임상 연구에서 발견된 가족성 유전성 심근병증 계열을 기반으로 이 돌연변이를 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.
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방법 논문
마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
가족성 비대성 심근병증(HCM, OMIM: 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근병증입니다. 그러나 HCM의 근본적인 유전 적 원인은 여전히 파악하기 어렵습니다.
우리는 이전에 HCM을 가진 큰 중국 한족에서 미오신 중쇄 7 (MYH7) 유전자 이형 접합 변이체 NM_000257.4 : c.G2468A (p.G823E)를 확인했습니다. 이 계열에서 변종 G823E는 상 염색체 우성 장애와 분리됩니다. 이 변이체는 MYH7 단백질의 목 영역의 레버 암 도메인에 위치하며 상동 미오신 및 종 사이에서 고도로 보존됩니다. G823E 변이체의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 공학을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 제작했습니다. gRNA 표적화 벡터와 공여자 올리고뉴클레오티드(표적화 서열이 134bp의 상동성 옆에 있음)를 설계했습니다. 공여체 올리고뉴클레오티드 내의 p.G823E (GGG 내지 GAG) 부위를 상동성-지시 복구에 의해 MYH7의 엑손 23 내로 도입하였다. 침묵된 p.R819 (AGG 대 CGA)를 또한 삽입하여 gRNA 결합 및 상동성 지향적 복구 후 서열의 재절단을 방지하였다. 심 초음파는 생후 2 개월에 MYH7 G823E /- 마우스에서 수축기가있는 좌심실 후벽 (LVPW) 비대를 나타 냈습니다. 이러한 결과는 마찬가지로 조직학적 분석에 의해 검증되었습니다(그림 3).
이러한 결과는 G823E 변이체가 HCM의 발병기전에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. 우리의 연구 결과는 가족 성 HCM과 관련된 MYH7 변종의 스펙트럼을 풍부하게하고이 중국 가족의 유전 상담 및 산전 진단에 대한 지침을 제공 할 수 있습니다.
서론
비대성 심근 병증 (HCM, OMIM : 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근 병증으로 추정 발병률은 0.2 %로 150,000 명에게 영향을 미칩니다 1,2.
HCM을 특징 짓는 병리학 적 해부학 적 특징은 비대칭 심실 비대이며, 이는 종종 심실 유출로 및 / 또는 심실 중격3을 포함합니다. 임상 증상은 운동 호흡 곤란, 피로 및 흉통입니다. HCM의 개별 표현형은 임상 적으로 교활한 심부전에서 심각한 심부전에 이르기까지 다양합니다. HCM 환자는 치료, 심장 이식, 생명 유지 장비 및 다 분야 추적 관찰이 필요합니다4.
지난 세기 동안 PCR 기술은 우리가 DNA5를 연구하는 방식을 변화 시켰습니다. 임상 진단을위한 DNA 시퀀싱 방법은 Sanger와 동료6에 의해 발견되었습니다. Sanger 기술은 이후 인간 게놈 프로젝트에 적용되었지만 이 접근 방식은 비용과시간이 많이 소요
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프로토콜
가족의 역사는 가족 구성원을 인터뷰하여 얻었습니다. 이 연구는 광동성 중의학 병원 윤리위원회 (No. 2019074 167)의 승인을 받았습니다. 모든 가족 구성원으로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 모든 동물은 광동성 중의학 병원(광저우, 중국)의 윤리 지침에 따라 치료됩니다.
1. 연구 과목
참고: 프로밴드 III-3은 2019년 7월 광동성 중의학병원 심혈관 외과에 의학적 조언을 구했습니다.
- 프로 밴드의 상세한 가족 병력을 얻으십시오. 프로 밴드의 모든 가족에게 알리고 전화하십시오. 모든 가족 구성원은 세심한 신체 검사를 받았습니다.
- 의료 기록, ECG, 심 초음파 및 심장 카테터 삽입 보고서를 포함한 모든 임상 데이터를 체계적으로 검토합니다.
