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방법 논문

마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사

3.6K 조회수

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DOI:

10.3791/63949

⸱

2022년 8월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

임상 연구에서 발견된 가족성 유전성 심근병증 계열을 기반으로 이 돌연변이를 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.

초록

가족성 비대성 심근병증(HCM, OMIM: 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근병증입니다. 그러나 HCM의 근본적인 유전 적 원인은 여전히 파악하기 어렵습니다.

우리는 이전에 HCM을 가진 큰 중국 한족에서 미오신 중쇄 7 (MYH7) 유전자 이형 접합 변이체 NM_000257.4 : c.G2468A (p.G823E)를 확인했습니다. 이 계열에서 변종 G823E는 상 염색체 우성 장애와 분리됩니다. 이 변이체는 MYH7 단백질의 목 영역의 레버 암 도메인에 위치하며 상동 미오신 및 종 사이에서 고도로 보존됩니다. G823E 변이체의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 공학을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 제작했습니다. gRNA 표적화 벡터와 공여자 올리고뉴클레오티드(표적화 서열이 134bp의 상동성 옆에 있음)를 설계했습니다. 공여체 올리고뉴클레오티드 내의 p.G823E (GGG 내지 GAG) 부위를 상동성-지시 복구에 의해 MYH7의 엑손 23 내로 도입하였다. 침묵된 p.R819 (AGG 대 CGA)를 또한 삽입하여 gRNA 결합 및 상동성 지향적 복구 후 서열의 재절단을 방지하였다. 심 초음파는 생후 2 개월에 MYH7 G823E /- 마우스에서 수축기가있는 좌심실 후벽 (LVPW) 비대를 나타 냈습니다. 이러한 결과는 마찬가지로 조직학적 분석에 의해 검증되었습니다(그림 3).

이러한 결과는 G823E 변이체가 HCM의 발병기전에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. 우리의 연구 결과는 가족 성 HCM과 관련된 MYH7 변종의 스펙트럼을 풍부하게하고이 중국 가족의 유전 상담 및 산전 진단에 대한 지침을 제공 할 수 있습니다.

서론

비대성 심근 병증 (HCM, OMIM : 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근 병증으로 추정 발병률은 0.2 %로 150,000 명에게 영향을 미칩니다 1,2.

HCM을 특징 짓는 병리학 적 해부학 적 특징은 비대칭 심실 비대이며, 이는 종종 심실 유출로 및 / 또는 심실 중격3을 포함합니다. 임상 증상은 운동 호흡 곤란, 피로 및 흉통입니다. HCM의 개별 표현형은 임상 적으로 교활한 심부전에서 심각한 심부전에 이르기까지 다양합니다. HCM 환자는 치료, 심장 이식, 생명 유지 장비 및 다 분야 추적 관찰이 필요합니다4.

지난 세기 동안 PCR 기술은 우리가 DNA5를 연구하는 방식을 변화 시켰습니다. 임상 진단을위한 DNA 시퀀싱 방법은 Sanger와 동료6에 의해 발견되었습니다. Sanger 기술은 이후 인간 게놈 프로젝트에 적용되었지만 이 접근 방식은 비용과시간이 많이 소요되었습니다7. 전체 게놈 시퀀싱(WGS)의 출현으로 인간 유전 질환에 대한 통찰력이 새로운 차원으로 올라갔지만 비용 측면에서는 여전히 엄두가 나지 않았습니다. 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 기술은 생식계열 변이체8를 검출하기 위해 오랫동안 사용되어 왔으며 다양한 암9의 엑솜에서 체세포 동인 돌연변이를 확인하는 데 성공적이었습니다. WES에 의한 DNA 엑손 또는 코딩 영역의 검출은 대부분의 멘델 질환에서 병원성 변이를 밝히는 데 사용될 수 있습니다. 오늘날 시퀀싱 비용이 감소함에 따라 WGS는 유전체학 연구에서 중요한 도구가 될 것으로 예상되며 게놈의 병원성 변이 검출에 널리 사용될 수 있습니다.

