표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

테더린 관련 항바이러스 활성은 인터페론-α에 의해 유도되고, 단백질 기반 테더를 포함하며, 이는 감염된^{세포 표면 1}에 완전히 형성된 비리온의 보유를 유도한다. 바이러스 방출 억제에서 테테린 글리코실화의 필요성은 여전히 불확실하며, 이는 (인플루엔자 바이러스의 경우) 표면 발현 인플루엔자 헤마글루티닌 HA^3,4의 형태에 의존하는 시험관 내 연구 ^1,2를 위한 재조합 발현 글리칸에 대한 글리코실화 패턴의 중요성을 암시합니다. . N-결합 글리코실화에 묶인 올리고당의 변형은 HIV 유형-1 방출²의 테더린 매개 제한에 충분하며, 이량체화는 바이러스 방출을 방지하는 데 필수적인 역할을 하며, 이에 따라 막횡단 도메인 또는 글리코실-포스파티딜-이노시톨(GPI)-앵커를 수반하여 신진 비리온을 테더링하는 것으로 나타났습니다^.5 . 인간 및 쥐 테더린이 여러 외피 바이러스, 레트로바이러스 및 필로바이러스를 차단하는 고유한 특징이 설명됩니다. BST-2 / 테더 린은 광범위한 항 바이러스 활성으로 작용하는 선천성 면역 ^1,6의 인터페론 유도 항 바이러스 단백질이며 외피 당 단백질⁵에 의해 길항되어 테 테린을 전위하거나 테더^{린 6}의 구조를 파괴합니다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 상의 표면-발현된 외피 당단백질 HA 및 뉴라미니다제는 균주-특이적 방식으로⁷ 테더린 길항작용에 대해 잘^{알려져 있으며,} 숙주 수용체 결합 부위8의 인식을 용이하게 한다. 글리칸 표적 항체는 HA에서 빠르게 맞춤화되는 글리칸 차폐와의 상호 작용의 화학량론에서 연구되어 인플루엔자 A H3N2 및 H1N1^아형에 대한 결합 친화도를 초래합니다4.

항바이러스제와 바이러스 외피 스파이크, 즉 탄수화물 리간드, 및 상보적인 면역학적 및 분광학적 방법 사이의 결합 메카니즘을 밝히기 위해, 모노-, 디- 및 트라이-만노스 잔기가 화학적으로 합성된다. 만노실화된 펩티드는 생명을 위협하는 바이러스의 표면에서 전형적으로 발견되는 N-아세틸글루코사민 및 고만노스 올리고당을 모방하여 1,2-트랜스 글리코실 아지드⁹로 형질전환된 글리코실 {베타}-퍼아세테이트의 아지도글리코실화를 통해 생성됩니다. 트리아 졸 생물 동위 원소는 HA 펩티드¹⁰의 만노 실화 잔기를 형성하는 결합을 모방하고 HA 헤드 도메인 (4 개의 N- 결합 글리 칸 N54, N97, N181, N301)의 두 번째 N- 결합 글리코 실화 스팟 주위의 항 바이러스 CV-N 유도체와의 부위 특이 적 상호 작용을 촉진하는 데 사용됩니다 (4 개의 N- 연결된 글리 칸 N54, N97, N181, N301)^8,11,12 . 글루탐산 (Glu)과 아르기닌 (Arg)과 결과 나선 쌍극자 사이의 상호 작용은 모델 펩타이드와 단백질 모두의 우수한 안정성을 나타내지 만 SPR을 사용하여 시각화됩니다. 글리칸 모이어티 상의 수용체 결합을 직접 억제함으로써^HA10 상의 단일 화학적으로 합성된 글리코실화 부위를 인식하는 것과 비교하면, 그의 수용체에 대한 4-부위 돌연변이된 Fc 구조의 더 높은 친화도는 생체내에서 이펙터 기능을 유도하는 것으로 나타나서, Fc 돌연변이체에 부착된 N-연결된 글리칸의 무관한 조성이 기계적으로 결정됨을 나타낸다(¹³).

CV-N은 HIV 14,15, 인플루엔자¹⁶ 및 에볼라 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 나타내며, 이는 외피 스파이크 단백질^12,17,18,19의 고 만노스 올리고당 변형에 대한 나노 몰 결합에 의해 매개됩니다. CV-N 또는 공유 결합 이량체 CVN2에서 2개의 Hs에서 하나의 고친화성 탄수화물 결합 부위(H)에 결합하는 인플루엔자 HA는 각각 평형 해리 상수(KD) = 5.7nM(도 1A)_{및 KD =} 2.7nM을 갖는 것으로 결정된다. CV-N 및 CVN2 모두는 또 다른 하나 또는 두 개의 저친화성 탄수화물-결합 부위 (L)s 12,17,20,21을 보유한다. 에볼라 GP1,2는 낮은 나노 몰 범위_{(KD =} 26 nM)의 친화력으로 CVN2의 2H에 결합합니다. 에볼라 GP1,2 및 HA에 대한 CV-N WT 결합은_KD = 34 nM_{내지 KD =} 5.7 nM (A/New York/55/04)¹²에서 친화도를 나타낸다. 바이러스 외피의 높은 만노스 글리 칸을 특이 적으로 표적으로하는 CV-N과 같은 렉틴은 C 형 간염 바이러스, SARS-CoV, 헤르페스 바이러스, 마르부르크 바이러스 및 홍역 바이러스²²의 복제를 추가로 억제합니다.