- 중재 또는 수술 중 모든 환자의 심장 표현형을 재확인하십시오.
- 로컬 데이터베이스에서 총 174개의 채우기 기반 정상 대조군을 선택합니다. 각 환자로부터 약 4.0mL의 말초 정맥혈을 수집합니다.
2. DNA 추출
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결과
가족의 임상 프로필
HCM의 가족 혈통을 얻었으며 그림 2에 나와 있습니다. 문서화 된 모든 가족 구성원은 등록시 HCM 진단을 받았습니다.
가족 (그림 2A)에서 프로 밴드는 46 세에 HCM 및 좌심실 유출로 폐쇄 (LVOTO)로 진단되어 심장 수술을받은 환자 III-7이었다. 환자 III-3은 외과 적 치료가 필요하지 않은 경미한 HCM을 가졌습니다. 환자 IV-3은 또한 그의 아버지 인 환자 III-3과 유사한 경미한 HCM을 가지고있었습니다. 환자 II-5는 HCM을 앓고 LVOTO로 인해 51 세의 나이에 결함을 복구하기 위해 수술을 받았습니다. 환자 I-1과 환자 II-2는 각각 57 세와 46 세의 심장 사고로 사망했습니다. 환자 I-1의 병력을 알 수 없었습니다. 환자 II-7 및 환자 III-9는 호흡 곤란을 나타내고 HCM으로 진단되었습니다.
.......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 연구에서는 HCM을 가진 한 중국 한족 가족을 설명합니다. 유전학 분석에 따르면 이형 접합체 MYH6 돌연변이 p.G823E는 상 염색체 우성 유전을 가진 가족 구성원에서이 질병과 공동 분리됩니다. G823E 돌연변이의 병원성을 검증하고 기본 메커니즘을 논의하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링에 의해 마우스 Myh7 유전자좌에서 G823E를 사용하여 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스의 표현형 특성을 심초음파로 평가하였다. 다중 섬유주 및 압축되지 않은 심근 층에 대한 더 높은 비율이 대조군과 비교하여 C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) 노킨 마우스에서 발견되었습니다. 트랜스제닉 마우스는 또한 LVPW 및 IVS 비대 및 HR의 증가를 보였다. 그러나 심장의 기능은 두 그룹간에 큰 변화를 보이지 않았습니다. 이러한 결과는 증가 된 HR이 심장 리.......
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공개 사항
저자는 선언 할 재정적 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 광동성 의료 연구 기금 프로젝트(A2022363)와 중국 광둥 과학 기술 위원회의 주요 프로젝트(보조금 번호 2022)의 지원을 받았습니다.
이 원고를 준비하는 동안 도움을 주신 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 Qingjian Chen에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5&배; TBE | 상하이 상곤 | ||
| 2× Taq 마스터 믹스 (염료 플러스) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| 가로스 | 레구 | ||
| 소동물용 마취기 | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BED툴 | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA 마커 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA 안정제 | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | DNA 분해를 방지합니다 |
| 전기 파라핀 마이크로톰 | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene 혈액 키트 | 산타 클라라 | ||
| 유리 슬라이드, 커버 슬립 | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin 염색 용액, Eosin 염색 용액 | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten 플랫폼 | Illumina | 는 캡처된 라이브러리에서 염기서열분석을 수행합니다 | |
| . 융모성 성선 자극 호르몬 주입 | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| 임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬 | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | 현지 공급 업체 | 흡입 마취 | |
| 미세 주입 현미경 | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| 파라핀 임베딩 기계 | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| 단백질분해효소 K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer Applied Biosystems | ABI 3500 | ||
| 실체현미경 | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | 엑솜 프로브 | |
| T7 ARCA mRNA 키트 | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| 온도 상자 | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride 솔루션 | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| 수의학 초음파 시스템 | Royal Philips | CX50 |
참고문헌
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al.
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