돼지 뇌에 주입하기위한 자기 공명 유도 스테레오 택시

이 프로토콜에서는 캐뉼라 배치 및 돼지 뇌로의 주입 실시간 시각화를위한 중재 적 자기 공명 영상 (iMRI) 정위 시스템의 적용을 설명합니다. iMRI 시스템의 개발은 정확한 카테터 배치를 가능하게합니다¹. iMRI는 전신 마취 ^1,2하에 환자의 뇌에서 주입제의 분포를 시각화하여 절차의 정확성을 실시간으로 평가할 수 있습니다.

MR 유도 입체 시스템은 서브 밀리미터 타겟팅 정확도¹를 허용하는 표적 플랫폼입니다. 투영된 리드 삽입 궤적 및 조정 매개변수와 함께 뇌의 해부학적 이미징을 제공하는 전용 소프트웨어와 함께 두개골 장착 조준 장치를 사용합니다. 뇌에 대한 정위 외과 적 개입을위한 iMRI 유도는 파킨슨 병 2,3,4,5의 치료에서 심부 뇌 자극, 간질 치료를위한 국소 절제 ^6,7 및 중추 신경계에 대한 약물의 대류 강화 전달 (CED) ^8,9와 같은 임상 적용에서 효과적인 것으로 입증되었습니다.

CED 방법은 유체 대류를 사용하여 치료제를 중추 신경계에 직접 전달하는 데 사용됩니다. 이것은 주입 캐뉼라의 끝으로부터 주변 세포외 공간(¹⁰)으로 주입물의 유동을 가능하게 하는 작은 정수압 구배에 기초한다. 정위 방법은 고농도의 거대 분자, 소분자 11,12, 세포 이식^13,14,15 또는 치료제를 혈액 뇌 장벽을 우회하여 선택된 뇌 조직 표적에 전달하는 데 사용됩니다. 투과성, 확산 계수, 배압, 흡수 및 클리어런스 메커니즘과 같은 인자는 치료제(¹⁶)의 확산에 영향을 미친다. 이 기술은 임상 CED를 위해 가돌리늄 기반 공동 주입 물¹을 사용하여 실질 조직 표적에 실시간으로 주입 제를 모니터링합니다. 조직의 분포 부피 및 표적 정확도에 따른 관련 동역학과 같은 매개 변수는 iMRI로 모니터링됩니다.

MR 유도 정위 택시 시스템을 통한 주입제에 대한 CED 연구는 인간이 아닌 영장류에서 연구되어 정확하고 예측 가능하며 안전한 절차를 제공합니다. 주입 캐뉼러 배치 정확도는 서브 밀리미터 배치 오류¹⁷에 도달하는 것으로 나타났습니다. 상기 시스템은 예측 가능한 주입 분포를 제공하며, 주입량에 따른 분포량의 관찰된 선형 증가와 함께 CED 주입¹⁸에 대한 역류 저항성 캐뉼러가 후속적으로 도입된다. 이러한 iMRI 주입 절차는 비인간 영장류¹⁹에서 바람직하지 않은 영향을 초래하지 않는 것으로 보고되었다.

여기에서 우리는 MR 유도 스테로택시의 적용을 돼지 뇌로 확장하여 300μL 세포 현탁액으로 구성된 주입제의 분포를 전달하고 모니터링합니다. 돼지 뇌의 크기는 인간에게 임상적으로 적용될 수 있는 영상 및 신경외과적 개입을 허용하는데, 이는 질병⁽²⁰)의 더 작은 동물 모델에서는 불가능하다. 더욱이, 돼지의 면역계는 생물학적 또는 다른 치료제에 대한 반응의 관점에서 인간의 면역계와 유사한 반응을 일으킨다(²¹). 따라서 정위 약물 전달 절차를 위해이 동물 종과 함께 작업하는 것은 직접적인 번역 임상 적 의미를 가지며 인간이 아닌 영장류 연구보다 논리적으로 쉬울 수 있습니다.

우리는 MR 유도 입체 택시를 위해 돼지 모델 (국내 돼지, 암컷, 25kg, 14 주령)을 사용했습니다. 돼지에서 정위 절차의 시각적 구현이이 연구에서보고됩니다. 우리는 돼지 머리를 수용하기위한 공간의 적응, 비디오 및 이미지 모두에서 절차의 시각화, 돼지 뇌의 주입 분포를 평가하기위한 동시 MR 이미징을 설명합니다. MR-유도 입체택시는 3T MRI 공간에서 수행되었다.