작은 CV-N 분자는 바이러스 유입을 억제하기 위해 광범위한 바이러스에 결합하는 기능을 하기 때문에 20년 이상 철저히 연구되었습니다^16,18. 구조 분석 및 결합 친화도 분석은 바이러스 외피 당단백질^10,19에 대한 결합력을 향상시키기 위해 마이크로몰 범위의 2가 결합에 의해 도메인-스왑된 CVN2 이량체에서 2개의 L의 가교결합을 나타냅니다. Man(8) D1D3 팔과 Man(9)에 대한 Manα1-2Manα의 선택적 결합은 반대쪽 단백질 프로토머(²⁰)에 위치한 상이한 친화도의 두 결합 부위를 구성하여 나노몰 결합 친화도에 도달합니다(그림 1B). 따라서, CVN2는 바이러스-중화 항체¹⁷과 유사하게, HIV gp120 상의 에피토프에 결합하는 그의 적용에 관한 유사-항체로 간주된다. 여기에서 저자는 수용체 결합 도메인(RBD)을 통해 SARS-CoV-2 스파이크에 대한 CVN2의 잠재적 결합을 조사하는 데 관심이 있습니다. SARS-CoV-2 RBD와 고정화된 인간 안지오텐신 전환 효소(ACE)-2의 결합 곡선은 이러한 생물학적으로 관련된 결합 상호작용에_{대해 KD =} 4.7nM을 초래합니다²³.

대조적으로, 선택된 면역글로불린 부류는 특이적이고 일관된 구조 단백질 패턴을 인식하며, 이는 막-앵커링된 HA 영역(²⁴)에서 친화성 성숙을 위한 기질을 부여한다. CV-N은 거의 모든 인플루엔자 A 및 B 바이러스¹⁶에서 매우 강력한 활성을 나타내며 광범위하게 중화하는 항 바이러스제입니다. 우리의 지식은 고도로 중화되는 항체에 의한 글리칸 표적화를 위한 에피토픽 구조를 포함할 수 있는 HA1 및 HA2의 줄기 상의 표적화된 에피토프의 위치와 렉틴 결합²⁵와 비교하여 불완전합니다.

그림 1: 바이러스 엔벨로프 스파이크에 대한 CV-N에 대한 SPR 결합 분석의 개략적 표현. (A) 리간드에 대한 CV-N 결합에 대한 SPR 분석: HA 전장 단백질(90kDa). 인플루엔자 HA A/New-York/55/04 (H3N2)에 대한 실시간 이중 참조 결합을 보여주는 운동 데이터 세트 (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM). (b) 500 nM 내지 16 μM의 농도 범위 내에서 고정화된 리간드 DM에 결합하는 CVN2L0 변이체 V2. 서열: L 잔기는 노란색으로 강조 표시된다. H 잔류물은 회색으로 강조 표시됩니다. E58 및 R73은 야생형 단백질의 시스테인을 대체하며 V2를 4 개의 이황화 결합 대신 3 개의 이황화 결합으로 안정적인 단백질 폴드로 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

막-원위 HA 상부 상의 글리칸 차폐물이 CV-N(12)에 대한 고-친화성 결합을 유도하는 반면, HA 상부 부분의 이황화 브릿지에 인접한 HA에 대한 CVN2 결합은 그의 저친화성 부위(^10,12)에서 추가로 관찰되었다. 다양한 극성 상호작용 및 상호작용 부위가 CV-N에 의한 탄수화물 결합에서 확인된다. 이러한 상호작용은 결합 친화도를 인실리코예측된 글리코실화¹²에 상관시키기 위해 결합 부위에 녹아웃 변이체를 생성함으로써 검증된다. 따라서 이 프로젝트는 이전에 테스트한 화학적으로 만노실화된 HA 펩타이드를 결합 친화도 및 특이성에서 SARS 관련 2019-nCoV 스파이크 및 SARS-CoV-2의 짧은 펩타이드 서열과 비교하는 것을 목표로 합니다. Pinto와 동료들은 초저온 전자 현미경 및 결합 분석을 사용하여 수용체 부착 309와 경쟁하지 않고 Sarbecovirus 아속 내에 보존된 글리칸을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 에피토프를 잠재적으로 인식하는 단클론 항체^S26을 보고합니다. 이 연구의 프로토콜은 CV-N 및 CVN2가 SPR 기술^10,12를 사용하여 글리코 실화 단백질 및 합성 만노실화 펩타이드에 결합하는 방법을 연구하는 데 CV-N 변이체를 설계^, 발현 및 특성화하는 것이 얼마나 중요한지 설명합니다.

탠덤-연결된 이량체 CVN2L0²⁷ 및 결합 부위 변이체 (V2-V5)는 재조합적으로 발현되고, 변이체는 이황화 결합 치환 (C58E 및 C73R)을 갖는다(도 2A). 또한, 단일 점 돌연변이 E41A를 갖는 돌연변이는 이 위치가 분자간 교차 접촉 잔기로 간주되었기 때문에 제조된다. 이 돌연변이는 결합 도메인을 해독하는 렉틴과 고만노스 올리고당 사이의 SPR 결합 측정을 위한 또 다른 흥미로운 분자이며 이량체 형태와 비교할 수 있습니다. CVN2의 도메인 스왑 결정 구조는 49 내지 54 잔기 사이에서 확장되는 유연한 링커를 나타낸다. 두 도메인은 경첩 주위를 강체로 계속 이동할 수 있으며, 분자 내 도메인 상호 작용을 통해 단량체를 개발할 수 있습니다 (도메인 A- 잔기 1-39; 90-101-와 도메인 B- 잔기 40-89) 또는 분자간 도메인 스왑에 의한 이량 체 [도메인 A (첫 번째 단량체의) 도메인 B (두 번째의) 및 도메인 B (첫 번째 단량체의) 도메인 A (두 번째 사본)]. Glu41²⁸을 제외하고는 두 프로토 머의 A 및 B 도메인 사이에 밀접한 상호 작용이 없습니다. CV-N에 대한 유전자는 40-mer 합성 올리고 29를 갖는 반복적 인 PCR 방법을 사용하여 개발 될 수 있으며, 이어서 Keeffe, ^J.R.27에 의해 설명 된 바와 같이 전기 적격 세포로의 형질 전환 (전기 천공)을 위해 pET11a의 NdeI 및 BamHI 부위로 서브 클로닝된다. 각각의 결정 구조 (PDB ID 3S3Y)를 달성하기 위해 사용되는 단백질은 N- 말단 6- 히스티딘 정제 태그와 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 부위 지향 돌연변이 유발은 점 돌연변이를 만들고, 코돈을 전환하고, 아미노산 교환을 위해 단일 또는 다중 염기 또는 코돈을 삽입 또는 삭제하는 데 사용됩니다. 이러한 변형은 단백질 기능과 구조에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 재조합 발현 및 정제된 CV-N, CVN2 및 CVN3은 생물물리학적으로 잘 연구되어^20,21,27, 생산 비용이 저렴하므로 SPR 센서 칩에 고정화된 글리칸에 대한 결합 분석을 특성화하는 데 사용됩니다. 기존의 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)은 글리 칸 리간드의 고정화 기술과 관련하여 재현성이 떨어지고 SPR에 대해 표시된 다양한 결합 부위 변이체의 실시간 결합을 종말점 분석으로 변환합니다.

