내피는 혈관신생, 지혈, 염증 및 항상성과 같은 많은 생리적 기능에서 중요한 역할을 하는 역동적인 통합 구조입니다. 내피는 또한 죽상동맥경화증, 고혈압 및 당뇨병과 같은 병태생리학에서 중요한 역할을 합니다. 내피 세포는 혈액과 림프관의 내벽을 형성하고 구조와 기능면에서 이질성을 나타냅니다. 다양한 그룹은 조혈 줄기 세포 또는 성숙한 혈액 파생 내피 세포(또는 내피 집락 형성 세포)에서 유래한 내피 전구 세포에 초점을 맞춰 인간 말초 혈액에서 유래한 내피 세포의 기능을 평가했습니다. 이 세포는 치료 및 질병 모델링을 위한 자가 자원을 제공합니다. 이종 세포는 유사한 조건에서 자란 유전적으로 유사한 동물을 사용하여 달성된 가용성 및 균질성으로 인해 대체 치료제 공급원을 제공할 수 있습니다. 따라서, 돼지 말초 혈액으로부터 고도로 증식하는 혈액 유출 내피 세포의 분리 및 확장을 위한 강력한 프로토콜이 제시되었다. 이 세포는 심혈관 조직 공학, 세포 치료, 질병 모델링, 약물 스크리닝, 내피 세포 생물학 연구, 이종 이식에서 염증 및 응고 반응을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양과 같은 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
초록
서론
내피는 매우 복잡하고 역동적인 구조이며 혈관벽의 중요한 구성 요소입니다. 순환하는 혈액과 주변 조직 사이에 물리적 인터페이스를 제공하기 위해 혈관의 내부 표면을 감싸고 있습니다. 이러한 이질적인 구조는 혈관신생, 염증, 혈관조절, 지혈등의 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다 1,2,3,4. 인간 제대 정맥 내피 세포는 내피 세포의 기능을 평가하기 위해 널리 연구된 세포 유형입니다. 그러나, 환자별 배치 가변성, 일관되지 않은 표현형 및 최소 분할 효율은 이러한 모든 특징을 개선할 수 있는 세포 공급원을 결정할 필요가 있음을 시사한다5.
일차 내피 세포의 균질한 집단을 얻는 것은 기술적으로 어려울 수 있으며, 일차 내피 세포는 높은 증식 능력을 갖지 않는다6. 따라서 혈관 재생을 연구하고 병태생리학적 과정을 평가하기 위해 다양한 그룹이 말초 혈액에서 파생된 다양한 유형의 내피 세포, 예를 들어 내피 전구 세포(EPC) 또는 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 얻고 평가하려고 시도했습니다.6,7,8,9 . 방추형 초기 EPC는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유래하며 성장 효능이 제한적이고 성숙한 내피 세포를 생성하는 혈관 신생 능력이 제한적입니다. 또한, 그들은 염증성 단핵구와 매우 유사합니다. 또한, 기능적이고, 증식하고, 성숙한 내피 세포로 더 분화하는 능력은 여전히 논란의 여지가 있다 6,7,9,10. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 연속 배양은 후기 성장 EPC, BOEC 또는 내피 콜로니 형성 세포 (ECFC)로 알려진 세포의 2 차 집단을 생성 할 수 있습니다 6,7,9,10. Medina et al. 2018년에 EPC의 한계, 명명법의 모호성, EPC11에 따라 지속적으로 그룹화되는 많은 별개의 세포 유형과의 일반적인 일치 부족을 인정했습니다. 대조적으로, BOEC는 혈관 복구, 건강 및 질병, 세포 치료에서 그 역할로 인정 받고 있습니다. 이들 세포의 추가 연구 및 치료적 사용은 순환 전구 세포로부터 이러한 세포 유형을 일관되게 유도하기 위한 프로토콜에 의존할 것이다.
BOECs와 같은 일차 세포는 증식성이 높은 성숙한 내피 세포6를 얻기 위한 대용물로서 사용될 수 있다. BOEC는 초기 EPC와 표현형적으로 구별되며 조약돌 형태 및 부착 접합부 및 카베올라 발현과 같은 전형적인 내피 특징을 나타냅니다12. Hebbel et al.13,14,15에 의한 유전자 프로파일링은 BOEC 또는 ECFC가 미세혈관 및 대혈관 형성을 촉진하기 때문에 진정한 내피 세포임을 발견했습니다. 따라서 BOEC는 병태생리학적 과정과 유전적 변이를 평가하는 도구로 사용될 수 있다16. 이들은 또한 혈관 재생을 위한 세포 치료를 위한 우수한 세포 공급원으로 간주된다17. 따라서 이러한 고증식 세포를 일관되게 유도하기 위한 표준화된 프로토콜이 필수적입니다.