이 실험을 통해 우리 그룹은 돼지 뇌에서 MR 유도 입체 택시의 성능과 뇌 내 주입을 추적하는 기본 이미징 타임 라인을 보여줍니다. 인간에서 수행되는 임상 정위 택시에 대한 일반적인 기술은 돼지 두개골 및 뇌에 적용될 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 실시간 MRI 시각화 안내를 통해 돼지 뇌에서 MR 유도 입체 택시를 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 두개골 상단에 최적으로 접근하기 위해 MRI 보어에 엎드린 피사체를 배치함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 사전 계획된 궤적에 대한 적절한 진입점을 결정하기 위해 기준 그리드의 배치 및 스캔을 포함하는 MRI 보조 시각화 안내로 수술 삽입을 계획하는 것입니다. 이는 고분해능(1mm 등방성) T1 가중 3D 자화 준비 MPRAGE(고속 그래디언트 에코) 스캔으로 7분 44초 동안 달성됩니다. 다음으로, 정위 프레임을 헤드에 고정하고 투영된 반경 방향 오차가 0.5mm 미만이 될 때까지 소프트웨어 프로젝션을 통해 반복적으로 정렬을 조정합니다. 비스듬한 방향의 고속 2D 터보 스핀 에코 스캔(13초 지속 시간)은 이미지 안내를 제공합니다. 그런 다음 피부를 절개하고 핸드 드릴을 사용하여 미리 정의 된 좌표에 주입 캐뉼라를 삽입하기위한 버 구멍을 만듭니다. 마지막 단계는 글라돌리늄 동시 주입으로 실시간으로 반복되는 T1 강조 MRI 스캔(3D MPRAGE, 1분 45초)으로 주입을 모니터링하는 것입니다. 결과는 MR 유도 입체 택시가 실시간 MR 안내 및 분포량을 시각화하는 데 사용되는 후속 T1 강조 3D MPRAGE MRI 스캔 (1mm 등방성 분해능)을 기반으로 돼지 뇌에 정확하고 제어 된 주입을 허용한다는 것을 보여줍니다.

이 연구는 휴스턴 감리교 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회, IACUC 승인 번호 IS00006378의 승인을 받았습니다. 모든 실험 방법은 관련 국가 및 기관 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 포지셔닝

1. 두개골 상단에 최적으로 접근 할 수 있도록 피사체를 배치하십시오 : MRI 스캔을 준비하기 위해 피사체를 MRI 테이블에 놓습니다.
   참고 : 주제 정보 : 국내 돼지, 암컷, 25kg, 14 주령.
   1. 케타민 (근육 내 600mg [IM]) 및 미다 졸람 (5mg IM)으로 피험자를 진정시킵니다. 진통제인 하이드로모르폰(4mg IM), 카프로펜( os당 100mg) 및 펜타닐(국소 25μg), 항생제 세프트리악손(550mg 정맥내[IV]) 및 NaCl(0.9% IV)을 투여합니다.
   2. 피사체에 삽관하십시오. 2%-3% 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.
2. 시술 전반에 걸쳐 피험자의 활력 징후를 모니터링하십시오.
   1. 인공 호흡기로 분당 16-19 회 호흡으로 기계적으로 환기하십시오.
3. MRI 스캔을 준비하기 위해 피사체를 MRI 테이블에 놓습니다.
4. 머리가 MRI 보어를 향하도록 엎드린 자세로 피사체를 놓습니다.
5. 표준 MRI 4채널 플렉스 코일을 헤드 홀더에 놓습니다.
6. 헤드 홀더로 피사체의 머리를 안정시킵니다.
7. 수건과 폼 패드로 몸통을 들어 올리십시오. 목표는 목이 구부러지고 주둥이가 테이블에 거의 닿은 상태에서 머리가 약간 아래쪽으로 떨어지는 것입니다. 이것은 정위 프레임과 주입 캐뉼러가 MRI 스캐너의 보어 내에 맞는지 확인하는 데 도움이됩니다. MRI 헤드 홀더 핀을 양측 접합체에 고정하여 헤드를 MRI 테이블에 부착합니다.
8. 목이 구부러진 상태에서 두개골의 상단이 스캐너 뒤쪽으로 기울어져 있는지 확인합니다. 이 자세는 피험자가 MRI에 들어갈 때 외과의가 두피 상단에 접근할 수 있도록 합니다.
9. 일단 설정되면 MRI 테이블은 피사체의 머리가 구멍 끝에 도달할 때까지 스캐너의 구멍으로 이동합니다.

