Method Article

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

DOI:

10.3791/63382

⸱

January 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 박테리아 떼 운동성을 평가하면서 동시에 다중 농도 반응을 얻기 위해 유도제 구배 플레이트의 사용을 설명합니다.

Abstract

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박테리아 떼 운동성은 박테리아 공동체가 반고체 표면 위로 이동하기 위해 사용하는 일반적인 미생물 표현형입니다. 유도된 떼 떼 운동성에 대한 조사에서, 유도제의 특정 농도는 종으로부터 원하는 반응을 유도하기 위해 최적의 농도 범위 내에서 발생하는 사건을 보고할 수 없을 수 있다. 다중 농도를 함유하는 반고체 플레이트는 유도제 농도 범위 내에서 반응을 조사하기 위해 일반적으로 사용된다. 그러나, 분리된 반고체 플레이트는 불균일한 응고 시간으로 인해 각 플레이트 내의 중간 점도 및 수분 함량의 변화를 증가시킨다.

이 백서에서는 등각 방식으로 배열된 테스트 웰을 통해 다농도 반응을 동시에 획득할 수 있는 단일 구배 플레이트에서 표면 떼 운동성을 동시에 테스트하는 한 단계 방법을 설명합니다. 본 연구에서, 에스케리치아 콜리 K12 및 슈도모나스 aeruginosa PAO1의 표면 떼를 레스베라트롤 및 아라비노스와 같은 유도제의 농도 구배에 반응하여 평가하였다. 주기적으로, 떼 형태학은 이미징 시스템을 사용하여 전체 표면 떼 과정을 포착하기 위해 이미징되었습니다.

떼 형태학의 정량적 측정은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 획득하여 떼 영역의 분석 가능한 정보를 제공했습니다. 이 논문은 표면 떼에 대한 유도자의 효과에 대한 질적 및 양적 정보를 제공하는 간단한 구배 떼 플레이트 방법을 제시하며, 이는 더 넓은 범위의 운동성 박테리아 종에 대한 다른 유도제의 효과를 연구하기 위해 확장 될 수 있습니다.

Introduction

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박테리아 떼 운동성은 물질의 표면을 가로 질러 박테리아 세포의 집단적 이동을 말합니다. 실험실1에서 특별히 제조된 반고체 한천 플레이트 외에도, 이 표현형은 동물 조직2, 수화된 표면3 및 식물 뿌리4와 같은 일부 연질 기질에서도 관찰됩니다. 반고체 표면은 박테리아 떼의 기본 조건 중 하나로 간주되지만, 일부 종은 또한 떼를 지어 운동성을 지원하기 위해 에너지가 풍부한 배지가 필요합니다5. 편모 회전은 수영과 떼를 지어 운동성 수영을 모두 할 수있는 힘은 액체 환경 내에서 단세포 운동성을 묘사하는 반면, 떼를 지어 떼를 지어 반고체 표면을 가로 지르는 미생물 집단의 동시 이동입니다.

기질 점도는 박테리아 운동성에 영향을 미친다; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)와 같은 병원성 미생물에 대한 연구에 따르면 인간 숙주의 환경 산성화에 의해 영향을 받는 뮤신층 점도에 따라 병원균의 운동성이 변하는 것으로 나타났다6. 이러한 환경을 복제하기 위해 0.3 % ....

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Protocol

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1. 그라디언트 떼 플레이트의 제조

  1. 떼 배지의 제조
    참고: 다른 중간 점도의 간략한 비교를 위해 토론 섹션을 참조하십시오. 0.7% (w/v) 아가 떼 배지의 한천 농도가 이 프로토콜에 사용되었다.
    1. 두 개의 원뿔형 플라스크에 한천으로 Lysogeny 국물 (LB) 분말을 준비하십시오. 각 플라스크에는 트립톤 2g, 염화나트륨 2g, 효모 추출물 1g 및 한천 1.4g이 들어 있습니다. 이중 증류수 (ddH2O)를 첨가하고 자석 교반 막대를 사용하여 현탁액을 저어줍니다. 추가 ddH2O를 추가하여 최종 부피를 200 mL로 조정하십시오.
    2. 용액을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다. 공기 투과성 캡 또는 병 밀봉 필름을 공기 통풍구와 함께 사용하십시오.
      참고 : 한천은 오토클레이브에서 가열하면 용해됩니다.
    3. 온도가 65°C로 떨어지면, 균질성을 보장하기 위해 용액을 혼합하고, 배지를 65°C 인큐베이터 또는 수조로 옮겨 단기 사용을 위해 한다.
  2. 바닥층 떼 매질의 제조
    참고: 바닥층 배지는 떼 배지와 유도제 원액의 혼합물입니다. 유도제 구배 떼 플레이트의 제형을 표 1

