여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.
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방법 논문
Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포의 기계적 특성은 줄기 세포 분화에서 암 전이에 이르기까지 다양한 생물학적 과정과 질병에 관여합니다. 원자력 현미경 (AFM) 및 마이크로 피펫 흡인 (MA)과 같은 이러한 특성을 측정하는 기존의 방법은 세포의 전체 점탄성 반응을 반영하여 풍부한 정보를 캡처합니다. 그러나 이러한 방법은 처리량이 매우 낮기 때문에 제한됩니다. 실시간 변형성 세포분석(RT-DC)과 같은 고처리량 접근 방식은 종종 세포의 탄성 특성만 반영하는 단일 파라미터 판독값으로 제한되기 때문에 제한된 기계적 정보만 측정할 수 있습니다. 이러한 방법과 달리 메카노-노드-기공 감지(mechano-NPS)는 중간 처리량으로 세포의 다중 파라미터 점탄성 측정을 달성하는 데 있어 격차를 해소하는 유연하고 비표지 미세유체 플랫폼입니다. 직류(DC) 측정은 세포가 미세유체 채널을 통과할 때 세포를 모니터링하여 좁은 수축을 통과하기 전, 도중 및 후에 세포의 크기와 속도를 추적하는 데 사용됩니다. 이 정보(즉, 크기 및 속도)는 각 셀의 횡방향 변형, 변형에 대한 저항 및 변형으로부터의 회복을 정량화하는 데 사용됩니다. 일반적으로이 전자 기반 미세 유체 플랫폼은 여러 점탄성 세포 특성을 제공하므로 세포의 기계적 상태를보다 완벽하게 파악할 수 있습니다. 최소한의 샘플 준비가 필요하고 간단한 전자 측정(고속 카메라와 달리)을 활용하며 표준 소프트 리소그래피 제조를 활용하기 때문에 이 플랫폼의 구현은 간단하고 액세스 가능하며 다운스트림 분석에 적용할 수 있습니다. 이 플랫폼의 유연성, 유용성 및 감도는 다양한 범위의 세포에 대한 고유한 기계적 정보를 제공했으며 기초 과학 및 임상 진단 분야에서 더 많은 응용 분야를 지원할 수 있습니다.
서론
단일 세포는 역동적이고 점탄성 재료입니다1. 다수의 내부 및 외부 과정 (예 : 유사 분열의 발병 또는 세포 외 기질 [ECM]의 리모델링)은 구조와 구성 2,3,4에 영향을 미치며 종종 현재 상태를 보완하는 뚜렷한 생물 물리학 적 특성을 초래합니다. 특히, 기계적 특성은 세포 발달, 생리학 및 병리학의 중요한 바이오마커로 나타났으며, 표준 분자 및 유전적 접근 5,6,7을 보완할 수 있는 귀중한 정량적 정보를 산출합니다. 예를 들어, Li 등은 최근 약물 내성 및 약물 반응성 급성 전골수성 백혈병 세포 사이의 기계적 차이를 설명하면서 RNA-seq를 사용하여 차등적으로 발현된 세포골격 관련 유전자8를 밝혀냈습니다. 단일 세포 역학과 세포 기능 간의 복잡한 상호 작용을 이해함으로써 기계 분석은 기초 과학 및 임상 진단을 변화시키는 데 더 광범위하게 적용됩니다
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프로토콜
1. 장치 형상 설계
- 측정할 가장 큰 셀의 직경보다 넓지만 충분한 신호 대 잡음비(SNR)를 유지하도록 크기 조정 및 복구 세그먼트의 너비를 선택합니다. 다양한 세포주에 대한 다양한 크기 조정 및 복구 세그먼트 너비의 예는 보충 표 2 를 참조하십시오.
- 수축 세그먼트 너비를 선택하여 기계 성형 수술을 받을 세포의 평균 크기에 30%-40% 변형을 적용합니다. 변형률은 로
정의되며, 여기서 d는 세포 직경이고 wc는 수축 채널 폭 2,8이다. 다양한 세포주에 대한 상이한 수축 세그먼트 폭에 대해서는 보충 표 2를 참조한다.
참고: 직경이 실질적으로 다른 셀 유형 또는 조건을 비교하려면 각 셀 유형/조건에 특정한 수축 세그먼트 너비와 함께 별도의 장치 설계를 사용해야 합니다. - 각각....