2. MRI 보조 시각화 안내를 통한 수술 삽입 계획

1. 준비된 재료가 피사체의 눈에 들어 가지 않도록주의하면서 멸균 방식으로 해당 부위를 준비하십시오. 수술 부위 주변에 멸균 수건을 놓습니다. 외과 의사가 접근 할 수있는 두개골 상단을 향한 구멍이있는 멸균 드레이프를 놓습니다.
2. 버 구멍이 있을 위치를 중심으로 그리드의 접착면을 환자의 머리 위에 부착하여 기준 계획 그리드를 피사체의 두피에 놓습니다.
3. 하단 레이어를 제자리에 단단히 고정하면서 그리드의 상단 유체로 채워진 층을 떼어냅니다.
4. 그리드가 제자리에 설정된 상태에서 MRI 스카우트 스캔을 수행합니다. 스캔은 종종 혈관계를 시각화하기 위해 정맥 내 MR 조영제 투여가 필요합니다 : 2.5mL의 주입 부피에 대해 1mmol / mL 농도의 조영제 가돌리늄 조영제를 사용하십시오.
   참고: 스카우트 스캔은 최종 영상 연구 전에 촬영한 예비 이미지입니다. 목적은 외과의가 영상이 관심 영역 가까이에서 수행되도록 하고 영상 경계를 정의하는 것입니다. 제조업체에 따라 조영제에 대한 1mmol/mL 농도의 권장 용량은 동물의 무게 킬로그램당 0.1mL입니다.
5. MR 안내 소프트웨어에서 캐뉼라 삽입을 위한 정확한 뇌 위치를 선택합니다.
6. 소프트웨어가 선택한 표적을 기반으로 캐뉼라 배치를 위해 외과의의 계획된 궤적을 시각화할 수 있는지 확인합니다. 소프트웨어가 궤적 시각화와 해당 진입점을 출력하는지 확인합니다.
   참고 :이 연구에서는 백질을 표적으로 삼기 위해 전두엽 피질의 부위가 선택되었습니다. 이것은 많은 인간 신경 교종이 발생하고 성장하는 위치입니다²². 또한 백질 전도지²³을 따라 보급하는 특혜 사이트이기도합니다.
   알림: 진입점, 표적 및 원하는 궤적에 대한 외과의의 결정을 고려하여 경합 및 설성 범법을 최소화하고 혈관을 피하십시오.
7. 소프트웨어에서 투영된 진입점과 대상점을 수동으로 드래그하여 원하는 진입점과 대상점을 포함하여 제안된 궤적을 조정하여 혈관을 피하고 피알 및 설칼 위반을 최소화합니다. 궤적을 변경하고 3차원으로 볼 수 있습니다.
8. 외과의의 선호도에 따라 원하는 궤적이 식별되면 MR 안내 소프트웨어를 실행하여 그리드에서 진입점을 찾습니다.
   1. 스캔에서 계획된 궤적을 스크롤하여 두피의 진입점을 찾습니다. 소프트웨어는 그리드에서 계획된 궤적의 투영을 기반으로 그리드 좌표를 지정합니다.

3. 입체 프레임 고정 및 소프트웨어 프로젝션을 통한 정렬 반복 조정

1. 먼저 6개의 뼈 고정 나사와 4개의 오프셋 나사로 베이스를 고정하여 그리드에서 원하는 진입점 좌표 주위에 입체 프레임을 조립합니다.
2. 6 개의 뼈 고정 나사를 두피를 통해 그리드 위의 두개골에 고정합니다. 6개의 앵커 나사는 입체 프레임을 안정화하고 드릴링 중 움직임을 방지하는 데 사용됩니다.
3. 두개골에 고정된 스킨을 통해 타워 바닥에 있는 4개의 오프셋 나사를 고정합니다. 그들은 프레임 베이스를 중앙 나사로 들어 올려 중앙 뼈 나사를 조이고 기초를 안정화하는 반력으로 작용합니다.
4. 입체 프레임 베이스가 고정되면 프레임 조립을 계속합니다.
5. 프레임 기준을 캡처하고 궤적을 확인하기 위해 프레임을 설정한 상태에서 MRI 소프트웨어의 옵션인 고해상도 T1 가중치 MPRAGE MRI 스캔을 수행합니다.
6. 소프트웨어로 원하는 투영 캐뉼라 삽입 궤적을 확인하고 MRI 스캔 및 계획된 궤적을 시각화합니다.
   1. 후속 2D 터보 스핀 에코 MRI 스캔을 수행하여 프레임이 제자리에 놓이면 프레임과 피사체의 정렬을 확인합니다. 현재 프레임 위치와 원하는 궤적 사이에 오정렬이 있는 경우 소프트웨어는 조정 파라미터를 출력합니다.
      참고: 소프트웨어는 입체 프레임의 현재 위치 투영과 정의된 목표점 사이의 반경 방향 차이를 계산합니다. 이 오류는 투영된 오류를 계산하는 데 사용되며, 이 오차는 프레임을 최소화하기 위해 프레임에 필요한 조정을 계산하는 데 사용됩니다.
7. 소프트웨어의 출력 조정 매개변수에 표시된 대로 썸 휠을 돌려 피치 롤 및 X-Y 조정을 수행합니다.
8. 궤적의 소프트웨어 지원 MRI 시각화를 반복하고 필요에 따라 표적 캐뉼러의 회전 및 병진 조정(썸 휠 사용)을 수행합니다.
9. MR 안내 소프트웨어를 사용하여 원하는 궤적에서 두개골의 두께와 뇌까지의 총 거리를 측정합니다.
   알림: 소프트웨어는 프레임 상단(두개골에 나사로 고정됨)에서 목표 지점까지의 거리를 계산하여 전체 길이를 추정합니다.