결합 친화성 변이체 CVN2L0-V2 (이황화 브릿지 치환¹⁰을 갖는 동종이량체 CV-N의 무손상 폴드)를 대장균 (E. coli)에서 His-태그로 발현하고, 친화성 크로마토그래피를 적용하여 Ni-NTA 컬럼 상에서 정제하고, SPR을 사용하여 HA (H3N2), 모노만노실화된 HA-펩티드 및 디만노실화된 HA-펩티드에 대한 결합에 대해 시험한다. 화학적으로 만노실화된 펩티드, 또는 HA 및 S 단백질은 모두 친수성 칩 표면에 결합된 리간드 및 아민이다. 반응성 에스테르 또는 비오틴-스트렙타비딘 단백질 공학을 통해. 순차적 실행의 동일한 절차가 이들 리간드에 적용되어, CV-N의 다양한 희석물 및 CV-N(및 CVN2)의 변이체를 주입하여 후술하는 바와 같이 분자 상호작용 분석을 위한 동역학 정보를 수득한다(³⁰). RBD 고정 SPR 센서 칩은 CV-N과 S 펩타이드에 대한 결합 연구에 사용되며 친화도는 인간 ACE2와의 SARS-CoV-2 결합과 비교됩니다.

본 연구에서는 CVN-소형 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 융합 단백질이 CV-N 대신 효소 결합 면역흡착 분석에 사용되었으며 세포 기반 분석에 적합합니다. 재조합 전장 인플루엔자 A 바이러스 HA H3 단백질은 표준 프로토콜¹²에 따라 상업적으로 수득되거나 포유동물 HEK293 세포주 및 바쿨로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 발현된다. 우한-1 스파이크 단백질은 포유류 HEK293 세포에서 발현됩니다. 모노 만노실화 펩타이드 (MM) 및 디 만노실화 펩타이드 (DM)의 합성은 CVN2 및 모노 만노실화 된 소분자¹⁰에 대한 균질 리간드의 검출을 허용한다.

1. CV-N 구문 만들기

1. CVN2 변이체 및 CVN2L0 단백질 (PDB ID 3S3Y) 각각에 대해, 상업적 공급원으로부터 pET27b (+) 벡터에서 N- 말단 pelB 리더 서열 및 His- 태그를 갖는 유전자 작제물을 얻는다 ( 재료 표, 보충 파일 1 참조).
2. CVN2L0 및 그 변이체(V2, V3, V4 및 V5; 그림 2A,C)는 각 CV-N 반복에 대해 두 개의 별개의 DNA 서열로 구성된 CVN2L0 주형 유전자의 배경입니다.
3. 동결건조된 플라스미드 DNA를 멸균 탈이온증류수(_ddH2O)에 최종 농도 100ng/μL까지 용해시킨다.

2. 플라스미드 DNA 형질전환 세포를 이용한 LB-한천 플레이트의 제조

1. _ddH2O(재료 표 참조)에 펩톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 5g/L를 용해시켜 배양액 LB-레녹스를 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 이전에 발표된 보고서¹⁰에 따라 화학적 방법에 의해 각 변이체(V2-V5)에 대해 유능한 대장균 BL21(DE3)로의 변환을 수행합니다.
2. 용액(900μL 및 100μL)을 분할하고 LB-한천 플레이트(50μg/mL 카나마이신)에 100μL를 옮기고 멸균 세포 스프레더를 부드럽게 사용합니다. 한천 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.

3. 복제

1. CV-N에 대한 유전자를 pET11a의 NdeI 및 BamHI 부위( 재료 표 참조)로 서브클로닝하여 참고문헌²⁷에 따라 전기적격세포로 형질전환(전기천공)합니다.

4. 부위 지향 돌연변이 유발

1. CVN2L0²⁹ 및 돌연변이체 CVN-E41A를 각각의 CV-N 반복(²⁷)에 대해 2개의 구별된 DNA 서열을 함유하는 CVN2L0 주형 유전자의 배경에서 생성한다.
2. PCR³¹을 실행하기 위해 부위-지시된 돌연변이유발 키트(재료 표 참조) 및 특이적 돌연변이원성 프라이머 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' 및 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3'을 사용하여 돌연변이를 만듭니다.
   1. 5-50 ng 범위의 다중 농도의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 주형(예: dsDNA 주형 5, 10, 20 및 50ng)을 사용하여 일련의 샘플 반응을 시작합니다. 프라이머 농도를 일정하게 유지하십시오.
      참고: PCR 믹스 및 열 사이클링 프로토콜은 일반적으로 부위-지시 돌연변이유발 키트(³²)에 대한 사용 설명서에 기재된 바와 같이 사용된다.
3. 광유 오버레이 아래에 Dpn I 제한 효소(1μL, 10U/μL, 재료 표 참조)를 추가합니다. 철저하고 부드럽게 반응을 혼합하고, 탁상용 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 스핀다운하고, 즉시 37°C에서 1시간 동안 배양하여 부모 슈퍼코일 dsDNA를 소화합니다.