WES 기술은 또한 유전성 심근 병증에서 병인을 더 밝히기 위해 병원성 변이를 식별하는 데 사용되었습니다. 새로운 증거는 MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 및 TPM1 18과 같은 육종 구조 단백질 유전자 돌연변이를 코딩하는 유전자가 HCM의 유전 적 병인을 담당한다는 것을 암시합니다. 희귀 질환 유발 유전자(예: 옵스큐린, 세포골격 칼모듈린 및 티틴 상호작용 RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, 작용 알파 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, 시스테인 및 글리신이 풍부한 단백질 3(CSRP3, OMIM: 600824)21)의 병원성 변이에 대한 인식도 HCM과 관련이 있습니다. 현재의 유전 연구는 HCM 환자의 약 40 % -60 %에서 육종 단백질 유전자에서 여러 가지 별개의 병원성 변이를 확인했으며, HCM 환자의 유전자 검사에서 대부분의 병원성 변이체가 미오신 중쇄 (MYH7) 및 미오신 결합 단백질 C (MYBPC3). 그러나 HCM의 유전 적 기초는 여전히 파악하기 어렵습니다. 인간 HCM 환자의 기초가되는 이러한 변이의 병원성을 탐구하는 것은 주요 과제로 남아 있습니다22.

이 연구에서는 WES의 HCM을 가진 중국 한족의 MYH7의 병원성 변이를 보고합니다. 이 변종의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스를 구축했습니다. 우리는 또한이 변종의 그럴듯한 메커니즘에 대해서도 논의합니다.

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프로토콜

가족의 역사는 가족 구성원을 인터뷰하여 얻었습니다. 이 연구는 광동성 중의학 병원 윤리위원회 (No. 2019074 167)의 승인을 받았습니다. 모든 가족 구성원으로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 모든 동물은 광동성 중의학 병원(광저우, 중국)의 윤리 지침에 따라 치료됩니다.

1. 연구 과목

참고: 프로밴드 III-3은 2019년 7월 광동성 중의학병원 심혈관 외과에 의학적 조언을 구했습니다.

  1. 프로 밴드의 상세한 가족 병력을 얻으십시오. 프로 밴드의 모든 가족에게 알리고 전화하십시오. 모든 가족 구성원은 세심한 신체 검사를 받았습니다.
    1. 의료 기록, ECG, 심 초음파 및 심장 카테터 삽입 보고서를 포함한 모든 임상 데이터를 체계적으로 검토합니다.
    2. 중재 또는 수술 중 모든 환자의 심장 표현형을 재확인하십시오.
  2. 로컬 데이터베이스에서 총 174개의 채우기 기반 정상 대조군을 선택합니다. 각 환자로부터 약 4.0mL의 말초 정맥혈을 수집합니다.

2. DNA 추출

알림: DNA는 제조업체의 지침에 따라 상업용 혈액 키트로 추출됩니다.

  1. 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 안정제의 존재하에 음이온 성 세제로 혈액 세포를 용해시킵니다.
  2. 10 μL의 RNase A 용액을 세포 용해물에 첨가하고 튜브를 25 번 뒤집어 혼합한다. 37°C에서 15분에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 소금 침전으로 단백질을 제거하십시오. 단백질 침전 용액 (증류수 25mL에 용해 된 소 혈청 알부민 0.25mg)과 100 % 이소프로판올을 사용하여 단백질을 침전시킵니다. 그런 다음 200μL의 70% 에탄올을 사용하고 4°C에서 15분 동안 12,000 x g/min으로 원심분리를 수행하여 DNA 펠릿을 세척합니다.
  4. 500 μL의 70% 에탄올로 침전시켜 게놈 DNA를 회수한다. 12,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 펠릿을 흡인한 다음 수화용액(1mM EDTA, 10mM Tris· Cl, pH 7.5).
  5. 분광 광도계 (예 : NanoDrop 2000)를 사용하여 순도를 결정하십시오. 정제된 DNA는 일반적으로 A260/A280 비율이 1.7과 1.9 사이이며 크기는 최대 200kb입니다.
  6. DNA를 2-8, -20 또는 -80 °C에서 장기간 보관하십시오.

