방법 논문

iNEXT-Discovery 및 Instruct-ERIC: 구조 생물학의 중개 연구를 위한 고급 서비스 통합

DOI:

10.3791/63435

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2021년 11월 16일

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1Division of Biochemistry and Oncode Institute, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, 2CERM/CIRMMP, University of Florence, 3Instruct-ERIC, Oxford University, 4MISTRAL beamline, Alba Light Source, 5Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Goethe University Frankfurt, 6Division of Structural Biology, Oxford University, 7Macromolecular Crystallographyy, Helmholtz-Zentrum Berlin

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Ahmad, M. U. D. et al. 단편 기반 리드 발견에서 스크리닝을 위한 나노 시차 주사 형광 측정법. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62469 (2021).

Barbieri, L., Luchinat, E. 높은 세포 밀도의 생물 반응기를 사용하여 실시간 정량적 세포 내 NMR로 인간 세포의 단백질-리간드 상호 작용 모니터링. 시각화 실험 저널: JoVE. (169), e62323 (2021).

Berg, H. et al. 최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝. 시각화 실험 저널: JoVE. (172), e62262 (2021).

Beriashvili, D., Schellevis, RD, Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. 고체 상태 NMR에 의한 자연 막의 단백질에 대한 고해상도 연구. 시각화 실험 저널: JoVE. (169), e62197 (2021).

Cornaciu, I. 외. 그르노블에 있는 EMBL HTX 시설의 자동화된 결정학 파이프라인. 시각화 실험 저널: JoVE. (172), e62200 (2021).

크로쇼, A. 외. VMXm 빔라인에서 미세결정을 위한 시료 전처리 파이프라인. 시각화 실험 저널: JoVE. (172), e62306 (2021).

Douangamath, A. et al. 다이아몬드 광원의 XChem 시설에서 효율적인 단편 스크리닝 달성. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62414 (2021).

Groen, J. 외. Cryo Soft X-ray 단층 촬영에 의한 세포의 3D 지도 제작. 시각화 실험 저널: JoVE. (169), e62190 (2021).

Horrell, S. et al. 다이아몬드 광원에서 대상 직렬 데이터 수집을 수정했습니다. 시각화 실험 저널: JoVE. (168), e62491 (2021).

Jiménez-Moreno, A. et al. scipion을 사용한 Cryo-EM 및 단일 입자 분석. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62261 (2021).

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. CryoElectron 단층 촬영을 위한 Saccharomyces cerevisiae의 준비 및 CryoFIB 미세 가공. 시각화 실험 저널: JoVE. E62351 (2021년).

Vyas, N. et al. 극저온으로 보존된 세포에서 극저온 구조 조명 현미경 데이터 수집. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62274 (2021).

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. 극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략. 시각화 실험 저널: JoVE. (169), e62383 (2021).

White, JBR 외. 단일 입자 초저온 전자 현미경 : 샘플에서 구조까지. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62415 (2021).

Wollenhaupt, J. et al. helmholtz-zentrum Berlin의 결정학 단편 스크리닝을 위한 워크플로우 및 도구. 시각화 실험 저널: JoVE. (169), e62208 (2021).

사설

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구조생물학 분야는 생체분자 구조의 원자적 세부 사항을 통해 생물학을 이해하는 강력한 시스템으로 발전하여 생화학적 경로와 질병의 분자 기초에 대한 이해를 풍부하게 하고 중개 연구에 없어서는 안 될 도구를 제공합니다.