5. 박테리아 세포의 형질 전환

1. XL1-Blue 초적격 세포( 재료 표 참조)를 얼음에서 부드럽게 해동합니다. 각 대조군 및 샘플 반응을 변환하기 위해 초적격 세포(50μL)를 사전 냉각된 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브(14mL)에 분취합니다.
   1. 각 대조군으로부터 1μL의 Dpn I 처리된 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 옮기고 샘플 반응(돌연변이된 ssDNA)을 상보적인 가닥을 합성하는 초적격 세포의 분취량을 분리합니다. 변형 반응을 조심스럽게 소용돌이 치며 반응을 혼합하고 얼음에서 30 분 동안 배양합니다.
      참고: Dpn I-처리된 DNA를 형질전환 반응으로 옮기기 전에 피펫 팁에서 남아 있는 미네랄 오일을 조심스럽게 제거하는 것이 좋습니다. 선택적 대조군으로, 0.1ng/μL의 pUC18 대조군 플라스미드(1μL)를 초적격 세포의 50μL 분취량과 혼합하여 XL1-Blue 초적격 세포의 형질전환 효율을 확인해야 합니다.
2. 42°C에서 45초 동안 변환 반응에 열 펄스를 적용한 다음 반응물을 얼음에 2분 동안 놓습니다.
   알림: 적용된 열 펄스는 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브(14mL)에서 언급된 조건에 맞게 이미 최적화되었습니다.
3. 0.5mL의 NZY+ 액체배지(리터당 함유: 10g의 NZ 아민(카제인 가수분해물), 5g의 효모 추출물, 5g의 NaCl, 12.5mL의 1M_MgCl2, 12.5mL의 1M MgSO4, 10mL의 2M 포도당, pH 7.5, 42°C로 예열됨)을 첨가하고, 225-250rpm에서 1시간 동안 진탕하면서 37°C에서 형질전환 반응을 배양한다. 각 형질전환 반응의 정확한 부피(대조군 플라스미드 형질전환에서 5μL, 시료 형질전환에서 250μL)를 LB-암피실린 한천 플레이트에 플레이팅합니다.
   참고: 형질전환 제어 및 돌연변이 유발을 위해 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(X-gal, 80μg/mL) 및 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG, 20mM)가 있는 LB-암피실린 한천 플레이트에 세포를 퍼뜨립니다( 재료 표 참조). 50mL의 세포 배양물에 형질전환된 E의 단일 콜로니를 접종합니다. 분석을 위해 돌연변이된 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 대장균 세포. 돌연변이 유발은 외부 시설에서 DNA 시퀀싱에 의해 확인됩니다.

6. 발현 및 단백질 정제

1. 대규모 배양의 경우, 소량의 LB (암피실린 함유)를 형질 전환 된 플레이트의 단일 콜로니에 접종하십시오.
2. 하룻밤 배양물을 이용하여, 발현 배양물에 첨가제, 예컨대 10 mM의_MgCl2, 10 mM의 MgSO4 및 20 mM의 글루코스를 접종하여, 종자 배양물을 1/100로 희석하였다.
   1. 37 ° C에서 격렬한 흔들림으로 세포를 성장시킵니다. 세포를 600°C로 냉각하기 전에 0.4-0.6(중간 로그 단계) 사이의 Abs 20nm로 세포를 성장시킵니다. 1 mM IPTG로 유도하고 밤새 성장시킨다.
   2. 이어서, 4°C에서 15분 동안 4,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확하고, 피펫으로 상청액을 버린다.
3. 세포 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 재현탁하고 4,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 다시 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 상청액을 버립니다. 남은 펠릿을 10mL의 용해 완충액에 재현탁하고 현탁액을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 용해 완충액의 조성: (50 mM의_NaH2PO4, 300 mM의 NaCl, 2% 트리톤-X100, 500 ng/mL의 리소자임, 1 mM의 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), 1mM의 디티오트레이톨, 1mM의 _MgCl2, pH 8, 재료 표 참조).
   1. 혼합물을 2회의 동결-해동 사이클(-80°C)에 적용한다. 4°C에서 15분 동안 4,000 x g에서 원심분리하여 가용성 및 불용성 분획을 분리하고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 특히 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-PAGE³³을 사용하여 분석합니다(그림 2B,C).
      참고: 세포는 동결-해동, 초음파 처리, 균질화, 효소 용해 또는 이러한 방법의 조합과 같은 여러 가지 방법으로 용해될 수 있습니다. 봉입체로부터의 정제는 높은 단백질 수율²⁶을 수집하는 데 권장됩니다.
4. Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제합니다( 재료 표 참조). 가용성 분획을 재생된 Ni-NTA 비드 컬럼(1mL/분)에 로드합니다. 그래디언트(TBS 중 0-100% 500mM 이미다졸)를 시작하기 전에 TBS 완충액(50mM 트리스, 150mM 염화나트륨, pH 7.5)으로 시스템을 세척하고 분획(1mL/분)을 수집합니다. 생화학적 특성 분석을 위해 정제된 단백질을 100mM PBS에 대해 투석합니다(그림 2C, D).
5. 대안적으로, 14 mL 튜브에서 His-Select Ni2⁺ 친화성 겔( 재료 표 참조)을 사용하여 각각 20 mM 이미다졸 및 250 mM 이미다졸을 갖는 완충 용액에서 그의 태그된 재조합 발현 CV-N을 결합하고 재현탁시킨다. 최소 30분 동안 일괄 배양합니다.
   참고: 이러한 반정제 단백질을 완충액 교환 및 생물학적 시료(예: 탄수화물 및 단백질)의 정화를 위해 일회용 사전 포장 컬럼에 적용하면 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에서 1-1.5mL 용리액을 로드할 수 있습니다.
6. 단백질 용액을 10kDa 차단 필터( 재료 표 참조)를 사용하여 원심분리 튜브로 옮기고 4,500 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 농축합니다. SPR 측정을 위해 분석물 용액을 10mM HEPES, 150mM 염화나트륨, 3mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 0.05% 트윈20, pH 7.4(HBS-EP(+, 재료 표 참조)로 교환합니다.
   1. 이 SPR 실행 버퍼를 1:10의 희석 계수에 추가하고 4,500 x g 및 4 ° C에서 10 분 동안 초기 부피에 4 회 원심 분리합니다.
7. 23,474 Da³⁴의 크기를 나타내는 주 단백질 CVN2L0에 대해 계산된 흡광 계수(20,440 M-1 cm-1)를 기반으로 NanoDrop ^UV-Vis 분광 광도계(재료 표 참조)를 사용하여 280nm에서 단백질 농도를 결정합니다. PBS(100mM, pH 7.0) 또는 SPR 완충액을 블랭크로 사용하고 3단계 희석(1:1, 1:10 및 1:100)에서 단백질 농도를 측정합니다.