4. 주입을 위해 캐뉼라 드릴링 및 삽입

1. 감염을 예방하기 위해 절개를 수행하기 전에 요오드 스크럽을 사용하십시오.
2. 정위 프레임 아래에 메스를 사용하여 두피에 3cm 절개를하십시오.
3. 접근 구멍을 생성하기 전에 조정을 수행하여 드릴 삽입용 프레임을 설정합니다.
   1. 중앙 가이드 튜브를 제거하고 드릴링용 3.4mm 드릴 비트에 맞는 튜브로 교체합니다.
4. 외과의가 프레임에 안정성을 추가하기 위해 수동 드릴로 훈련하는 동안 프레임을 제자리에 고정하기 위해 보조자가 있는지 확인하십시오.
5. 외과의가 수동 트위스트 드릴로 드릴하여 직경 3.4mm의 버 구멍을 만들도록 합니다.
6. 버 구멍을 넓히고 궤적을 변경할 수 있는 뼈 충돌을 방지하기 위해 두 번째 드릴 삽입을 위한 프레임을 설정하십시오.
   1. 4.5mm 드릴 비트로 드릴을 설정하십시오. 중앙 가이드 튜브를 이 더 큰 드릴 비트에 맞는 튜브로 교체하십시오.
   2. 4.5mm 버 구멍을 만듭니다.
7. MRI 스캔을 수행하여 표적 캐뉼러가 계획된 궤적으로 돌아 왔는지 확인하십시오., 프레임을 관통하는 드릴링은 때때로 캐뉼러를 이동할 수 있기 때문입니다.
8. 날카로운 스타일 렛으로 경막을 뚫습니다.
9. 미리 프라이밍된 프레임 호환 주입 캐뉼러를 삽입합니다. 캐뉼러가 기포의 유입을 제한하기 위해 일관된 중성 또는 양의 배압을 갖도록 하십시오.
   알림: 소프트웨어는 계획된 대상에 지정된 깊이를 제공합니다.
10. 입체 프레임 호환 주입 캐뉼러의 깊이를 측정하고 캐뉼라 관련 깊이 스톱을 사용합니다. 이 깊이 정지는 캐뉼러가 원하는 위치에 도달하고 그 이상으로 이동하지 않도록합니다. 캐뉼러가 원하는 깊이에 유지되도록 추가 나사가 있는 잠금 및 도크 어셈블리도 있습니다.

5. 반복적 인 MRI 스캔으로 주입 모니터링

1. MRI 스캔을 수행하여 캐뉼러가 뇌의 올바른 목표 위치에 삽입되었는지 평가하십시오.
2. 가돌리늄 기반 조영제와 함께 원하는 약제의 주입을 시작하십시오.
   참고: 이 실험에서는 1mM 농도의 가돌리늄 기반 조영제를 사용했지만 용도에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 총 300 μL의 주입 부피가 10 μL / min의 속도로 투여되었지만 이것도 다양 할 수 있습니다.
3. 정기적 인 시간 간격으로 MRI 스캔을 수행하여 뇌에서 캐뉼라 삽입 제제의 주입 및 분포량을 모니터링하며, 이는 가돌리늄의 동시 주입으로 인해 추론 할 수 있습니다.
   알림: 캐뉼라 팁 주변의 고강도 영역은 가돌리늄 기반 조영제가 있음을 나타냅니다.
4. 주입이 끝나면 펌프를 멈추십시오.
   참고: 이 연구에 사용된 주입 속도는 30μL 부피의 세포 현탁액이 완전히 주입될 때까지 300μL/분이었습니다.
5. 캐뉼러를 제거하기 전에 주입이 종료 된 후 5 분 동안 캐뉼러가 뇌에 머물도록하십시오.
   알림: 주입 캐뉼러는 일반적으로 역류 5를 줄이기 위해 주입 종료 후^21,24분 동안 그대로 둡니다.
6. 프레임을 통해 캐뉼러를 수동으로 제거합니다.
7. 프레임을 제작 된 방식과 역순으로 분해하여 머리에서 프레임을 제거하십시오.
8. 3-0 또는 4-0 모노 크릴 봉합사로 절개 부위를 닫습니다.
9. 회복을 준비하기 위해 이소 플루 란을 끄십시오.
10. 피험자를 발관하고 수의학 팀의 관찰하에 피험자가 회복되도록하십시오.