BOEC는 인간의 병태생리학적 및 유전적 변이를 연구하기 위한 강력한 도구를 제공하지만, 보다 균질한 BOEC 공급원은 보다 강력하고 신뢰할 수 있는 실험 및 치료 결과를 제공할 수 있습니다. 우수한 균질성은 유사한 조건에서 자란 유전적으로 유사한 동물로부터 유래된 이종유전 세포 공급원을 사용함으로써 달성될 수 있다18. 이종 세포 공급원은 숙주 면역 반응을 유도하는 경향이 있지만, 면역 적합성 동물 및 세포를 포함한 동물 제품을 생성하는 것을 목표로 면역 조절 전략이 개발되고 있습니다. 특히 돼지는 말초 혈액의 풍부한 공급원이며 인간과의 해부학적 및 생리학적 유사성으로 인해 의료 기기 및 기타 치료법을 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다. 따라서 이 연구는 돼지 말초 혈액에서 고증식성 BOEC의 분리 및 확장을 위한 프로토콜을 개선합니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜은 비교적 적은 양의 혈액에서 많은 수의 BOEC를 얻는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 배양은 단일 혈액 샘플에서 수백만 개의 세포를 생성하기 위해 여러 계대를 통해 확장될 수 있습니다.
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프로토콜
모든 동물 연구는 위스콘신 의과 대학과 메이요 클리닉의 각 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
참고: 이 연구에서는 40-80kg, 생후 3-6개월의 Yorkshire/Landrace/Duroc 교배 국내 돼지(Sus domesticus)를 사용했습니다.
1. 돼지 말초 혈액 수집
- 재료를 준비하십시오.
- 헤파린 용액을 멸균 식염수에서 100U/mL로 희석합니다.
- 2개의 50mL 원뿔형 튜브와 2개의 60mL 주사기 각각에 3-4mL의 헤파린 용액을 추가합니다.
- 희석되지 않은 헤파린 용액(1,000U/mL)을 확장 튜브에 넣습니다.
- 헤파린이 채워진 확장 튜브의 한쪽 끝에 19G 바늘을 연결하고 다른 쪽 끝에 헤파린 함유 60mL 주사기를 연결합니다.
- 제도적 정책에 따라 돼지를 마취시킨다.
- 마취를 유도하기 위해 아트로핀(0.05mg/kg), 틸레타민/졸라제팜(2-5mg/kg) 및 자일라진(2mg/kg)의 IM 주사를 투여합니다.
참고: 동물이 의식을 잃고 하악 근육이 경직되지 않으면 적절한 마취가 이루어집니다. - 동물을 앙와위 자세로 눕히고 양쪽에 말아 올린 수건을 놓아 안정성을 제공합니다.
- 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
- 마취 중 담요, 가열 패드 및/또는 가열된 시술 테이블을 포함한 열 지원을 제공합니다.
- 마취를 유도하기 위해 아트로핀(0.05mg/kg), 틸레타민/졸라제팜(2-5mg/kg) 및 자일라진(2mg/kg)의 IM 주사를 투여합니다.
- betadine 스크럽 용액으로 대퇴골 사타구니 부위를 청소하십시오.
- 19G 바늘로 대퇴 정맥이나 동맥을 뚫고 천천히(~1-2mL/s) 50mL의 혈액을 주사기에 넣습니다.
알림: 너무 빨리 그리면 셀이 손상될 수 있습니다. - 바늘을 제자리에 두고 즉시 확장 튜브를 꼬고 60mL 주사기를 분리합니다
- 혈액을 헤파린이 함유된 50mL 원추형 튜브로 천천히 옮깁니다.
- 50mL 원뿔형 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다.
- 나머지 헤파린 함유 60mL 주사기를 연장 튜브에 연결하고 연장 튜브를 풀고 추가로 50mL의 혈액을 주사기에 천천히 흡입합니다.
- 즉시 동맥이나 정맥에서 바늘을 제거하고 연장 튜브에서 남은 혈액을 주사기로 천천히 끌어들입니다.