그림 2: CV-N 시퀀스 및 발현. (a) 각 CV-N 반복 (각각 101개 아미노산) 및 4개의 디술피드 브릿지 사이에 링커가 없는 CVN2는 E에서 pET11a 벡터로 발현된다. 대장균. (B) CV-N (단량체) 및 CVN2 (이량 체)에 대한 두 개의 독립적 인 콜로니의 발현. (c) 이황화 결합 변이체를 정제하고 SDS-PAGE 상에서 분석한다. 저분자량 마커(6μL)가 기준으로 사용됩니다. WT = CVN2L0 (A)에 표시된 4 개의 이황화 다리를 베어링. V2는 위치 58 및 73에서 극성 잔기로 치환된 디술피드 결합을 갖는 변이체이다. V3-V5는 2개의 나머지 S-S 결합과 아미노산을 치환하는 극성(C58E-C73R) 또는 비극성(C58W-C73M) 또는 이들 잔기 쌍 치환의 조합을 갖는 변이체이다. (D) 정제 된 CVN2L0의 HPLC 크로마토 그램은 30 분에 걸쳐 완충액 A에서 5 % -65 % 완충액 B의 선형 구배로 1mL / 분의 유속으로 용리됩니다. 완충액 A는 ddH₂O 중 0.1 % (v / v) 트리 플루오로 아세트산, 완충액 B는 아세토 니트릴 중 0.08 % (v / v) 트리 플루오로 아세트산입니다. 단백질은 214nm 및 280nm의 고성능 실리카겔 300-5-C4(150 x 4.6mm) 컬럼에서 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. SPR 분광법

1. 재생 버퍼로 실행 버퍼 HBS-EP(+) 및 10mM 글리신 HCl pH 1.5-1.6과 함께 듀얼 채널 SPR 시스템( 재료 표 참조)을 사용합니다. 기기, 탈기 장치, 자동 샘플러 및 펌프를 켜고 ddH₂0으로 전체 시스템을 1 시간 동안 세척하십시오. 바로 사용할 수 있는 실행 버퍼를 별도의 병에 넣습니다.
2. 검출기에 에머젼 오일을 떨어뜨리고 얇은 금 필름으로 코팅되고 상부에 카르복시메틸덱스트란 하이드로겔로 기능화된 유리 센서 칩( 재료 표 참조)을 3포트 플로우 셀 아래의 검출기에 직접 장착합니다. 핸들링을 아래로 당겨 설정을 수정합니다.
   참고: C19RBDHC30M 200nm 스트렙타비딘 유도체화 카르복시메틸덱스트란 하이드로젤은 중간 밀도의 비오티닐화 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2 RBD 단백질로, 미리 고정된 리간드가 있는 즉시 사용 가능한 센서칩입니다.