3. 전체 엑솜 시퀀싱 및 변이체 분석

참고: 질병을 유발하는 유전자 돌연변이를 체계적으로 검색하기 위해 영향을 받은 개체(II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 및 IV-3)와 영향을 받지 않은 개체(III-2, III-5, IV-4)에서 엑솜 시퀀싱을 수행했습니다.

  1. 제조업체의 지침에 따라 엑솜 프로브를 사용하여 엑솜 캡처를 수행하십시오.
  2. HiSeq X-ten 플랫폼에서 2 × 150bp 쌍단 시퀀싱에 적격 라이브러리를 적용합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.
  3. FASTQ 파일을 BWA v0.7.1318,19를 사용하여 인간 참조 게놈(hg19/GRCh37)에 맞춥니다. samtools를 사용하여 정렬된 파일(sam/bam 형식 파일)을 정렬한 다음 Picard를 사용하여 중복에 플래그를 지정합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.
  4. GATK를 사용하고, 판독값을 로컬로 재정렬하고, 기본 품질을 재보정합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.
  5. BEDTools 및 사내 perl/python 스크립트에 의해 재보정된 파일의 적용 범위와 깊이를 포함하는 매핑 통계를 생성합니다.
  6. GATK의 HaplotypeCaller 도구의 다중 샘플 처리 모드를 사용하여 재보정된 BAM 파일의 유전자형 변이체(SNV 및 indel).
  7. VQSR(대안 품질 점수 재보정)을 사용하여 대안 호출의 가양성을 줄입니다.
  8. ANNOVAR 소프트웨어21을 사용하여 엑솜 집계 컨소시엄(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org), 엑솜 시퀀싱 프로젝트(ESP)(https://esp.gs.washington.edu) 및 1,000G(http://www.1000genomes.org)를 포함한 여러 데이터베이스에 대해 SNV 및 인델에 주석을 달 수 있습니다. ACMG 가이드라인에 따라 서열 변이체의 병원성을 해석한다.

4. 생어 시퀀싱

  1. Sanger 시퀀싱을 수행하여 잠재적인 원인 변이를 확인하고 ABI 3500 시퀀서23을 사용하여 제품군에서 변이 분리를 결정합니다.
  2. MYH7 유전자 (NM_000257)의 변이체에 대한 프라이머 서열을 다음과 같이 설계하였다: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' 및 5'-CGGACTTCTCTAGCGCCTT-3'.
  3. 변종을 확인하고, 가능한 모든 가족 구성원을 스크리닝하여 가족 내에서 변종 분리를 결정한다(23).

5. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) 노킨 마우스 생성

  1. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스를 생성합니다. 마우스의 Myh7 유전자(GenBank 수탁번호: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093)은 마우스 14번 염색체에 위치하며 41개의 엑손이 있습니다. ATG는 엑손 4에서 코돈을 시작하고 TAG는 엑손 41에서 코돈을 멈추고 G823E는 엑손 23에 있습니다. 엑손 23을 대상 부위로 선택합니다.
  2. gRNA 표적화 벡터 및 공여자 올리고의 서열을 설계한다(표적화 서열 포함, 양쪽에 결합된 134 bp 상동 서열 측면).
    1. NCBI 웹 사이트에 로그인하고 오른쪽의 BLAST 온라인 프라이머 디자인 기능을 클릭하십시오.
    2. 페이지 하단의 프라이머 -BLAST 기능을 클릭하여 프라이머 를 디자인합니다.
    3. MYH7 NCBI 참조 시퀀스 번호 NM_000257.4를 PCR 템플릿 상자에 붙여넣습니다.
    4. 표적 단편(MYH7 cDNA 엑손 23 및 그 인접 엑손)을 증폭하여 엑손 21(2392-2528)에 상류 프라이머와 엑손 25(3205-3350)에 하류 프라이머를 설계한다. 상류 및 하류 프라이머의 엑손 번호를 오른쪽 범위 상자에 입력합니다.
    5. 하단의 Get Primers 버튼을 클릭하여 여러 쌍의 프라이머를 자동으로 생성합니다.
  3. MYH7 유전자를 ZFIN 데이터베이스에 입력하고, 공여자 올리고뉴클레오티드에 p.g823e (GGG 대 GAG) 돌연변이 부위를 도입하고, 엑손 23에 침묵 돌연변이 p.r819 (AGG에서 CGA로)를 도입한다. 침묵하는 돌연변이는 상동성-지시된 복구 후에 gRNA에 의한 서열의 결합 및 재절단을 방지한다.
    1. 일반적인 서열에 따라 gRNA를 설계하면, 양 말단의 서열은 TAATACGACTCACTATA- 및 -GTTTTAGAGCTA이다. 시퀀스의 중간은 위에서 언급 한 표적 부위입니다.
  4. 시험 관 내 전사에 의해 생성된 Cas9 mRNA, gRNA 및 공여자 올리고를 KI 마우스 생산을 위해 수정란에 공동 주입합니다.
    1. Cas9/gRNA 표적 효율 검출 키트를 사용하여 설계된 gRNA 표적을 시험관 내 gRNA로 전사하고 제조업체의 프로토콜에 따라 전사체의 활성을 검출합니다(특정 검출 방법은 VK007 키트 지침 참조).
    2. T7 ARCA mRNA 키트 구성 요소를 해동하고 혼합하고 미세 분리기에서 펄스 스핀하여 튜브 바닥으로 용액을 수집합니다. 2x ARCA/NTP 믹스를 10μL로, 1μg의 템플릿 DNA, 2μL의 T7 RNA 중합효소 믹스, 20μL의 뉴클레아제가 없는 물의 순서로 실온에서 반응을 조립합니다.
    3. 철저히 혼합하고 미세 분리기에서 펄스 스핀하십시오. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    4. 2 μL의 DNase I을 첨가하여 주형 DNA를 제거하고, 잘 혼합하고, 37°C에서 15분 동안 배양하여 mRNA를 수득하였다.
    5. 0.5mL 주사기로 약 4주령에 미리 준비된 C57BL/6 암컷 마우스에 혈청 성선 자극 호르몬과 인간 융모막 성선 자극 호르몬을 복강 내 주사하여 마우스당 약 5U의 용량으로 48시간의 두 주사 간격을 두고 수행합니다.
    6. 투여 18시간 후, 호르몬 주사 후 경추 탈구에 의해 C57BL/6 암컷 마우스와 8-12주령의 C57BL/6 수컷 마우스 1마리를 희생시켰다. 난자와 정자를 따로 모으십시오.
    7. 정자는 용량 유체에서 용량화됩니다. 체액 가장자리에 있는 정자를 3-4시간 동안 체외 수정을 위해 수명이 짧은 난자 세포에 떨어뜨립니다.
    8. 성공적으로 전사된 gRNA 및 Cas9 mRNA를 RNase가 없는 물로 시험 관 내에서 25ng/μL 및 50ng/μL로 희석합니다. 미세 주입으로 마우스 수정란의 세포질에 도입하십시오. 양호한 상태의 수정란을 암컷 마우스의 확대 된 난관에 이식하십시오. 결찰 된 수컷 마우스와 공동 케이지.
  5. PCR에 의한 새끼의 유전자형. 다음 PCR 조건을 사용하십시오 : 3 분 동안 94 ° C, 30 초 동안 94 ° C의 35 사이클, 35 초 동안 60 ° C, 및 35 초 동안 72 ° C; 72 °C에서 5분간 서열 분석을 따르십시오.
    1. 4 개월 된 쥐의 꼬리를 가위로 자르고 1.5mL EP 튜브에 넣습니다. 미세 원심분리 튜브에 테일 피스(2-5mm)당 180μL의 완충액 GL, 20μL의 프로테이나제 K 및 10μL의 RNase A를 추가합니다. 꼬리를 너무 많이 자르지 않도록주의하십시오.
    2. 튜브를 56°C에서 밤새 배양합니다.
    3. 미세 원심분리 튜브에서 1,000 x g 로 2분 동안 회전시켜 불순물을 제거합니다.
    4. 200μL의 버퍼 GB와 200μL의 무수 에틸 알코올을 충분히 혼합하여 추가합니다.
    5. 스핀 컬럼을 수집 튜브에 넣습니다. 샘플을 스핀에 적용하고 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
    6. 500μL의 버퍼 WA를 스핀 컬럼에 넣고 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
    7. 700μL의 버퍼 WB를 스핀 컬럼에 넣고 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
      알림: 버퍼 WB가 100 % 에탄올과 미리 혼합되어 있는지 확인하십시오. 버퍼 WB를 추가할 때 튜브 벽에 추가하여 잔류 염분을 씻어냅니다.
    8. 5.5.7단계를 반복합니다.
    9. 스핀 컬럼을 수집 튜브에 넣고 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
    10. 스핀 컬럼을 새 1.5mL 튜브에 넣습니다. 50-200 μL의 멸균수 또는 용출 완충액을 컬럼 멤브레인의 중앙에 추가하고 컬럼을 5분 동안 그대로 둡니다.
      알림: 멸균된 물 또는 용리 완충액을 최대 65°C까지 가열하면 용리 수율을 높일 수 있습니다.
    11. DNA를 용리하려면 컬럼을 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. DNA 수율을 높이려면 플로우 스루 및/또는 50-200μL의 멸균수 또는 용리 완충액을 스핀 컬럼 멤브레인의 중앙에 추가하고 컬럼을 5분 동안 그대로 두십시오. 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
    12. 용출된 게놈 DNA를 전기영동으로 정량화합니다.