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결과
여기에 제시된 기계 성형 플랫폼은 중간 처리량으로 단일 세포의 생물 물리학 적 특성을 측정하기위한 간단하고 다양한 접근 방식입니다. 세포는 일정한 압력 구동 유동을 사용하여 마이크로유체 채널 (도 1A)을 통해 유동된다. 세포가 통과함에 따라, 생성된 마이크로유체 채널의 길이 및 전류 펄스는 데이터 획득 하드웨어를 사용하여 기록된다. 수집된 신호(그림 1B,C)는 MATLAB의 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 처리되어 관련 단일 셀 기계적 특성을 추출합니다. 도 1D는 실험 프로토콜의 그래픽 개요를 제시한다.
장치를 제작하기 위해 처음에는 네거티브 마스터 몰드가 생성되어 PDMS를 주조하는 데 사용됩니다(그림 2). 보충 그림 .......
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토론
이 기계 성형 기술을 사용하여 단일 셀의 기계적 특성을 측정하는 것은 장치 제조, 데이터 수집 및 데이터 분석의 세 단계로 구성됩니다. 각 단계에는 실험 결과에 큰 영향을 미칠 수있는 주목할만한 측면이 있습니다. 장치 제작 중에 정확하고 반복 가능한 결과를 얻으려면 일관된 채널 형상과 장치 간 균일성이 필수적입니다. 특히 각 장치의 측벽은 비교적 매끄러워야 하며(그림 4Ai) 복제 장치의 채널 높이는 비슷해야 합니다. 특히 수축 채널(그림 4Aii)에서 세포 흐름을 부분적으로 방해하는 결함이 있는 모든 장치는 폐기해야 합니다. 채널 지오메트리에서 식별 가능한 결함이 있는 장치를 사용하면 부정확하고 재현할 수 없는 결과가 발생합니다. 데이터 수집 중에 사용자가 데이터 수집 중에 채널에 막힘이 있음을 인식할 수 있어야 합니다. 예제 스크립트인 "NPS.m"(https://github.com/sohnlab/node-pore-se.......
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공개 사항
L. L. S는 2022년 7월 12일 발행된 미국 특허 제11,383,241호 "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han 및 L. L. Sohn을 보유하고 있습니다.
감사의 글
이 연구는 NIBIB 1R01EB024989-01 및 NCI 1R01CA190843-01의 보조금으로 지원되었습니다. AL과 R. R.은 H2H8 협회 대학원 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. KLC는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship과 Siebel Scholar Fellowship의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세톤 | J.T. 베이커 | 5356-05 | 순도 (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| 알루미늄 호일 | n/a | /a | |
| 아날로그 로우패스 필터 | ThorLabs | EF504 | ≤ 240kHz 통과대역, 동축 BNC 피드스루 (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, 일회용, 플런저 포함 (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| 블레이드 | n/a | n/a | |
| BNC 케이블 | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ 매체=CPC& utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW& utm_term= & utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29& gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| 클린룸 폴리에스터 면봉 | Thermo Fisher Scientific | 18383 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 전류 프리앰프 | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| 사용자 정의 PCB (w/ components) | n/a | 해당 사항 | 없음 추가 파일 참조 4 및 5 |
| DAQ 터미널 블록 | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 케이블 | 내쇼날인스트루먼트 | SHC68-68-EPM | |
| https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html 데이터 수집 보드 (DAQ) | 내쇼날인스트루먼트 | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| 디시케이터 | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 암 BNC to 바나나 플러그 어댑터 | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| 소 태아 혈청 (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
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| 골드 에칭트 TFA | 트랜스센 | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| 핫 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| 이소 프로필 알코올 | 스펙트럼 화학 | I1056-4LTPL | 순도 (GC) ≥ 99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| 금속 하드웨어 인클로저 | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 34860 | 순도 (GC) ≥ 99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 개발자 | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 포지티브 포토레지스트 | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask는 우리의 CAD 디자인 (https://www.fineline-imaging.com/) |
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| 압력 컨트롤러 소프트웨어 | Fluigent | MAESFLO | |
| 프로그래밍 & 데이터 | 수집 및 분석을 위한 | MATLAB | R2021b |
| PTFE 튜빙 | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" ( https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 휴대용 자동 셀 카운터 | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| 실리콘 웨이퍼 | 웨이퍼 월드 | 2885 | 76.2 mm, 단면 광택 (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| 스핀 코터 | n/a | 해당 없음 | |
| SU-8 3025 네거티브 포토레지 | Kayaku 고급 재료 | 해당 없음 | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 개발자 | Kayaku 고급 재료 | 해당 없음 | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
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| 티타늄, 플래티넘, 골드 | n/a | n/a | |
| 트리플 출력 전원 공급 장치 | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV 마스크 얼라이너 | Karl Suss America | MJB3 마스크 얼라이너 |
참고문헌
- Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
- Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mec....
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