- 확장 튜브에서 60mL 주사기를 분리하고 나머지 헤파린이 함유된 50mL 원추형 튜브로 혈액을 천천히 옮깁니다.
- 50mL 원뿔형 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다.
- 돼지의 대퇴골 사타구니 부위에 압력 지혈을 가하십시오.
- 제도적 정책에 따라 돼지를 회수하십시오. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하고 일반 주거/사육장으로 돌아갈 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 지속적으로 모니터링합니다.
2. 단핵구의 분리
- 4개의 50mL 원뿔형 튜브에 인산염 완충 식염수(PBS)로 혈액을 1:1로 희석합니다.
참고: 이 작업은 세포 배양 오염을 방지하기 위해 무균 기술을 사용하여 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. - 즉시 사용 가능한 실온 밀도 구배 용액 25mL를 8개의 50mL 코니컬 튜브에 추가합니다.
- 튜브를 피펫 팁에 날카로운 각도로 잡고 50mL 원뿔형 튜브가 들어 있는 각 밀도 구배 용액의 내부를 따라 25mL의 혈액/식염수 용액을 매우 천천히 피펫팅합니다.
참고: 혈액 용액은 밀도 구배 용액 위에 부드럽게 겹쳐야 하며 잘 정의된 인터페이스를 유지해야 합니다. - 튜브를 560 x g 및 실온(RT)에서 30분 동안 원심분리합니다.
알림: 최상의 결과를 얻으려면 가능하면 원심분리기 브레이크를 비활성화하십시오. - 얇은 피펫을 사용하여 각 튜브에서 버피 코트(밀도 구배 용액 위와 투명 혈장 아래의 단핵 세포의 흐린 층)를 조심스럽게 수집하고 두 개의 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 고르게 분배합니다. 튜브가 포함된 밀도 구배 용액을 폐기하십시오.
알림: 밀도 구배 용액과 플라즈마를 가능한 한 적게 수집하면서 가능한 한 많은 버피 코트를 수집하십시오.
3. 세포의 세척 그리고 도금
- 6 웰 플레이트에 피브로넥틴을 코팅합니다.
- 인간 혈장 피브로넥틴을 멸균수에 1mg/mL로 희석하여 원액을 만듭니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다.
- 600 μL의 피브로넥틴 원액을 3 mL의 PBS에 희석하여 3.6 mL의 피브로넥틴 작업 용액을 만든다.
- 피브로넥틴 작업 용액 600μL를 6웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 고르게 코팅될 때까지 부드럽게 흔들어줍니다.
- 피브로넥틴이 웰을 코팅할 때까지 30분 정도 기다렸다가 각 웰에서 용액을 부드럽게 흡인합니다.
- 피브로넥틴이 코팅되기를 기다리는 동안 단핵 세포를 세척하십시오
- 튜브에 최대 45mL의 PBS를 보충합니다.
- 낮은 브레이크로 560 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 두 튜브에서 상층액을 흡인합니다.
- 각 세포 펠릿을 25mL의 PBS에 재현탁합니다.
- 두 번째 세탁을 반복합니다.
- 각 세포 펠릿을 5mL의 PBS에 재현탁하고 15mL의 0.8% 염화암모늄 용액을 각 튜브에 추가합니다.
알림: 이 단계는 나머지 적혈구를 용해하는 것입니다. - 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
- PBS로 튜브를 토핑하고 낮은 브레이크로 560 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 이전과 같이 세포를 세척합니다. 두 튜브에서 상층액을 흡인합니다.
- 각 세포 펠릿을 25mL의 PBS에 재현탁하고 두 번째 세척을 반복합니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS)과 10,000U/mL 페니실린, 10mg/mL 스트렙토마이신 및 25μg/mL 암포테리신을 함유한 항생제/항진균제 용액 1개가 보충된 EGM-2 배양 배지 6mL에 각 세포 펠릿을 재현탁합니다.
참고: EGM-2 배양 배지는 200μL의 하이드로코르티손, 2mL의 인간 섬유아세포 성장 인자(hFGF-B), 500μL의 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 500μL의 인슐린 유사 성장 인자(R3 IGF-1)의 재조합 유사체, 500μL의 아스코르브산, 500μL의 인간 표피 성장 인자(hEGF), 500mL당 겐타마이신/암포테리신 500μL 및 헤파린 500μL. - 2mL의 세포 현탁액을 피브로넥틴이 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰로 부드럽게 옮기고 고르게 코팅될 때까지 부드럽게 흔들어 줍니다.