수년에 걸쳐 구조 생물학은 정적 구조를 제공하는 것을 훨씬 넘어 용액과 세포 모두에서 분자 상호 작용에 대해서도 보고하고 시간 척도와 역학을 조사했습니다. 원자 및 개별 분자에서 전체 바이러스 입자 및 세포에 이르기까지 다양한 크기 척도의 프로세스를 설명하기 위한 정보를 얻을 수 있습니다. 다양한 기술은 X선, 중성자 또는 전자를 기반으로 하는 산란 방법(예: X선 결정학(MX) 또는 소각 X선 산란(SAXS)을 포함하여 시너지 효과를 발휘하는 일련의 실험적 접근법을 제공합니다. 고체 및 용액 핵 자기 공명(NMR); 극저온 전자 현미경(cryo-EM)에 의한 단일 입자 재구성. 극저온 EM 단층 촬영, 극저온 연질 X선 단층 촬영 및 세포 내 NMR과 같은 방법은 특히 다른 이미징 도구와 관련하여 거대분자 시스템을 연구하기 위한 접근 방식에 추가됩니다. 분자 상호 작용의 친화도 및 시간 척도에 대한 보완적인 정보를 제공하는 추가 생물 물리학적 방법과 함께 오늘날 통합 구조 생물학은 생명을 이해하고 약물, 생물학적 제제(항체, 나노바디, 백신), 생체 재료 및 플라스틱을 분해하고 환경을 돕는 데 사용할 수 있는 효소와 같은 기타 생물학적 제제를 개발하기 위한 강력한 패키지를 제공합니다.

초기에 유럽연합 집행위원회(EC)는 구조 생물학 연구가 사회에 미치는 이점을 인식했으며 1980년대부터 유럽은 값비싼 구조 생물학 장비를 더 큰 과학계에 무료로 개방하는 데 큰 투자를 했습니다. 수백만 유로 규모의 시설에 대한 접근의 민주화는 구조 생물학 분야를 국제적으로 발전시키는 원동력이자 초석이었습니다. 이로 인해 유럽은 이 분야의 최첨단에 서게 되었고, 이를 통해 강력한 산업 부문을 가능하게 하고 지역 경제에 기여했습니다.

EC는 구조 생물학 기술에 대한 외부 연구자의 접근 및 교육에 대한 길고 인상적인 전통을 소중히 여깁니다. 2019년 말까지 고급 시설과 모든 유럽 연구자들에게 구조 생물학 접근을 무료로 허용한 성공적인 iNEXT 프로그램(중개 연구를 위한 NMR, EM 및 X선 인프라)에 이어 Horizon2020 프로젝트 iNEXT-Discovery는 2020년 2월에 시작되어 구조 생물학 인프라에 대한 전액 자금 지원을 받을 수 있는 또 다른 4년 기간을 제공합니다. 동시에 Instruct-ERIC은 연구 인프라에 관한 유럽 전략 포럼의 랜드마크로, 유럽 및 국제 과학계를 위한 구조 생물학의 지속 가능한 거점을 구성합니다. 그들은 함께 생명 과학자와 다른 사람들을 구조 생물학 연구에 참여시키기를 열망하며, 이를 위해 학계와 산업계의 연구자 모두에게 전 세계 최고의 구조 생물학 전문 지식, 기술 및 시설에 대한 액세스를 제공합니다. 추가 파트너와 함께 워크숍 및 실습 교육도 조직합니다.

Covid19 팬데믹으로 인해 iNEXT-Discovery 및 Instruct-ERIC 연구 시설로의 이동이 크게 손상되어 실습 교육 기회가 본질적으로 금지되었습니다. 이를 부분적으로 보완하기 위해 iNEXT-Discovery와 Instruct-ERIC은 모두 웨비나 시리즈(https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function)와 Journal of Visualized Experiments의 특별 방법호를 준비했습니다. 여기에서는 몇 가지 주류 접근 절차뿐만 아니라 통합 구조 생물학 분야에서 개발 중인 특수 루틴에 대한 자세한 설명을 찾을 수 있습니다. 우리의 방법은 이번 호에서 자세히 설명되어 있지만 일부는 현지에서 확립하기 어려운 전문 지식과 장비가 필요합니다. Instruct-ERIC 및 iNEXT-Discovery 시설은 고도로 숙련된 현지 직원의 도움과 감독을 통해 구조 연구에 필요한 생체 분자 생산을 포함하여 이러한 방법을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