6. 심장 형태 및 기능 평가

참고: M-모드 심초음파를 적용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스의 심장 형태와 기능을 평가합니다.

  1. knockin 마우스를 마취기에 연결된 닫힌 아크릴 상자에 넣고 이소 플루 란 (농도 : 3 %)이 아크릴 상자로 흘러 들어갈 수 있도록 3 방향 인터페이스를 조정합니다. 노킨 마우스가 자율적으로 움직이지 않으면 노킨 마우스를 제거하십시오.
  2. 노킨 마우스를 소형 동물 마취기의 수명 모니터링 플랫폼에 평평하게 놓고 산소(유량: 0.8L/min) 및 이소플루란(농도: 3%)을 혼합한 연속 흡입 마취를 합니다. 각막의 건조를 방지하기 위해 마취 된 마우스에 눈 윤활제를 바르십시오.
  3. 노킹 마우스를 플랫폼에 수평으로 고정하십시오. 플랫폼을 노킨 마우스에 대해 꼬리를 30° 기울입니다. 탈모 크림을 사용하여 노킹 마우스의 앞쪽 흉벽에있는 머리카락을 제거하십시오.
  4. 범프가 동물의 머리를 향하도록 프로브를 수직으로 배치하십시오. 그런 다음 프로브를 시계 반대 방향으로 약 45° 돌립니다.
  5. 흉골 장축 보기에서 프로브를 시계 방향으로 90° 회전하여 흉골 단축 보기를 관찰합니다. 프로브를 90° 회전한 후 y축 변위를 조정하여 올바른 슬라이스를 얻습니다.
  6. 심장의 장축 이미지(그림 1C)를 관찰한 다음 M 모드 측정 데이터를 선택합니다.
  7. 마우스의 흉골 장축 뷰에서 초음파 데이터를 수집합니다 (그림 1). 심박수 (HR), 좌심실 박출률 (LVEF), 심 박출량 (CO), 좌심실 말기 이완기 차원 (LVDd), LVD 좌심실 수축기 말기 차원 (LVSd), 심실 중격 (IVS) 및 좌심실 후벽 (LVPW)을 측정합니다.
  8. 측정 후 마우스에 산소를 공급하고 자율 활동을 회복하면 각각의 케이지에 다시 넣습니다.

