM1)의 발현에 의해 추가로 특성화되었습니다(그림 3A, B). BOEC는 CD31의 균일한 발현을 보였다. 또한, 유세포 분석 결과 PBMC의 양성 대조군과 비교하여 단핵구 마커 CD14에 대해 음성으로 염색된 세포로서 EPC가 없음을 확인했습니다(그림 3C,D).

그림 1: 표현형 광학 현미경 이미지. (A) 0일, (B) 2일, (C) 4일, (D) 6일, (E) 8일 및 (F) 첫 번째 계대 후 10x 배율로 관찰된 배양된 BOEC의 광학 현미경 이미지. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: passage 2 BOEC의 형태학적 분화 및 조직. 모세관과 같은 구조로의 계대 2 BOEC의 형태학적 분화 및 조직은 무혈청 배지의 경우 14시간 이내에, 완전 성장 배지의 경우 24시간 이내에 기저막 매트릭스에서 관찰되었습니다. (A) 4x에서 무혈청 배지, (B) 20x에서 무혈청 배지, (C) 4x에서 완전한 성장 배지 및 (D) 20x에서 완전한 성장 배지. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: CD31 및 CD14를 사용한 BOEC의 특성화. (A) 계대 2-3 BOEC는 녹색 및 (B) 상응하는 위상차 현미경 이미지에서 볼 수 있는 항-CD31-FITC 항체를 사용하여 PECAM1에 대해 염색되었습니다. 세포를 현탁액으로 염색하고, 현탁액을 현미경 슬라이드 상에 이미지화하였다. 스케일 바: 200μm. (C) (D) 양성 대조군 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 비교하여 CD14-AF700 항체를 사용한 BOEC의 유세포 분석. CD14 양성 염색은 파란색으로, 염색되지 않은 세포는 빨간색으로 표시됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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