고분자 구조를 결정하기 위한 개선된 방법
지난 10년 동안 cryo-EM은 거대분자 복합 구조를 결정하는 데 매우 인기 있는 기술로 발전했습니다. 리즈 대학교(영국) 팀은 워크플로우 및 일반적인 문제 해결 중에 최적화할 수 있는 변수에 초점을 맞춰 단일 입자 EM 분석과 관련된 모든 단계에 대한 개요를 제공합니다1. 외부 사용자의 온라인 현미경 작동이 표준이 됨에 따라 효율적인 원격 작동 및 이미징을 위한 프로토콜이 필요합니다. 단일 입자 분석을 통해 유리화된 샘플을 이미지화하여 입자를 무작위 방향으로 보여주는 동영상을 생성합니다. 이미지 처리 워크플로는 연구 중인 표본을 재구성하기 위한 매개변수를 식별합니다. CSIC(ES)의 소프트웨어 Scipion은 이 워크플로우를 생성하는 데 필요한 모든 도구를 제공하며 결과의 간단한 추적성을 허용합니다2.

매우 작은 결정 샘플에 대한 X선 회절 데이터 수집은 기술적 과제뿐만 아니라 훌륭한 연구 기회를 제공합니다. Diamond(영국) 팀은 샘플 전후의 X선 경로에 진공을 포함하는 전용 빔라인 환경에서 데이터를 수집하기 전에 저소음 지지대에서 주변 액체를 최소화하면서 단일 그리드에서 수백 개의 마이크로크리스탈을 준비하는 cryo-EM 도구를 사용하는 방법을 제시합니다3. 싱크로트론의 직렬 X선 데이터 수집은 다른 어려운 결정 시스템을 연구하는 열쇠이기도 합니다. 또 다른 기여에서 Diamond는 일련의 예4를 통해 다양한 결정 전달 시스템을 사용하여 데이터 수집을 위한 단계별 지침, 그림 및 비디오를 보여줍니다.

신약 개발의 현대 통합 구조 생물학
X선 결정학은 단편 기반 약물 발견을 위해 잘 확립되어 있으며 이미 주요 후보에 원활하게 개발될 수 있는 히트를 식별하는 데 일반적으로 사용됩니다. Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin(DE) 및 MAX IV(SE)6, EMBL 그르노블 장치(FR)7 의 팀은 효율적인 표적 결정화, 단편 담금, 결정 장착, 결정학 기반 단편 스크리닝 및 구조 증착을 위한 워크플로우 자동화의 최신 개발에 대해 설명합니다. 그들의 파이프라인은 상당히 자동화되어 있으며 전 세계 외부 연구원들이 사용하고 있습니다. 그들은 추가 화합물 설계 및 구조 지원 리드 개발을 위한 히트를 식별하기 위해 이미 100개 이상의 표적(종종 원격)에 적용되었습니다.

NMR은 또한 용해성 또는 막 결합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하는 약물 개발 캠페인의 단편 스크리닝에도 일반적으로 사용됩니다. 프랑크푸르트(DE)의 괴테 대학교는 최적화된 NMR 스크리닝 파이프라인을 제공하여 실험 및 분석 중 수동 개입을 줄입니다8. 시료 교환기는 며칠 동안 중단 없는 실험 및 자동 분석 기간 동안 한 번의 실행으로 수백 개의 NMR 시료를 처리합니다.

또한 생물물리학적 방법은 X선 및 NMR을 보완합니다. 네덜란드 암 연구소(NL)의 팀은 단편 9 첨가 시 목표 용융 온도의 변화를 측정하기 위해 열 이동 분석을 위한 나노 시차 주사 열량계를 사용하는 워크플로를제시합니다. 단백질 품질 및 농도에 관한 전제 조건 다음에는 실험 설계, 데이터 수집 및 분석을 위한 분석 프로토콜이 뒤따릅니다.