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결과

가족의 임상 프로필
HCM의 가족 혈통을 얻었으며 그림 2에 나와 있습니다. 문서화 된 모든 가족 구성원은 등록시 HCM 진단을 받았습니다.

가족 (그림 2A)에서 프로 밴드는 46 세에 HCM 및 좌심실 유출로 폐쇄 (LVOTO)로 진단되어 심장 수술을받은 환자 III-7이었다. 환자 III-3은 외과 적 치료가 필요하지 않은 경미한 HCM을 가졌습니다. 환자 IV-3은 또한 그의 아버지 인 환자 III-3과 유사한 경미한 HCM을 가지고있었습니다. 환자 II-5는 HCM을 앓고 LVOTO로 인해 51 세의 나이에 결함을 복구하기 위해 수술을 받았습니다. 환자 I-1과 환자 II-2는 각각 57 세와 46 세의 심장 사고로 사망했습니다. 환자 I-1의 병력을 알 수 없었습니다. 환자 II-7 및 환자 III-9는 호흡 곤란을 나타내고 HCM으로 진단되었습니다.

...

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토론

이 연구에서는 HCM을 가진 한 중국 한족 가족을 설명합니다. 유전학 분석에 따르면 이형 접합체 MYH6 돌연변이 p.G823E는 상 염색체 우성 유전을 가진 가족 구성원에서이 질병과 공동 분리됩니다. G823E 돌연변이의 병원성을 검증하고 기본 메커니즘을 논의하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링에 의해 마우스 Myh7 유전자좌에서 G823E를 사용하여 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스의 표현형 특성을 심초음파로 평가하였다. 다중 섬유주 및 압축되지 않은 심근 층에 대한 더 높은 비율이 대조군과 비교하여 C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) 노킨 마우스에서 발견되었습니다. 트랜스제닉 마우스는 또한 LVPW 및 IVS 비대 및 HR의 증가를 보였다. 그러나 심장의 기능은 두 그룹간에 큰 변화를 보이지 않았습니다. 이러한 결과는 증가 된 HR이 심장 리...

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공개 사항

저자는 선언 할 재정적 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 광동성 의료 연구 기금 프로젝트(A2022363)와 중국 광둥 과학 기술 위원회의 주요 프로젝트(보조금 번호 2022)의 지원을 받았습니다.

이 원고를 준비하는 동안 도움을 주신 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 Qingjian Chen에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5&배; TBE상하이 상곤
2× Taq 마스터 믹스 (염료 플러스)Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
가로스레구
소동물용 마취기Reward Life Technology Co., Ltd.R500
BED툴2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA efficiency kitViewsolid Biotechnology Co., Ltd.VK007
DNA 마커Thermo Fisher Scientific
DNA 안정제Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.DNAstable LDDNA 분해를 방지합니다
전기 파라핀 마이크로톰Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-S7220-B
GATKv3.5
Gentra Puregene 혈액 키트산타 클라라
유리 슬라이드, 커버 슬립Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin 염색 용액, Eosin 염색 용액Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten 플랫폼Illumina는 캡처된 라이브러리에서 염기서열분석을 수행합니다
. 융모성 성선 자극 호르몬 주입Livzon Pharmaceutical Group Inc.
임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane현지 공급 업체흡입 마취
미세 주입 현미경NikonECLIPSE Ts2
NanoDropThermo Fisher Scientific2000
파라핀 임베딩 기계Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-B7126-B
Picard(2.2.4) 20
단백질분해효소 KMerck KGaA
samtools1.3
Sequencer Applied BiosystemsABI 3500
실체현미경NikonSMZ745T
SureSelect Human All Exon V6Agilent Technology Co., Ltd.엑솜 프로브
T7 ARCA mRNA 키트New England BioLabs, Inc.NEB-E2065S
온도 상자BINDER GmbHKBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride 솔루션Sigma, Merck KGaANo. T2663
수의학 초음파 시스템Royal PhilipsCX50
아는 주사

참고문헌

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
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