8. HA, S 단백질 및 RBD에 대한 CV-N 결합을 위한 SPR 결합 분석

1. 단백질성 리간드를 아래 단계에 따라 센서 칩에 고정합니다.
   1. 메뉴 표시줄에서 양식을 클릭하고 통합 SPRAutoLink 소프트웨어에서 테이블 편집기를 실행하여 실행 테이블을 엽니다( 재료 표 참조). 사용 가능한 실행 테이블 목록에서 BASIC_Immobilization 선택하고 클릭하고 컴퓨터 화면에서 실험 절차의 단계를 따릅니다. 사용된 각 샘플 편집기가 오른쪽 상단 모서리에 표시됩니다.
   2. 양식 섹션에서 샘플 세트 편집기를 클릭하여 추가 분석을 위해 자동 샘플러에 배치된 두 랙에 대한 시약 목록을 작성합니다. 메뉴 막대에서 Autosampler Direct Control 을 "도구"로 클릭하여 랙을 앞으로 또는 집으로 가져옵니다. 작동 온도로 4°C를 선택합니다.
      알림: SPR 소프트웨어는 해당 도구를 선택하고 자동 시료 주입기를 처리하고 양식을 클릭하여 "SPR 기기 직접 제어" 및 "펌프 직접 제어"를 허용합니다. 또한 테이블 편집기 실행, 데이터 플롯 또는 사후 처리를 선택하여 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 파일은 기본 디렉토리에 직접 저장되고 포스트 프로세싱 창에서 scrubber.files로 내보내집니다.
2. 도구 및 펌프 직접 제어를 클릭하여 ddH₂0을 주입하도록 펌프를 시작하고 SPR 기기 직접 제어를 클릭하여 데이터를 기록하고 새로 나타나는 창에서 시작할 때마다 시작합니다. 커플링 시약(단계 8.3)을 300μL 바이알에 넣고 오토샘플러 랙에 넣고 실행을 클릭하여 실행 테이블을 시작합니다.
   참고: 칩 표면은 10mM 글리신 완충액 pH 9.0으로 컨디셔닝되거나 EDC/NHS 활성화 믹스³⁰을 위한 카르복실 유도체화된 칩 표면을 컨디셔닝하기 위해 1M 염화나트륨, 0.1M 붕산나트륨 완충액 pH 9.0으로 플러시되었을 수 있습니다.
3. 이 간단한 단백질-단백질 상호작용을 위해 CMD500D 칩( 재료 표 참조)을 사용하여 HA가 고정화된 마이크로 굴절률 단위(μRIU) = 2500 - 3000 플로우 셀과 스파이크 단백질이 있는 μRIU = 400 플로우 셀을 생성합니다. 15 μL / min의 주입 유속으로 0.4 M N- 에틸 -N'- (디메틸 아미노 프로필) 카르 보디 이미드 하이드로 클로라이드 (EDC * HCl)와 0.1 M N- 하이드 록시 숙신이 미드 (NHS)의 수성 및 동등한 혼합물을 주입합니다.
   1. 25,000 μL/min의 리필 펌프 리필, 30초 동안 기준 조정을 수행하고, 6분 접촉 시간 동안 90μL의 샘플 활성화 용액(EDC/NHS)을 주입한 다음 5분 더 유지합니다.
   2. 화학적으로 합성된 펩티드 10, HA 및 스파이크 단백질을 20μg/mL로 주입 및 고정화하기 위해 좌측 유동 세포(파란색)에서만 10μL/분으로 1분 동안 베이스라인 실행 후 이 사이클을 반복하고, 활성화된 칩 표면을^1M 에탄올아민 HCl pH 8.5로 퀀칭하기 전에 1.5분 동안 ddH2O로 후속 기준선 조정을 허용합니다.
4. 액체 샘플러에서 DDH₂0의 탈기 장치로 튜브를 HBS-EP(+)가 있는 병으로 전환합니다(보충 그림 1).
5. SPR 센서그램을 분석합니다.
   1. 역학 연구를 수행하려면 다양한 분석물 농도(^10-5-10-8M)를 사용하며, 각 주입 후 재생 단계와 다른 분석물 후 블랭크 측정을 수행합니다. 유속을 10μL/분으로 변경하고 4분 접촉 시간 동안 주입을 시작한 다음 5분 기준선 생성 및 30초 간격으로 각각 2분씩 두 번의 재생 단계를 시작합니다.
   2. 다양한 단백질 농도를 정규화하기 위해 샘플 실행에서 센서그램을 빼는 블랭크 측정을 위해 버퍼 용액을 주입합니다.
6. Form을 클릭하고 아래로 스크롤한 다음 이 작업 모드를 클릭하여 "사후 처리"로 변경합니다. 추가를 클릭하여 각 플로우 셀에 대한 데이터 플롯 양식에서 시간이 지남에 따라 생성된 바인딩 곡선을 선택하고 오버레이를 스크러버 파일(.ovr)로 내보냅니다. 파일을 클릭하여 파일 저장 옵션을 엽니다. 왼쪽 및 오른쪽 곡선을 정렬하고 리간드 채널의 신호에서 두 번째 기준 채널의 신호를 빼서 응답 곡선을 얻습니다.
   참고: 데이터는 센서그램을 계산적으로 정의하여 "후처리"에서 작동합니다. 왼쪽 및 오른쪽 플로우 셀의 센서그램 오버레이에 넣거나 두 채널의 차이에서 센서그램으로 표시됩니다.
7. 결합 측정 전후에 50-100mM 글리신 완충액 pH 9.5, 물 및 20% 에탄올로 전체 유체를 세척하여 0.5% SDS 및 글리신으로 미량의 소금 또는 단백질 오염 또는 더 엄격한 단백질 오염을 제거합니다.
   알림: 기기 손상을 방지하려면 칩이 버퍼 또는 100% 습도에 보관된 경우 칩 카트리지를 기기에 다시 삽입하기 전에 유리 칩의 기계적 안정성을 확인하는 것이 좋습니다.

이량체 도메인-스왑된 CVN2L0 분자는 3개의 개별 SPR 실험에서 HA 상단 영역에 대한 결합에 대해 테스트되고 결합 친화도는KD 값으로 제시됩니다. 도메인 B는 이황화 결합을 이온 잔기로 대체함으로써 영향을 받는 H-결합 부위를 포함하는 것으로 가정하고, 도메인 A는L10,18을 형성한다. CVN2L0 및 변형 V2(3개의 이황화 브리지) 및 V5(2개의 이황화 브리지)의 단일 주입은 먼저 자동 시료 주입기 및 실행 테이블 편집기를 사용하여 동역학 측정을 설정하기 전에 결합 용량을 추정하기 위해 HA 결합 센서 칩에 대한 결합을 테스트합니다(그림 3A 및 보충 그림 2). 반복 주입은 시간이 지남에 따라 시스템의 나노몰 및 μ몰 범위의 다양한 농도에서 일련의 CVN2L0, V2 및 V5에 대해 자동화됩니다(그림 3B-D). 무손상 Cys-Cys 결합의 수를 상관시키면, CVN2L0은 양호한 포화도에 도달할때 KD=255 nM에서 고정화된 HA에 결합한다. 이 경우, 동역학 데이터에서 또는 평형 데이터를 Langmuir 결합 등온선에 피팅하여 계산된 두 KD 값은 중간 정도의 일치 상태에 있습니다(표 1 및 보충 그림 3, 보충 그림 4).