세포 구조 생물학을 향하여
극저온 전자 단층 촬영은 종종 세포의 거대분자 복합체를 조사하기 위해 선택되는 방법입니다. 유리화된 샘플의 이미지를 다양한 기울기 각도로 획득하고 3D 단층 촬영을 재구성하여 하위 볼륨을 추출하여 하위 단층 촬영 평균화를 통해 더 높은 해상도를 제공합니다. 전자는 물질과 강하게 상호 작용하기 때문에 이러한 연구에는 두께가 200nm 미만인 표본이 필요합니다. CEITEC 팀(CZ)은 플런지 동결 후 세포 라멜라를 준비하기 위한 프로토콜10 을 제시합니다. cryo-ET의 자동화가 눈에 띄는 진전을 이루었음에도 불구하고 틸트 시리즈 획득이 이루어지기 전에 몇 시간의 데이터 수집이 필요하며 일반적으로 시각적 그리드 검사를 통해 대상을 식별합니다. EMBL Heidelberg(DE)는 그리드 및 그리드 사각형을 매핑하고, 대상을 선택하고, 틸트 시리즈 획득을 설정하기 위해 자동화 프로토콜을 준비했습니다11.

ALBA(ES)와 다이아몬드 싱크로트론은 온전한 세포를 검사할 수 있는 극저온 EM 단층 촬영의 대안, 즉 극저온 연질 X선 단층 촬영(cryo-SXT)의 함정과 장점에 대해 함께 논의합니다12. 극저온에 초고해상도 기술을 적용하면 cryo-ET 및 cryo-SXT와의 상관 이미징이 가능합니다. 또한 고처리량 극저온 구조 조명 현미경(cryo-SIM)은 기존 형광의 분해능을 두 배로 높여 두꺼운 샘플에서 분자 또는 구조의 특정 위치를 파악합니다. 이것은 세포 컨텍스트 내에서 특정 특징을 정확히 찾아내기 위해 cryo-SXT와 상관 관계될 수 있습니다13.

위트레흐트 대학교(NL) 팀은 천연 막 및 단백질-지질-글리칸 시스템을 포함한 까다로운 생리학적 시스템을 연구하는 데 사용할 수 있는 샘플 준비 및 고감도 고체 NMR 실험을 보고합니다14. 또한 세포 내 솔루션 NMR은 기능적 과정을 밝히기 위해 빠르게 발전하고 있습니다. CERM/CIRMMP(IT) 팀은 고자기장 자석의 코어에 있는 NMR 프로브 내부의 살아있는 세포에 영양분과 산소를 보충할 수 있는 생물 반응기를 조립하고 작동하는 방법을 설명합니다15. 이를 통해 확장 된 측정 및 시간 분해 실험 (예 : 세포 내 단백질 - 리간드 상호 작용을 모니터링하기 위해) 이 가능합니다.

맺음말
이 JoVE 호는 유럽 연구 인프라의 최근 구조 생물학 개발 및 응용에 전적으로 전념하고 있습니다. iNEXT-Discovery와 Instruct-ERIC을 함께 사용하면 구조 생물학 전문가뿐만 아니라 점점 더 많은 비전문 생명 과학자 및 기타 연구자가 최첨단 서비스를 제공하여 연구 목표를 추구할 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 JoVE Methods Collection 문제는 유럽연합 집행위원회의 Horizon 2020 프로그램에서 자금을 지원하는 프로젝트 번호 871037인 iNEXT-Discovery에서 자금을 지원합니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62415(2021).
  2. Jiménez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with scipion. Journal of. Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  3. Crawshaw, A., et al. A sample preparation pipeline for microcrystals at the VMXmbeamline. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62306(2021).
  4. Horrell, S., et al. Fixed target serial data collection at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62491(2021).
  5. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at XChemfacility at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62414(2021).
  6. Wollenhaupt, J., et al. Workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum Berlin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62208(2021).
  7. Cornaciu, I., et al. The automated crystallography pipelines at the EMBL HTX facility in grenoble. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62200(2021).
  8. Berg, H., et al. NMR-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62262(2021).
  9. Ahmad, M. U. D., et al. Nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62469(2021).
  10. Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and CryoFIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for CryoElectrontomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e62351(2021).
  11. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62383(2021).
  12. Groen, J., et al. A 3D cartographic description of the cell by cryosoft X-ray tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62190(2021).
  13. Vyas, N., et al. Cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62274(2021).
  14. Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. High-resolution studies of proteins in natural membranes by solid-state NMR. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62197(2021).
  15. Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring protein-ligand interactions in human cells by real-time quantitative in-cell NMR using a high cell density bioreactor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62323(2021).

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