참고: 목표는 형성될 내피 콜로니의 수를 최대화하기 위해 가능한 한 많은 세포를 파종하는 것입니다.
4. 세포 배양
- 세포를 37°C, 5%CO2, 및 100% 습도에서 배양한다.
- 다음날, 각 웰에 1mL의 신선한 배양 배지를 부드럽게 첨가한다.
참고: 피브로넥틴 코팅에 느슨하게 부착된 세포를 방해하지 않도록 부드럽게 하는 것이 중요합니다. - 다음날, 각 웰로부터 1.5 mL의 배양 배지를 부드럽게 흡인하고 이를 1.5 mL의 신선한 배양 배지로 교체하여 반 배양 배지 교체를 수행한다.
- 다음 5일 각각에, 각 웰에 대한 전체 배양 배지 교체를 부드럽게 수행한다 (웰 당 신선한 배양 배지 2 mL).
- 그 후, 일주일에 세 번 배양 배지를 부드럽게 교체하십시오.
- 저전력(4x 대물렌즈) 광학 현미경으로 세포 배양을 정기적으로 시각화합니다.
참고: 부착 혈액 성장 내피 세포(BOEC) 콜로니는 도금 후 7-10일 후에 웰에 나타나기 시작합니다. 비부착성 세포 유형은 배지 변화와 함께 폐기되고 다른 부착성 세포 유형은 BOEC 콜로니가 성장함에 따라 점차 소멸됩니다. - ~70%-80%가 합류할 때 BOEC를 피브로넥틴 코팅된 T-75 플라스크에 통과시키고 일주일에 세 번 배양 배지를 계속 교체합니다.
참고: 파종 밀도는 콜로니를 T25 플라스크에 대신 통과시켜 제어할 수 있습니다. 후속 계대는 피브로넥틴 코팅을 필요로 하지 않으며, 배양 배지 변경은 주당 2회로 줄일 수 있다. - 계대 1-3으로부터의 세포는 실험에 사용되거나 동결 배지로 옮겨져 향후 사용을 위해 액체 질소에 저장될 수 있다.
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결과
배양 시작부터 BOEC 콜로니가 관찰될 때까지 배양된 세포의 형태를 관찰하였다(도 1). 더 작은 집단의 부착 세포가 배양 접시에 부착되어 성장하기 시작한 반면, 비부착 세포는 배양 배지 변경으로 제거되었습니다(그림 1B). 콜로니는 중심점에서 방사상으로 바깥쪽으로 증식하는 내피 유사 세포의 집합체로 6일째에 처음 나타났습니다(그림 1D). 배양이 진행됨에 따라 세포 콜로니는 더욱 조밀해졌고 성숙한 내피 세포와 유사한 조약돌 형태를 나타냈습니다(그림 1F). 일반적인 내피 조약돌 형태는 광학 현미경을 사용하여 BOEC를 쉽게 예비 식별할 수 있습니다.
내피 세포 콜로니는 일반적으로 배양 10-14일에 계대노화를 할 준비가 되어 있습니다. 이때, 6-웰 플레이트는 전형적...
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토론
BOEC는 다양한 과학적 및 치료적 접근법에 사용될 수 있는 강력한 도구이다 7,8,16. BOEC는 혈관 질환 및 암의 발병을 담당하는 주요 인자를 밝히기 위해 EC 유전자 발현을 분석하는 데 사용되어 왔다 5,19,20,21. BOEC는 또한 혈관 재생 및 유전자 전달과 같은 치료 응용 분야에 사용되었습니다22,23,24. 유전자 변형 BOEC는 항혈관신생 종양 치료 ...
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공개 사항
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감사의 글
저자는 NIH/NHLBI R00 HL129068의 자금 지원을 인정하고자 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 19G 니들 | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Corning | 352098 | |
| 6 웰 플레이트 | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL 주사기 | Covidien | 8881560125 | |
| 염화 암모늄 용액 (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| 항생제/항진균 용액(100x) | Gibco | 15240-062 | |
| 원심분리기 | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 배양 배지 | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| 확장 튜브 | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | 밀도 구배 용액 |
| 헤파린 나트륨 주입(1,000단위/mL) | 화이자 | 00069-0058-01 | |
| 인간 혈장 피브로넥틴 | Gibco | 33016-015 | |
| 얼음 | N/A | N/A | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| 피펫 세트 | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
참고문헌
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