그림 3: 다가 상호작용을 통한 리간드 결합을 위한 SPR 결합 분석. CVN2(WT) 및 결합 부위-결합부위 V2 및 V5와 디술피드 치환체를 고친화성 탄수화물-결합 포켓 내에 결합시키기 위해 HA 공유결합에 대해 시험한다. (A) CVN2, V2 및 V5의 좌우 플로우 셀 결합 곡선을 SPR 실행 프로토콜에서 추출할 수 있으며 센서그램을 오버레이로 요약합니다. (B) CVN2L0을 HA에 결합시키기 위한 동역학 분석으로 표시된 기존 SPR 실험의 센서그램, 분석물 농도 10-4 내지 10-8M . CVN2L0은 1.5μM(상단 라인) 및 최대 500nM(하단 라인)에서 최고 농도까지 측정되며, 칩 표면의 포화 또는 평형 결합이 달성되지 않습니다. RU = 응답 단위. CMD500D 센서 칩이 사용됩니다. (C) HA에 대한 V2 결합에 대한 SPR 센서그램. (D) HA에 대한 V5 결합. 도면(B-D)은 참고문헌10의 허가를 받아 복제한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: SPR을 통해 측정된 HA에 대한 CVN2 및 변이체의 결합 친화도. Scrubber 2.0(BioLogic 소프트웨어)은 실시간 SPR 연관 및 해리 곡선을 피팅하고 운동 및 평형 데이터에서 평형 해리 상수(KD)를 계산하는 데 사용됩니다. Ka = 연관률 상수. Kd = 해리 속도 상수.

CVN2L0 및 V2의 HA에 대한 결합에 대한KD 값은 모두 나노몰 범위에 있는 반면, V5는 결합에서 감소한다(표 1). V5에서 두 개의 이황화 결합은 돌연변이 된 Glu와 Arg 잔기 사이의 잠재적 인 이온 상호 작용을 재 훈련시키는 이온 쌍 잔기로 대체됩니다 (그림 2A, 3D). 1 차 데이터는 가용성 CV-N과 고정 된 리간드의 상호 작용 및 칩 표면에서 형성된 복합체의 해리의 결합 동역학을 설명하는 통합 결합 속도 및 해리 방정식에 따라 분석됩니다. 두 개의 독립적인 측정이 수행되고 반복실험에서 얻은 것과 동일한 센서그램이 분석됩니다. KD는 koff/kon의 몫으로 계산됩니다(보충표 1)10,35. 그러나,KD는 랭뮤어 결합 등온선 36에 맞는 평형 데이터와 관련이 있으며, 여기서 평형 결합 반응은 분석물 농도의 함수로서 플롯된다(보충 그림 3A,4A,3B,4B). 농도 의존적 방식으로, 해리 속도 상수kd는 분석 후 결정되고 연관 상 피팅(kon)에 통합되어 연관 속도 상수 ka를 추정한다. (표 1, 보충 그림 3C, 보충 그림 4C).

다음으로, HA에 대한 CV-N의 결합은 RBD와의 상호 작용과 비교된다. SARS-CoV-2 RBD에 대한 CV-N WT 결합은 HA (KD = 5.7 nM)8,10,12에 대한 결합 및 S 단백질에 대한 결합 (KD = 18.6 μM, 그림 5)과 비교하여 약한 친화도(KD = 260 μM, 그림 4A)에서 측정됩니다. RBD S1 서브유닛 상에서 보존될 가능성이 있는 탄수화물의 특이적 표적화를 가정하여, RBD에 대한 CV-N WT 결합에 대한 농도 대 반응이 플롯된다(도 4A). 작은 글리코실화 펩타이드에 대한 고친화도 결합을 방해하는 이황화 결합의 대체로 인해 더 이상 분석할 수 없는 DM에 대한 CVN2L0-V4 결합에 대해 동일한 친화도 플롯이 표시됩니다(그림 4B).

CVN2L0-V4 (Glu-Arg 잔기 또는 양친 매성 아미노산 Trp 및 Met에 의한 시스테인 잔기의 비대칭 대체와 반대되는 2 개의 이황화 결합)는 의사 도메인 B 탄수화물 결합 부위(10) 주위에 비극성 수소 결합 네트워크를 형성 할 수있다. HA 단백질에 대한 글리 칸의 밀도가 높을수록 시스틴 대신 극성 Glu-Arg 잔기와의 결합 (보충 표 1) 및 CVN2L0과 Glu-Arg로의 변형 사이의 만노실화 펩타이드(DM 의 경우 KD = 10μM)와의 연관성에 도달하지만, 특히 H가 두 단량체에서 변형 될 때이 모노 글리코 실화 펩타이드로부터의 변이체의 불연속 해리를 보여줍니다. CVN2L0-V4와 DM 사이의 상호 작용에 대해, 56 μM CVN2L0-V4 주입의 반응은 Rmax보다 높은 응답을 산출한다. (그림 4B). V5 (2x Glu-Arg)는 표면 결합 DM에서 해리되지 않습니다 (데이터는 표시되지 않음). 요약하면, 더 낮은 농도의 반응 곡선은 천연 H 및 RBD에 대한 단량체 결합없이 펩타이드에 결합하는 CVN2에 대한 모든 센서 그램에 대한 주입을 종료하기 전에 감소합니다.