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

구배 떼 플레이트의 준비, 예방 접종 및 배양으로 구성된 워크 플로우는 그림 1B에 나와 있습니다. 경사 수영 플레이트를 생성하기 위해, 바닥 층 매체를 수평면으로부터 ~4.3°로 프로핑된 접시에 붓고(보충 그림 S3), 바닥층이 완전히 응고된 후에 상층 매체를 부어준다. 이중층 매질의 조성은 표 1에 나타내었다. 이어서, 하룻밤 동안 배양된 박테리아 배양물은 시험 웰 내로 피펫팅되고, 37°C에서 인큐베이션되고, 적절한 수준의 습도를 유지한다. 여러 시험 농도는 두 개 또는 세 번의 반복실험이 있는 하나의 구배 떼 플레이트에 설정됩니다(그림 1C). 테스트 지점에 기둥 모양의 돌출부가 있는 덮개 뚜껑의 3D 인쇄 모델의 대체 옵션은 보충 그림 S1에 나와 있습니다.

두 개의 조작된 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

반고체 구배 플레이트에서 박테리아 떼 운동성에 대한 조사는 기판 점도, 습도 및 중간 성분과 같은 여러 요인을 포함하기 때문에 어려운 작업이 될 수 있습니다.18,19,20. 이러한 요인 중에서 한천 농도는 수영이나 떼 지어 운동성으로의 미생물 역전을 결정하는 데 결정적인 역할을합니다. 한천 농도가 0.3 % (w / v)에서 1 % (w / v)로 증가함에 따라 박테리아 수영 운동성이 제한되고 점차적으로 표면 떼로 이동하며 1 % (w / v) 이상의 한천 농도는 수영과 떼 지어 운동성을 모두 금지합니다7. 한천 농도는 다른 농도보다 더 나은 성능을 보였기 때문에 예비 실험을 기반으로 0.7 % (w / v)로 고정되었습니다.

이 한천 농도는 또한 이전에 미생물 화학주성.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기술의 개발은 과학 기술부의 국가 핵심 R & D 계획 (2018YF0902604), 국제 젊은 과학자를위한 중국 연구 기금 (22050410270)의 국립 자연 과학 재단 및 심천 첨단 기술 연구소 외부 기금 (DWKF20190001)의 기금으로 지원되었습니다. 우리는 문서 교정 및 실험실 관리에 도움을 주신 Chen Xinyi 양에게 진심으로 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSigma-AldrichV900500500 g
AmpicillinSolarbioA818025 g, ≥ 85% (GC)
원심분리기 튜브Corning43079015 mL
극저온 바이알Corning4304882 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)AladdinD103272AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose알라딘A10619598%(GC), 500g
페트리 접시BkmanB-SLPYM90-15플라스틱 페트리 접시, 원형, 90mm x 15mm
레스베라트롤알라딘R10731599%(GC), 25g
염화나트륨MacklinS805275AR, 99.5%(GC), 500g
정사각형 페트리 접시BkmanB-SLPYM130F플라스틱 페트리 접시, 정사각형, 13mm x 13mm
TryptoneThermo Scientific OxoidLP0042500 g
효모 추출물Thermo Scientific OxoidLP0021500 g
Equipments
Biochemical incubatorBlue pardLRH-70
Tanon 5200multi imaging systemTanon5200CE
온도 조절 물 목욕JinghongDK-S28

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).
  2. Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.

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Bacterial Swarming MotilitySurface SwarmingInducer Gradient PlatesSwarm Plate MethodSemisolid AgarChemotaxis AssayImageJ AnalysisEscherichia ColiPseudomonas AeruginosaSwarm Morphology

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