MRI 스캐너의 돼지 위치는 외과의가 수술할 수 있는 최적의 접근과 정위 프레임 및 주입 캐뉼러에 대한 여유 공간을 제공합니다(그림 1). 피험자의 몸통은 수건과 폼 패드로 들어 올렸습니다. 이를 통해 MR 보어 끝에서 머리가 약간 아래쪽으로 떨어질 수 있으므로 입체 프레임과 주입 캐뉼라 삽입 위치가 외과의에게 최적으로 접근 할 수 있도록했습니다.

MRI 유도 시각화를 통해 캐뉼러를 정확하게 계획하고 뇌에 삽입 할 수 있습니다 (그림 2). MR 안내 소프트웨어는 원하는 궤적을 달성하기 위한 삽입점을 제공합니다.

소프트웨어에서 입체 프레임을 스캔하고 원하는 위치에 효과적으로 도달하도록 조정했습니다(그림 3). 이 데모에서는 전두엽 피질의 위치가 선택되었습니다. 프레임이 설정되면 소프트웨어를 사용하여 돼지 두개골의 두께, 프레임 베이스에서 원하는 위치까지의 거리 및 원하는 위치에 도달하기 위한 프레임 매개변수 조정을 추정했습니다. 이 경우 선택한 위치와 삽입 각도에 대해 캐뉼라가 횡단하는 두개골의 두께는 4.7mm이고 두개골 내부 표면에서 뇌 표면까지 4.4mm였습니다(그림 3A).

마지막으로, 캐뉼라 주입 후 반복적 인 수술 간 MRI 스캔은 주입이 뇌 조직에 어떻게 전달되었는지 보여주었습니다 (그림 4). 이 스캔은 또한 캐뉼라 투영 (파란색 직사각형)과 투영 된 캐뉼라 궤적 (노란색 직사각형)의 비교를 제공하여 원하는 위치에 도달하는 데이 기술의 효과를 보여줍니다. MR 스캔은 4-6 분의 일정한 간격으로 촬영되었으며 10 분 및 30 분 스캔으로 마무리되었습니다. 가돌리늄 강화 주입은 이러한 스캔에서 다루기 쉬웠으며, 이는 에이전트의 분포량을 실시간으로 시각화했습니다.

그림 1: MRI 테이블에서의 피사체 위치. 몸통을 올리고 목을 구부리고 머리를 아래쪽으로 기울입니다. (A) MR 보어에 들어가기 전에. (B) 두개골 상단에 최적으로 접근하기 위해 MR 보어를 통해 위치한 피사체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: MR 유도 입체 택시 시각화. (A) 계획된 궤적의 시각화. 소프트웨어는 두피에 배치된 그리드의 진입점 위치를 출력합니다. (B) 두피의 진입 점 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 프레임이 두개골에 고정된 후의 개입 궤 적. (A) 뼈 깊이와 뇌까지의 거리 측정. (B) 핸드 드릴로 만든 버 구멍이있는 두개골의 입체 프레임. (C) 소프트웨어의 입체 프레임 및 3D 재구성 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 가돌리늄 강화 주입제의 시간 경과. 캐뉼라 팁 주변의 초강력 영역은 가돌리늄의 존재를 나타냅니다. 주입 동안 약제의 분포 부피를 추적하기 위해 반복적 인 MR 스캔을 시간에 걸쳐 획득 하였다 : (A) t = 0, (B) t = 4 분, (C) t = 8 분, (D) t = 12 분, (E) t = 20 분, (F) t = 26 분; 주입이 끝난 후 : (G) t = 36 분, (H) t = 60 분. 공동 주입 된 에이전트의 시각화는 4 분 후에 발생합니다. 파란색 사각형은 측정된 캐뉼라 배치이고 노란색 사각형은 투영된 캐뉼라 궤적을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SG, EAS, CJK는 다음과 같은 공시를 가지고 있습니다 : ClearPoint Neuro에 의해 고용되었습니다.

다른 모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.