그림 4: RBD에 대한 (A) CV-N WT 단량체 결합의 SPR 분석. KD는 동역학 데이터(좌측,KD = 260μM)를 피팅하여 계산하고, 리간드와 분석물 사이의 1:1 결합(KD평형 = 274μM)에 대한 간단한 생체분자 모델을 사용하여 친화성 데이터(우측)와 비교한다. 평형 결합 반응 또는 결합 능력은 SPR 결합 곡선 (0-605 μM CVN)과 비교하여 농도의 함수로서 플롯팅된다. H = 고친화성 결합 부위. L = 저친화성 결합 부위. 둘 다 CV-N 및 CVN2L0에서 찾을 수 있습니다. (B) DM에 대한 이량체 CVN2L0-V4 결합, 분석가능한 KD가 없는 2L 가정. CVN2L0-V4 농도는 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3.5 μM입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: (A) S 당단백질에 결합하는 돌연변이 CVN-E41A 및 CV-N WT. 화살표는 연관 및 해리 단계의 시작을 나타냅니다. (B) SARS-CoV-2의 RBD에 대한 CVN-E41A 결합. 리간드는 HC 폴리카르복실레이트 및 CMD500D 센서 칩에 사전 고정되어 있습니다. Covid-19 S1 서브유닛[Pinto, D. et al.26; and Barnes, C. et al.37]은 RBD 고정화에 사용된다. 유량 : 30 μL / 분, 25 °C; 플로팅된 원시 데이터. 비교하여, 1:200의 희석 인자를 갖는 RBD에 대한 인간 혈청 항체의 결합이 묘사된다. (C) CV-N을 포획하기 위해 400 μRIU의 반응 수준으로 고정화된 S 당단백질에 결합하는 CV-N WT의 SPR 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단일 L을 갖는 단량체 CV-N은 gp120에 충분히 결합 할 수 없지만 CV-N의 중화 능력은 2 개의 탄수화물 결합 부위의 가교를 필요로하며 주로 이량 체화에 의해 복원되어 2H12,19로 기능화된다는 것이 이전에 나타났습니다. 따라서, 단량체 돌연변이 CVN-E41A가 발현되며, 이는 의사 도메인 B를 불안정하게 하거나 CV-N WT에서 발견되는 것과 같은 제2 도메인 A와의 연결을 방해할 수 있는 것으로 의심된다. CVN-E41A 단량체는 CV-N 단량체와 유사한 S 단백질에 결합할 때 안정성을 나타낸다. 605-680μM 분석물 농도에 대한 SPR 반응은 각각 CV-N WT 및 E41A 결합에 대한 높은 반응 단위 및 일반적인 SPR 센서그램을 나타내지만, 희석 시 돌연변이체는 불안정합니다(그림 5).

보충 그림 1: 인플루엔자 HA 상단의 일부로 DM 모조물을 캡처하기 위한 SPR 센서그램. 스크린샷: 500nm 카르복시메틸 덱스트란 하이드로겔로 코팅되고 높은 리간드 밀도에서 저분자량 분석물의 동역학 분석에 적합한 SPR 센서 칩 CMD500D에 DM을 고정하기 위한 SPR 실행 프로토콜을 보여주는 SPR 데이터 플롯. 센서칩은 에머젼 오일로 검출기에 직접 장착되고 3포트 플로우 셀 아래에 고정됩니다. 활성화된 칩 표면을 1 M 에탄올아민 HCl pH 8.5로 퀀칭한 후, CVN2를 2회 주입한다(농도=각각 1μM 및 2μM). 보라색: 플로우 셀 1과 플로우 셀 2의 차이; 반응은 0.2 s의 간격으로 기록된다. 청색: 유동 셀 1: DM 리간드의 400 nM 용액으로부터 활성화된 카르복실화된 표면으로 코팅된 3000-4000 마이크로굴절률 단위(μRIU). 빨간색: 기준 플로우 셀 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 이량체 CVN2L0-V5, V2 및 CVN2L0의 결합을 보여주는 HA 기능화된 CMD500D 센서 칩에서 수동 실행. 30-50 μL / min의 주입 유속에서 CVN2L0 및 His- 태그로 발현되고 Ni-NTA를 통해 정제 된 이황화 결합 변형체를 중간 μM 범위에서 주입하고 3 분의 결합 단계 및 2 분의 해리 단계로 HA에 대한 결합을 테스트합니다. 주사는 V5 (15 μM), V2 (2.4 μM), 0 μM, SUMO-융합 단백질 (1 μM)로부터 서브 클로닝 된 CVN2L0 및 CVN2L0 (2 μM)이다. 생리학적 pH에서 실행 완충액은 25°C에서의 모든 실험에 사용된다. 모든 용액은 시스템에 주입하기 전에 탈기 및 여과 (0.2 μm)됩니다. 보라색: 플로우 셀 1과 플로우 셀 2의 차이; 응답은 0.2초 간격으로 기록됩니다. 파란색: 플로우 셀 1: 2540μRIU HA. 빨간색: 기준 플로우 셀 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: HA에 대한 CVN2 바인딩. 곡선이 자동 정렬될 때의 센서그램 분석. (A) Scrubber 소프트웨어(왼쪽)와 결합된 분석물에 대한 농도 의존적 반응 곡선을 보여주는 결합 등온선(오른쪽)을 사용하여 영점 조정 및 정렬된 센서그램. (b) 퍼센트 용량으로 표현된 결합 등온선. (C) 계산적으로 적합한 이론적 연관성 및 해리 곡선. (D) 적합 곡선이 없는 SPR 센서그램의 동역학 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: HA에 대한 CVN2 바인딩. 곡선을 수동으로 정렬할 때의 센서그램 분석. (A) Scrubber 소프트웨어(왼쪽)와 결합된 분석물에 대한 농도 의존적 반응 곡선을 보여주는 결합 등온선(오른쪽)을 사용하여 영점 조정 및 정렬된 센서그램. (b) 퍼센트 용량으로 표현된 결합 등온선. (C) 계산적으로 적합한 이론적 연관성 및 해리 곡선. (D) 적합 곡선이 없는 SPR 센서그램의 동역학 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: Langmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 CVN2L0 및 Cys-Cys 결합 변형 V2, V4 및 V5를 HA에 결합하기 위한 SPR 센서그램에서 얻은 운동 데이터. K D [M] = k오프 / 케이온 또는 KD / K A. 모든 데이터는 HBS-EP(+) 버퍼에서 25°C에서 생성됩니다.: 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.